通過單核苷酸多態(tài)性標記預測田間褐飛虱繁殖力的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種通過單核苷酸多態(tài)性標記預測田間褐飛虱繁殖力的方法，其步驟如下：（1）采集褐飛虱雌蟲，抽提單頭基因組DNA；（2）以上述DNA為模板，用引物分別擴增含ACE-862、VGR-816和VG3087三個SNP的片段；（3）將PCR產(chǎn)物進行測序，獲得每只雌蟲的三個SNP的基因型；（4）將上述獲得的SNP信息代入預測模型，算出單頭褐飛虱的繁殖力。利用本發(fā)明的方法，能夠快速準確預測褐飛虱種群的繁殖力，節(jié)省人力物力，縮短實驗周期。
【專利說明】通過單核苷酸多態(tài)性標記預測田間褐飛虱繁殖力的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種預測田間褐飛虱繁殖力的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻是我國乃至全世界最重要的糧食作物，其產(chǎn)量直接關(guān)系到糧食安全。褐飛虱(Nilaparvata Iugens)是水稻的重要害蟲，適應性強，致害性變異大，其長翅型具有長距離的遷飛能力，已有報導歷史上曾多次暴發(fā)成災，造成了巨大的經(jīng)濟損失，糧食安全也受到威脅(程遐年等，2003)。褐飛虱種群數(shù)量的預測包括長中期預測和短期預測。長中期預測主要是利用歷年田間蟲情數(shù)據(jù)、馬爾可夫鏈理論和氣象資料等進行分析。種群數(shù)量的短期預測主要是根據(jù)遷入蟲量、存活率和增殖倍數(shù)等來進行。然后，由于褐飛虱本身的遺傳差異也能影響繁殖力，這些預測模型存在著局限性。已有研究表明，個體之間的遺傳差異可導致其繁殖力有顯著區(qū)別，例如，抗吡蟲啉(殺蟲劑)的褐飛虱的種群增長趨勢指數(shù)只有對殺蟲劑敏感的褐飛虱的約10%。短翅型雌蟲繁殖力比長翅型要高。因此，如何有效地預測預報褐飛虱，從而實現(xiàn)有效控制，有著重要的現(xiàn)實意義。
[0003]種群調(diào)節(jié)的機制是種群生態(tài)學的核心。主要有內(nèi)源性和外源性調(diào)節(jié)假說。迄今對昆蟲種群動態(tài)的研究主要集中在外源性調(diào)節(jié)因子的作用，如天敵、殺蟲劑、宿主植物和溫度等，對內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子對種群動態(tài)的影響，尤其是昆蟲本身的遺傳調(diào)節(jié)的研究很少。
[0004]為了研究種群動態(tài)調(diào)節(jié)和害蟲防控，首要的是研究昆蟲種群繁殖力調(diào)節(jié)的分子機制。已經(jīng)有很多學者在通路和基因水平對昆蟲繁殖力進行研究(Kirschbauml985;Thomaset al.2000;Fu et al.2010;Tan et al.2013)。另外，隨著研究的深入，分子標記，包括限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、線粒體DNA(mtDNA)、擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)、微衛(wèi)星和簡單序列重復區(qū)間(ISSR)，也被用于昆蟲自然篩選、種群動態(tài)和繁殖力方面的研究。作為新一代的分子標記，單核苷酸多`態(tài)性(SNP)也在生態(tài)學中得到廣泛應用。但是，至今還沒有通過SNP預測昆蟲種群繁殖力的研究報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對以上要解決的技術(shù)問題，提供一種能夠有效預測田間褐飛虱繁殖力的方法。
[0006]本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
[0007]—種通過單核苷酸多態(tài)性標記預測田間褐飛虱繁殖力的方法，其步驟如下:
[0008](I)采集褐飛虱雌蟲，抽提單頭基因組DNA ;
[0009](2)以上述DNA為模板，用引物分別擴增含ACE-862、VGR-816和VG3087三個SNP的片段；
[0010](3)將PCR產(chǎn)物進行測序，獲得每只雌蟲的三個SNP的基因型；
[0011](4)將上述獲得的SNP信息代入以下預測模型，算出單頭褐飛虱的繁殖力，全部蟲子的平均繁殖力即為該種群的繁殖力:[0012]Y=212.735-93.585*ACE_862+36.087*VGR_816+48.276*VG3087
[0013]其中，因變量Y是單頭褐飛虱繁殖力，自變量ACE-862、VGR-816和VG3087分別是位于ACE、VgR和Vg基因上的SNP的加性、顯性或隱性效應的賦值；ACE-862的三種基因型CC、CA和AA分別取值0、0、1 ；VgR-816的三種基因型AA、AG和GG分別取值0、1、2 ；VgR3087的兩種基因型GG和GA分別取值O、I。
[0014]根據(jù)本發(fā)明的方法，所述步驟(2)中，所用的引物為:
[0015]ACE-862-F514:5’ -CGCTATCTGCTTTGTTGAATG-3’ ；
[0016]ACE-862-R985:5’ -CACCGAATGAACCACCCTC-3’ ；
[0017]VGR-816-F565:5’ -TCACCACAATTCTGCCTCC-3’ ；
[0018]VGR-816-R1173:5’ -CAGCCTGAAATTCGGAAAG-3，；
[0019]VG3087-F188:5’ -CGCTCACATCGACAAACTAT-3’ ；
[0020]VG3087-R774:5’ -TACAATGCCTCACAATCCC-3，。
[0021]本發(fā)明的有益效果:在常規(guī)的生物測定褐飛虱種群繁殖力的方法中，通常需要20-30天的時間，而且需要占用比較大的實驗場地，消耗大量的人力物力，而且最后知道繁殖力后，第二代的褐飛虱已經(jīng)大量繁殖蔓延，給防治帶來很大困難。利用本發(fā)明的方法，從田間采集樣本后，通過 一天時間就可以獲得這些樣品的SNP信息，并快速算出褐飛虱種群的繁殖力，從而大大節(jié)省了人力物力，縮短實驗周期，也為后續(xù)有效地褐飛虱防治，如指導農(nóng)藥的使用量，提供了現(xiàn)實的依據(jù)。
【具體實施方式】
[0022]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的方法作進一步的詳述，以更好地理解本發(fā)明。
[0023]一、采集褐飛虱雌蟲，抽提單頭基因組DNA。
[0024]從田間采集30頭以上褐飛虱雌蟲(剛遷飛到田里)，進行單頭基因組DNA的抽提。抽提DNA以Genomic DNA Isolation Kit (OMEGA, USA)試劑盒為例。抽提步驟如下:
[0025]1.取蟲子在液氮中研磨充分，+500ul Buffer GTC/2-Me ；
[0026]2.劇烈渦旋15s (細胞裂解的越充分，釋放出來的核酸就越多)，室溫靜置2_3min，最長可以延長到5min ；
[0027]3.13, OOOxg 離心 5min ；
[0028]4.轉(zhuǎn)移上清液至HiBind? DNA Column 中，13，OOOxg 離心 Imin ;
[0029]5.將步驟 4 中的HiBind? DNA Column 套在 2ml 收集管中，加 500ul Buffer HB 到柱子中，13, OOOxg離心Imin ;棄濾液；
[0030]6.加 700ul DNA Wash buffer (稀釋后)到柱子中，13，OOOxg 離心 lmin，棄濾液;
[0031]7.將柱子套回收集管，12，OOOxg離心2min，干燥柱子；
[0032]8.將柱子轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管,加50-100 μ I Elution Buffer (可以二次洗脫，一次加 20-30 μ I, Elution buffer 可以預熱至 55-65 度)，室溫放置 2min, 13, OOOxg 離心 lmin。
[0033]二、PCR 擴增
[0034]以上述的DNA為模板，用三對引物分別擴增含三個SNP的片段，引物分別為
[0035]ACE-862-F514:5’ -CGCTATCTGCTTTGTTGAATG-3’ ；[0036]ACE-862-R985:5’ -CACCGAATGAACCACCCTC-3’ ；
[0037]VGR-816-F565:5， -TCACCACAATTCTGCCTCC-3，；
[0038]VGR-816-R1173:5’ -CAGCCTGAAATTCGGAAAG-3，；
[0039]VG3087-F188:5’ -CGCTCACATCGACAAACTAT-3，；
[0040]VG3087-R774:5’ -TACAATGCCTCACAATCCC-3，。
[0041]在0.2mlPCR離心管中加入下列試劑:
[0042]
【權(quán)利要求】
1.一種通過單核苷酸多態(tài)性標記預測田間褐飛虱繁殖力的方法，其步驟如下: (1)采集褐飛虱雌蟲，抽提單頭基因組DNA； (2)以上述DNA為模板，用引物分別擴增含ACE-862、VGR-816和VG3087三個SNP的片段； (3)將PCR產(chǎn)物進行測序，獲得每只雌蟲的三個SNP的基因型； (4)將上述獲得的SNP信息代入以下預測模型，算出單頭褐飛虱的繁殖力，全部蟲子的平均繁殖力即為該種群的繁殖力:
Y=212.735-93.585*ACE_862+36.087*VGR-816+48.276*VG3087其中，因變量Y是單頭褐飛虱繁殖力，自變量ACE-862、VGR-816和VG3087分別是位于ACE、VgR和Vg基因上的SNP的加性、顯性或隱性效應的賦值；ACE-862的三種基因型CC、CA和AA分別取值0、0、1 ；VgR-816的三種基因型AA、AG和GG分別取值0、1、2 ；VgR3087的兩種基因型GG和GA分別取值O、I。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中所用的引物為: ACE-862-F514:5’ -CGCTATCTGCTTTGTTGAATG-3’ ；
ACE-862-R985:5’ -CACCGAATGAACCACCCTC-3’ ；
VGR-816-F565:5’ -TCACCACAATTCTGCCTCC-3’ ；
VGR-816-R1173:5’ -CAGCCTGAAATTCGGAAAG-3’ ；
VG3087-F188:5’ -CGCTCACATCGACAAACTAT-3’ ；
VG3087-R774:5’ -TACAATGCCTCACAATCCC-3’。
【文檔編號】C12Q1/68GK103602741SQ201310586677
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月20日
【發(fā)明者】張文慶, 孫仲享, 翟一凡, 張鑒清, 康奎, 邱潔琪, 沈嘉煒 申請人:中山大學