一種鑒別綿羊肉和山羊肉的方法及其試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速有效的綿羊肉和山羊肉的分子鑒別方法，包括以下步驟：提取待測(cè)樣品基因組DNA；采用上游引物：F5′-TCTCAGCCCAACTCCTGACACCATG-3′，下游引物：R5′-TGGGCAATTTTAAATGAGCAACCTT-3′，以所提取的樣品基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；采用凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。采用本發(fā)明的技術(shù)方案，能夠有效和可靠地鑒別綿羊肉和山羊肉，在食品安全、打擊假冒偽劣產(chǎn)品中具有廣范的應(yīng)用。
【專利說明】一種鑒別綿羊肉和山羊肉的方法及其試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，涉及利用DNA分子標(biāo)記技術(shù)鑒別綿羊肉和山羊肉的方法。
【背景技術(shù)】:
[0002]羊肉通常是綿羊肉和山羊肉的統(tǒng)稱，是我國(guó)傳統(tǒng)的食藥兩用、營(yíng)養(yǎng)豐富的肉類食品，一直以來深受消費(fèi)者的喜愛。綿羊肉和山羊肉都具有蛋白含量高、低脂肪和低膽固醇的特性，但兩者存在較大差異。山羊肉膻味重，膽固醇含量比綿羊肉低；綿羊肉比山羊肉脂肪含量高而口感細(xì)膩，膻味輕；中醫(yī)認(rèn)為，山羊肉屬?zèng)鲂?，綿羊肉屬熱性，適合不同的人群食用。因此，受不同地區(qū)飲食習(xí)慣等因素的影響，消費(fèi)者形成了對(duì)綿羊肉和山羊肉的選擇性消費(fèi)，直接引起綿羊肉和山羊肉的價(jià)格差異。
[0003]近年來，受羊肉消費(fèi)需求急劇上升、飼養(yǎng)成本增加等因素影響，我國(guó)羊肉價(jià)格顯著上漲。特別是市場(chǎng)流通的日益發(fā)達(dá)，羊肉經(jīng)冷凍后再出售已是現(xiàn)代市場(chǎng)營(yíng)銷的主要手段。由于羊肉冷凍后通過感官檢查很難區(qū)分其真假，一些不法商販以價(jià)格低廉的禽肉冒充，損害了消費(fèi)者利益。傳統(tǒng)的感觀檢查和理化檢驗(yàn)方法難以有效完成對(duì)綿羊肉和山羊肉的鑒別，也無法鑒別以禽肉假冒的冷凍羊肉，給當(dāng)前的肉品監(jiān)管工作提出了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。
[0004]PCR全稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction),是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火(復(fù)性)及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期，循環(huán)進(jìn)行，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、省時(shí)等特點(diǎn)。
[0005]凝膠電泳技術(shù)是分離、鑒定、純化DNA分子的常用方法。根據(jù)電泳中所用介質(zhì)的不同，主要有瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳。聚合后的凝膠形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，能夠有效分離不同分子量大小的DNA片斷。瓊脂糖凝膠分離DNA片度大小范圍較廣，不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長(zhǎng)度從200bp至近50kb的DNA片段，采用水平裝置電泳。聚丙烯酰胺分離小片段DNA效果較好，其分辯力極高，甚至相差I(lǐng)bp的DNA片段都能分開，采用垂直裝置電泳。
[0006]在動(dòng)物源類肉品的種屬鑒定方面，采用的遺傳標(biāo)記主要來源于線粒體基因組(常用的包括細(xì)胞色素b基因、12S rRNA基因、16S rRNA基因和控制區(qū)序列)，但未見應(yīng)用基因組遺傳標(biāo)記鑒別綿羊肉和山羊肉的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0007]本發(fā)明的目的是構(gòu)建一種快速有效的綿羊肉和山羊肉的分子鑒別方法。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，擬采用如下技術(shù)方案:
[0008]本發(fā)明一方面涉及一種鑒別綿羊肉和山羊肉的方法，包括以下步驟:提取待測(cè)樣品基因組 DNA ；采用上游引物:F5' -TCTCAGCCCAACTCCTGACACCATG-3'，下游引物:R5' -TGGGCAATTTTAAATGAGCAACCTT-3丨，以所提取的樣品基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；采用凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。[0009]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的提取待測(cè)樣品基因組DNA的方法為苯酹-氯仿法。[0010]在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的凝膠電泳是聚丙烯酰胺凝膠電泳。[0011]在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的凝膠電泳還包括標(biāo)準(zhǔn)樣品的凝膠電泳，所述的標(biāo)準(zhǔn)樣品是綿羊肉和/或山羊肉相應(yīng)基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。[0012]本發(fā)明另一方面還涉及一種試劑盒，其包括上游引物:F5' -TCTCAGCCCAACTCCTGACACCATG-3'，下游引物:R5' -TGGGCAATTTTAAATGAGCAACCTT-3'。[0013]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述試劑盒中任選包括DNA聚合酶，Taq酶。[0014]采用本發(fā)明的技術(shù)方案，能夠有效和可靠地鑒別綿羊肉和山羊肉，在食品安全、打擊假冒偽劣產(chǎn)品中具有廣范的應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說明】:[0015]圖1:新鮮和冷凍肌肉樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的I %瓊脂糖凝膠電泳圖譜。圖中，泳道M為標(biāo)準(zhǔn)分子量參照DL2000，從上至下片斷大小依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和IOObp ;泳道I為新鮮肉用山羊肉，泳道2為新鮮絨山羊肉，泳道3為新鮮奶山羊肉，泳道4為冷凍肉用山羊肉，泳道5為冷凍絨山羊肉，泳道6為冷凍奶山羊肉；泳道7為新鮮肉用綿羊肉，泳道8為新鮮毛用綿羊肉，泳道9為新鮮肉毛兼用綿羊肉，泳道10為冷凍肉用綿羊肉，泳道11為冷凍毛用綿羊肉，泳道12為冷凍肉毛兼用綿羊肉；泳道13為新鮮雞肉，泳道14為新鮮鴨肉，泳道15為新鮮鵝肉，泳道16為冷凍雞肉，泳道17為冷凍鴨肉，泳道18為冷凍鵝肉。[0016]圖2:新鮮羊肉樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的8%聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜。圖中，泳道M為標(biāo)準(zhǔn)分子量參照DL2000，從上至下片斷大小依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp和250bp ；泳道I為新鮮肉用山羊肉，泳道2為新鮮絨山羊肉，泳道3為新鮮奶山羊肉；泳道4為新鮮肉用綿羊肉，泳道5為新鮮毛用綿羊肉，泳道6為新鮮肉毛兼用綿羊肉。[0017]圖3:冷凍羊肉樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的8%聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜。圖中，泳道M為標(biāo)準(zhǔn)分子量參照DL2000，從上至下片斷大小依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp和250bp ；泳道I為冷凍肉用山羊肉，泳道2為冷凍絨山羊肉，泳道3為冷凍奶山羊肉；泳道4為冷凍肉用綿羊肉，泳道5為冷凍毛用綿羊肉，泳道6為冷凍肉毛兼用綿羊肉。[0018]圖4:綿羊和山羊混合DNA樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的8%聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜。圖中，泳道M為標(biāo)準(zhǔn)分子量參照DL2000，從上至下片斷大小依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp和250bp ;泳道I為山羊，泳道2為綿羊，泳道3為綿羊與山羊DNA按1:1混合，泳道4為綿羊與山羊DNA按5:1混合，泳道5為綿羊與山羊DNA按10:1混合，泳道6為綿羊與山羊DNA按15:1混合，泳道7為綿羊與山羊DNA按1:5混合，泳道8為綿羊與山羊DNA按1: 10混合，泳道9為綿羊與山羊DNA按1: 15混合。
【具體實(shí)施方式】:[0019]實(shí)施例1:不同種屬來源肌肉樣品DNA提取、PCR擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)[0020](一 )提取肌肉樣品基因組DNA[0021]采用常規(guī)的苯酚-氯仿法提取新鮮的或者冷凍的肌肉組織樣品基因組DNA。提取方法如下:
[0022]①組織樣品的處理
[0023]采集不同生產(chǎn)類型的綿羊和山羊肌肉樣本，綿羊包括肉用型(杜泊羊)、毛用型(中國(guó)美利奴羊)和肉毛兼用型(小尾寒羊)，山羊包括肉用型(波爾山羊)、絨用型(陜北白絨山羊)和奶用型(薩能奶山羊)。每種類型肌肉樣本分成兩部分，一部分_20°C直接冷凍，另一部分4°C保存。同時(shí)，采集新鮮和冷凍的雞、鴨、鵝肉樣本。切取新鮮的(或冷凍的)肌肉組織約0.5g，除去結(jié)締組織，用預(yù)冷至4°C的生理鹽水清洗；在冰浴中剪碎后，置于玻璃勻漿器，加入約2.0mL組織勻漿液勻漿至無明顯組織塊存在。
[0024]②細(xì)胞裂解
[0025]將勻漿后的組織液轉(zhuǎn)移至5ml離心管中，加入等體積的裂解緩沖液，再加入蛋白酶K溶液至終濃度200 u g/mL,混勻后55°C水浴中緩慢振蕩處理12h。
[0026]③酚/氯仿法抽提
[0027]裂解處理后的混合物中加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)混合液，緩慢旋轉(zhuǎn)搖勻5min后4°C 10000r/min離心IOmin ;用寬口徑吸管謹(jǐn)慎地吸取上層水相，轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加等體積氯仿/異戊醇(24:1),4°C 10000r/min離心lOmin。
[0028]④乙醇沉淀與洗滌`
[0029]用寬口徑吸管小心吸出上層含DNA的水相，轉(zhuǎn)移至離心管中，再向管中加入2.5倍體積的預(yù)冷無水乙醇，上下倒置混勻。12000r/min離心IOmin,棄上清液；75%的預(yù)冷乙醇洗滌一次，12000r/min離心lOmin，棄上清液；用吸頭將管壁殘留的乙醇去除，室溫干燥15min (不要等DNA沉淀完全干燥，否則DNA不易溶解)。
[0030]⑤DNA溶解與保存
[0031]在盛有干燥DNA的離心管中加入適量TE緩沖液(100-200 y L)，4°C溶解。樣品DNA采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度后稀釋至IOOng/y L，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0032]( 二)引物設(shè)計(jì)、PCR擴(kuò)增與檢測(cè)
[0033]根據(jù)綿羊角蛋白基因家族成員KRTAP1-4基因序列(GenBank序列號(hào)XO1610)設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，上游引物為:F5' -TCTCAGCCCAACTCCTGACACCATG-3'，下游引物為:R5' -TGGGCAATTTTAAATGAGCAACCTT-3;。引物由上海生工生物工程有限公司合成。
[0034]以步驟(一)中提取的肌肉樣品基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系總體積為 25 ii 1，包含 10XBuffer2.5u L, MgCl2 (25mmol/L) 2.0 y L，dNTPs (2.5mmol/L)2.0u L, lOpmol/L 上、下游引物各 1.0u L,5U/u L Taq DNA 聚合酶 0.3 y L，IOOng/ u LDNA模板I U L，滅菌超純水15.2u L0擴(kuò)增反應(yīng)的條件為:94°C預(yù)變性3min ；94°C 45s，59 °C 45s，72°C 45s，34個(gè)循環(huán)后72°C延伸8min，4°C保存。
[0035]取2 ii L PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在I %的瓊脂糖凝膠電泳中檢測(cè)有無特異性目標(biāo)產(chǎn)物條帶。
[0036](三)聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定
[0037]取檢測(cè)有特異性目標(biāo)條帶的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物I U L在8%聚丙烯酰胺凝膠上電泳，電泳緩沖液為I X(20V/cm膠長(zhǎng)度)電泳lh。
[0038]從膠板上取下凝膠,放入硝酸銀染色液(染色液含0.2% AgN03、I %冰醋酸和10%無水乙醇，現(xiàn)配現(xiàn)用。)中于搖床上染色20min，然后用蒸餾水漂洗2次，每次持續(xù)15s。
[0039]漂洗后的凝膠放入顯影液(含3%的無水NaOH，每200mL溶液臨用前加ImL甲醛，現(xiàn)配現(xiàn)用)在搖床上顯色約Smin (見到清晰的DNA條帶為止)，顯影后立刻用蒸餾水洗滌2次，每次持續(xù)15s。
[0040]將膠平鋪于燈箱上，凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。根據(jù)條帶泳動(dòng)位置反映出擴(kuò)增產(chǎn)物的分子大小來鑒別肌肉樣品來源，山羊肌肉樣本的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為630bp，綿羊肌肉樣本的擴(kuò)增產(chǎn)物為600bp。在8%聚丙烯酰胺凝膠上，綿羊樣本的擴(kuò)增產(chǎn)物由于比山羊樣本的擴(kuò)增產(chǎn)物小30bp，泳動(dòng)速度明顯快于山羊樣本的擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0041]1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果，電泳圖譜如圖1所示。結(jié)果表明，所有的綿羊和山羊肌肉樣本中都能擴(kuò)增出一條單一明亮的特異性條帶，而所有的雞、鴨、鵝肉樣本都未能擴(kuò)增出條帶。
[0042]實(shí)施例2:綿羊和山羊肌肉樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定[0043]檢測(cè)有特異性目標(biāo)條帶的綿羊和山羊肌肉樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，取I U L在8%聚丙烯酰胺凝膠上電泳，銀染法顯帶，結(jié)果如圖2和圖3所示。
[0044]結(jié)果表明，綿羊和山羊肌肉樣本的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠上表現(xiàn)為綿羊樣本的擴(kuò)增產(chǎn)物泳動(dòng)速度快于山羊樣本的擴(kuò)增產(chǎn)物，說明兩者擴(kuò)增產(chǎn)物的分子大小不同。
[0045]實(shí)施例3:混合羊肉DNA樣本的靈敏度分析
[0046]將綿羊和山羊的DNA樣品按不同質(zhì)量比例混合后進(jìn)行PCR擴(kuò)增和聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定，結(jié)果如圖4所不。
[0047]結(jié)果表明，當(dāng)綿羊與山羊的DNA樣品按1:10、1:5、1:1、5:1和10:1混合時(shí)，能同時(shí)擴(kuò)增出綿羊和山羊的特異性條帶；當(dāng)綿羊與山羊的DNA樣品按1:15和15:1混合時(shí)，只能擴(kuò)增出一種特異性條帶。說明當(dāng)綿羊和山羊DNA混合樣品在10:1至1:10范圍內(nèi)時(shí)，能檢測(cè)到兩種混合樣本；當(dāng)綿羊和山羊DNA混合樣品中任何一種DNA達(dá)到和超過15:1時(shí)，就不能檢測(cè)到另一種DNA樣品的存在。
[0048]實(shí)施例4 =PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序驗(yàn)證
[0049]以綿羊和山羊DNA為模板分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過I %瓊脂糖凝膠電泳分離，在紫外燈下切下目標(biāo)條帶，以凝膠回收試劑盒純化目標(biāo)片段后直接雙向測(cè)序。
[0050]測(cè)序結(jié)果表明，綿羊和山羊樣本的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小不同，綿羊的擴(kuò)增產(chǎn)物為600bp (圖5)，山羊的擴(kuò)增產(chǎn)物為630bp (圖6)，與凝膠電泳分離的結(jié)果相一致，驗(yàn)證了應(yīng)用本專利申請(qǐng)方法鑒別綿羊肉和山羊肉的有效性和可靠性。
[0051]應(yīng)當(dāng)理解的是，上述【具體實(shí)施方式】?jī)H是例舉性說明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進(jìn)或變換，而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種鑒別綿羊肉和山羊肉的方法，包括以下步驟: 提取待測(cè)樣品基因組DNA ； 采用上游引物:F5' -TCTCAGCCCAACTCCTGACACCATG-3'，下游引物:R5' -TGGGCAATTTTAAATGAGCAACCTT-3!，以所提取的樣品基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 采用凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述的提取待測(cè)樣品基因組DNA的方法為苯酚-氯仿法。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述的凝膠電泳是聚丙烯酰胺凝膠電泳。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述的凝膠電泳還包括標(biāo)準(zhǔn)樣品的凝膠電泳，所述的標(biāo)準(zhǔn)樣品是綿羊肉和/或山羊肉相應(yīng)基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
5.一種試劑盒，其包括上游引物:F5, -TCTCAGCCCAACTCCTGACACCATG-3'，下游引物:R5' -TGGGCAATTTTAAATGAGCAACCTT-3'。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，所述試劑盒中任選包括DNA聚合酶，Taq酶。
7.權(quán)利要求5或6 所述的試劑盒在鑒別綿羊肉和山羊肉中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103614467SQ201310576876
【公開日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2013年11月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月9日
【發(fā)明者】王蘭萍, 耿榮慶 申請(qǐng)人:王蘭萍