一種棉花GhHSFA7基因編碼序列及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種在棉花(Gossypium?spp.)中表達的GhHSFA7轉錄因子的核苷酸序列及蛋白多肽。該棉花GhHSFA7核苷酸序列與SEQ?ID?NO.3中從第1-1794位DNA分子的核苷酸序列至少有70%的同源性。該棉花GhHSFA7蛋白多肽，包括具有SEQ?ID?NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。通過本發(fā)明獲得增強植物抗逆性的方法，將編碼具有棉花GhHSFA7基因的核苷酸序列轉化入植物，可以提高植物的抗逆性，尤其是耐鹽性，有助于擴大植物尤其是棉花的種植范圍，并可用于鹽堿土地的開發(fā)。
【專利說明】—種棉花GhHSFA7基因編碼序列及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學、酶學、生理學以及基因工程等領域。具體地，本發(fā)明涉及一種在棉花中表達的GhHSFA7轉錄因子蛋白及其核苷酸序列。本發(fā)明還涉及該蛋白和核酸序列的制備方法和用途。
【背景技術】
[0002]棉花是重要的經濟作物，我國常年棉花種植面積在7500萬畝左右。2005年我國紡織服裝業(yè)出口額大約1150億美元，進口棉花257萬噸。按照當前我國棉花需求趨勢與供給能力分析，今后相當長的時期我國每年將有1/3的棉花需要依賴進口，棉花保障供給的壓力日益加重。在當前確保糧食安全的情況下，糧棉爭地矛盾比較突出。因此，穩(wěn)定和增加棉花生產的面積必須充分利用現(xiàn)有耕地資源。土壤鹽潰化對植物生長發(fā)育產生嚴重的影響，是影響農業(yè)生產與生態(tài)環(huán)境的一個重要因素。我國農業(yè)生產常年受旱面積達200-270萬公頃，鹽堿化耕地面積約763萬公頃(李志杰等，2005)。因此，提高棉花的抗逆性特別是棉花的耐鹽能力對于擴大棉花的種植范圍、開發(fā)鹽堿土地的具有十分重要的意義。
[0003]轉錄因子(transcription factor)是指能夠與真核基因的順式作用元件發(fā)生特異性相互作用并對轉錄有激活或抑制作用的DNA結合蛋白，轉錄因子調控復雜的蛋白間的互作網(wǎng)絡。現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn):MYB、WRKY、bZIP、AP2/EREBP等轉錄因子廣泛參與植物抗旱、耐鹽等非生物逆境的調控，但有關HSF轉錄因子參與植物耐鹽等非生物逆境的研究甚少。
[0004]HSF (heat shock transcription factor)是一種具有轉錄調節(jié)活性的轉錄因子，在許多逆境條件下都可能被激活，例如植物在高溫、鹽害、氧化脅迫以及病原菌感染等情況下能夠增強表達。激活后的HSF介導熱激基因的表達調控，進而控制熱激蛋白的表達量，以達到抵御逆境的目的，從而維持植物體內的穩(wěn)定性，使植物可以進行正常的生長發(fā)育過程。
[0005]自1990年從酵母中分離獲得第一個HSF基因以來，目前已經從多種單子葉和雙子葉植物中克隆到了相應的HSF基因，但是棉花中的HSF基因少有人研究，特別是HSF在參與提高植物耐鹽能力的方面少有報道。
[0006]本發(fā)明中，我們從棉花(Gossypium spp.)中克隆到轉錄因子GhHSFA7基因，并對其表達譜進行了分析，通過轉基因手段證明該基因具有提高植物耐鹽的能力。
[0007]在本發(fā)明被公布之前，尚未有任何公開或報道過本專利申請中提及的棉花GhHSFA7蛋白序列及其核酸序列。

【發(fā)明內容】

[0008]本發(fā)明的第一目的就是提供一種新的棉花轉錄因子基因，該基因是棉花GhHSFA7基因。
[0009]本發(fā)明的第二目的是提供一種新的棉花蛋白GhHSFA7。
[0010]本發(fā)明的第三目的是提供一種利用重組技術表達上述的新的棉花GhHSFA7蛋白和核酸序列的方法。[0011]本發(fā)明還提供了這種棉花GhHSFA7蛋白多肽和編碼序列在利用轉基因技術增加植物抗逆性的應用。
[0012]在本發(fā)明的一個方面，提供了一種分離出的DNA分子，該分子包括:編碼具有棉花GhHSFA7蛋白質活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID N0.3中從第1-1794位DNA分子的核苷酸序列至少有70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴謹條件下與SEQ ID N0.3中從核苷酸第1-1794位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼具有SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID N0.3中從核苷酸第1-1794位的核苷酸序列。
[0013]在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離出的棉花GhHSFA7蛋白質多肽，它包括:具有SEQ ID N0.4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID N0.4序列的多肽。
[0014]在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種載體，它包含上述的DNA分子。
[0015]在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種用上述載體轉化的宿主細胞。在實例中該宿主細胞是棉花細胞。
[0016]在本發(fā)明的另一個方面，還提供了一種產生具有棉花GhHSFA7蛋白質活性的多肽的方法，其步驟如下:
[0017](I)將編碼具有棉花GhHSFA7基因的核苷酸序列可操作的連于表達調控序列，形成棉花GhHSFA7基因表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID N0.3中從核苷酸第1-1794位的核苷酸序列有至少70%的同源性；
[0018](2)將步驟(1)中的表達載體轉入原核宿主細胞，形成棉花GhHSFA7基因的重組細胞；
[0019](3)在適合表達棉花GhHSFA7多肽的條件下，培養(yǎng)步驟⑵中的重組細胞；
[0020](4)分離出具有棉花GhHSFA7蛋白活性的多肽。
[0021]較佳地，在該方法中使用的核酸序列具有SEQ ID N0.3中第1-1794位的序列。
[0022]在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種利用轉基因技術將編碼具有棉花GhHSFA7基因的核苷酸序列轉化入擬南芥以提高植物抗逆性，其步驟如下:
[0023](I)將編碼具有棉花GhHSFA7核苷酸的序列可操作的連于植物表達調控序列，形成含棉花GhHSFA7基因的植物表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID N0.3中從核苷酸第1-1794位的核苷酸序列有至少70%的同源性；
[0024](2)將步驟(1)中的表達載體轉入農桿菌，將含有表達載體的農桿菌同真核宿主細胞共培養(yǎng)，在28°C條件下，暗培養(yǎng)1-2天后，通過篩選獲得含有棉花GhHSFA7基因的轉基因擬南芥植株及后代。棉花GhHSFA7基因具有增加轉基因擬南芥植株耐鹽性的作用。
[0025]較佳地，在該方法中使用的核酸序列具有SEQ ID N0.3中第1-1794位的序列。
[0026]在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經與在細胞中伴隨的蛋白質分開。
[0027]在本發(fā)明中，術語“棉花GhHSFA7蛋白質的編碼序列”指編碼具有棉花GhHSFA7蛋白活性多肽序列，如SEQ ID N0.3中第1-1794位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID N0.3序列編碼框的第1-1794位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID N0.3中第1-1794位核苷酸序列同源性低至約70%的簡并也能編碼出SEQ ID N0.4所述的序列。該術語還包括能在中度嚴謹條件下，更佳的在高度嚴謹條件下與SEQ ID N0.3中從核苷酸第1-1794位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術語還包括與SEQ ID N0.3中從核苷酸第1-1794位的核苷酸序列的同源性至少70%。較佳地至少80%，更佳地至少90%，最佳的至少95%的核苷酸序列。
[0028]該術語還包括編碼具有與天然的棉花GhHSFA7基因相同功能的SEQ ID N0.3中開放讀碼框序列的變異形式，這些變異形式(但并不限于):若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3 ’端添加數(shù)個(通常為60個以內，較佳地為30個以內，更佳地為10個以內，最佳地為5個以內)核苷酸。
[0029]本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質或多肽是指其至少占樣品總物質的至少20%，較佳地至少50%，更佳地至少80%，最佳地至少90% (按干重或濕重計)。純度可以用任何合適的方法進行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度?；炯兊亩嚯幕旧喜缓烊粻顟B(tài)下的伴隨其的組分。
[0030]本發(fā)明中，術語“棉花GhHSFA7蛋白或多肽”指具有棉花GhHSFA7蛋白活性的SEQID N0.4序列的多肽。該術語還包括具有與天然棉花GhHSFA7相同功能的SEQ ID N0.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于):若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又t匕如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括棉花GhHSFA7蛋 白的活性片段和活性衍生物。
[0031]本發(fā)明的棉花GhHSFA7多肽的變異形式包括:同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴謹條件下能與棉花GhHSFA7基因的DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗棉花GhHSFA7多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括棉花GhHSFA7多肽的可溶性片段。通常，該片段具有棉花GhHSFA7多肽序列的至少約10個連續(xù)的氨基酸，通常至少約30個連續(xù)的氨基酸，較佳的約50個連續(xù)的氨基酸，更佳的至少約80個連續(xù)的氨基酸，最佳的至少約100個連續(xù)氨基酸。
[0032]本發(fā)明中，“棉花GhHSFA7保守性變異多肽”指與SEQ ID N0.4的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳的至多8個，更佳的至多5個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行替換而產生。
[0033]表1
[0034]
最初的殘基 I代表性的取代I優(yōu)選的取代
Ala(A)Val; Leu; HeVal
Arg(R)Lys;Gin;AsnLys
【權利要求】
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括:編碼棉花GhHSFA7轉錄因子蛋白的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID N0.3中從核苷酸第1-1794位的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴謹條件下與SEQ ID N0.3中從核苷酸第1-1794位的核苷酸序列雜交。
2.如權利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼具有SEQID N0.4所示的氨基酸序列的多肽。
3.如權利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQID N0.3中從核苷酸第1-1794位的核苷酸序列。
4.如權利要求1-3中任一項所述的DNA分子，在增強植物抗逆性方面的應用。
5.一種分離出的棉花GhHSFA7轉錄因子蛋白多肽，其特征在于，它包括:具有SEQ IDN0.4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
6.如權利要求5所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQID N0.4序列的多肽。
7.如權利要求5或6中的多肽，在增強植物抗逆性方面的應用。
8.一種利用轉基因技術將編碼棉花GhHSFA7蛋白活性多肽的核苷酸序列轉化入植物以增加植物抗逆性的方法，其步驟如下: (1)將編碼具有棉花GhHSFA7蛋白活性的多肽的純化的核苷酸序列可操作地連于植物表達調控序列，形成編碼含棉花GhHSFA7蛋白序列的植物表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID N0.3中從核苷酸第1-1794位的核苷酸序列有至少70%的同源性； (2)將步驟(1)中的表達載體轉入植物細胞； (3)通過篩選，獲得轉基因植株及其后代，包括植物種子。
【文檔編號】C12N15/84GK103834666SQ201310642386
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2013年12月3日 優(yōu)先權日:2013年12月3日
【發(fā)明者】左開井, 孫娜 申請人:上海交通大學