一種細(xì)菌漆酶突變體蛋白、其重組表達(dá)質(zhì)粒、轉(zhuǎn)化的工程菌株及其發(fā)酵制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種細(xì)菌漆酶突變體蛋白，其特征在于，該突變體蛋白氨基酸序列由SEQ?ID?No.1所示的細(xì)菌漆酶氨基酸序列第323位甘氨酸至332位甘氨酸進(jìn)行缺失突變獲得。本發(fā)明通過基因工程改造方法獲得穩(wěn)定性提高的細(xì)菌漆酶蛋白編碼基因、其表達(dá)質(zhì)粒及工程菌，并可在將工程菌大規(guī)模發(fā)酵及誘導(dǎo)表達(dá)后，獲得穩(wěn)定性提高的細(xì)菌漆酶蛋白。本發(fā)明以海洋未培養(yǎng)微生物來源的細(xì)菌漆酶Lac15為基礎(chǔ)，通過基因工程改造，獲得突變基因；同時(shí)利用重組大腸桿菌進(jìn)行高密度培養(yǎng)的方法，高效表達(dá)細(xì)菌漆酶突變體蛋白。本發(fā)明大幅提高了細(xì)菌漆酶的穩(wěn)定性和產(chǎn)量。
【專利說明】一種細(xì)菌漆酶突變體蛋白、其重組表達(dá)質(zhì)粒、轉(zhuǎn)化的工程菌 株及其發(fā)酵制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及通過定向改造方法構(gòu)建的穩(wěn)定性提高的細(xì)菌漆酶突變體蛋白，及其在 重組大腸桿菌中的高密度培養(yǎng)生產(chǎn)方法，屬于酶的基因工程技術(shù)和發(fā)酵工程【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 漆酶（Laccase，EC 1. 10. 3. 2)是一種含銅的多酚氧化酶，具有廣泛的底物作用范 圍，能催化氧化多種酚類和非酚類化合物，在木質(zhì)素類物質(zhì)降解、酚類物質(zhì)（如苯氧基類除 草劑等）毒性去除、新型化合物合成等方面發(fā)揮重要作用。漆酶廣泛存在于真菌和細(xì)菌中。 真菌漆酶可在酸性或中性偏酸性條件下發(fā)揮活性，部分真菌漆酶已應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)當(dāng)中。 與真菌漆酶相比，細(xì)菌漆酶可在堿性條件下發(fā)揮催化活性，部分細(xì)菌漆酶還具有真菌漆酶 不具有的生物活性，如高鹵族離子耐受活性等，可應(yīng)用于真菌漆酶無法應(yīng)用的現(xiàn)代生物技 術(shù)產(chǎn)業(yè)。因此，細(xì)菌漆酶可作為真菌漆酶的重要補(bǔ)充，拓展漆酶的工業(yè)應(yīng)用范圍。
[0003] 細(xì)菌漆酶研究目前主要集中于新酶的發(fā)現(xiàn)和酶學(xué)性質(zhì)分析。已有研究表明，部分 細(xì)菌漆酶具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。然而，現(xiàn)有細(xì)菌漆酶性質(zhì)不能滿足現(xiàn)代工業(yè)生物技術(shù)對(duì)細(xì)菌 漆酶的系列要求，如同時(shí)具有溫度穩(wěn)定性和氯離子耐受性等，從而阻礙了細(xì)菌漆酶的工業(yè) 化應(yīng)用進(jìn)程。分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，為酶蛋白的定向改造提供了途徑。現(xiàn)有證據(jù)表明，通 過分子生物學(xué)技術(shù)手段，結(jié)合生物信息學(xué)相關(guān)理論，對(duì)候選細(xì)菌漆酶進(jìn)行定向改造，改良細(xì) 菌漆酶性質(zhì)，具有完全的可行性。
[0004] 大腸桿菌由于其遺傳學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等方面已充分被人們了解而成為 表達(dá)異源蛋白的首選表達(dá)系統(tǒng)。大腸桿菌容易培養(yǎng)且費(fèi)用低、對(duì)多種蛋白具有良好的耐受 能力、能高水平的表達(dá)異源蛋白；同時(shí)，大腸桿菌可進(jìn)行高密度發(fā)酵，可進(jìn)一步降低生產(chǎn)成 本。因此，利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)近年在生物藥物制備、酶制劑生產(chǎn)等方面被廣泛采用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的首要目的在于提供一種運(yùn)用定向改造方法獲得的穩(wěn)定性提高的細(xì)菌漆 酶突變體蛋白的氨基酸序列，該序列由SEQ ID No. 1所示的細(xì)菌漆酶的氨基酸序列第323 位甘氨酸至332位甘氨酸進(jìn)行缺失突變后獲得。
[0006] 本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種上述細(xì)菌漆酶突變體蛋白的DNA編碼序列及 含有該DNA序列的一種表達(dá)質(zhì)粒。
[0007] 本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種轉(zhuǎn)化有上述重組表達(dá)質(zhì)粒的生產(chǎn)菌株，該菌株 具有細(xì)菌漆酶突變體蛋白合成性能。
[0008] 本發(fā)明的第四個(gè)目的在于提供一種高密度培養(yǎng)發(fā)酵制備上述細(xì)菌漆酶突變體蛋 白的方法。
[0009] 本發(fā)明中的一種細(xì)菌漆酶突變體，所述突變體的蛋白氨基酸序列還可以包括序列 中的無義突變或同義突變的組合。
[0010] 本發(fā)明具體技術(shù)方案如下：
[0011] 對(duì)細(xì)菌漆酶Lacl5(GenBank Accession No. ADM87301)講行牛物信息學(xué)分析 和穩(wěn)定性試驗(yàn)，確定氨基酸序列323GAMSRRMMQG332為柔性可變區(qū)域，野生型蛋白長(zhǎng)時(shí) 間保存過程中，該區(qū)域氨基酸出現(xiàn)斷裂，并引發(fā)蛋白降解。因此，本發(fā)明的主要技術(shù)方 案圍繞氨基酸序列柔性可變區(qū)域進(jìn)行缺失突變，進(jìn)而以Escherichia coli BL21(DE3)/ pET22b (+)-lacl5 (Del)為出發(fā)菌株，以指數(shù)補(bǔ)料和恒速補(bǔ)料相結(jié)合的方式，對(duì)重組大腸桿 菌進(jìn)行高密度發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌漆酶突變體蛋白Lacl5 (Del)。
[0012] 具體操作步驟如下：
[0013] 1.以細(xì)菌漆酶 Lacl5 (GenBank Accession No. ADM87301)為模板，選擇第 323 位到 332位的10個(gè)氨基酸（323GAMSRRMMQG332)，利用PCR方法進(jìn)行缺失突變，并將該突變體基 因連接到表達(dá)載體pET22b(+)中，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET22b(+)-lacl5(Del)并轉(zhuǎn)化進(jìn)入工程菌 Escherichia coli BL21(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。
[0014] 以 Escherichia coli BL21(DE3)/pET22b(+)-lacl5 (Del)為出發(fā)菌株，進(jìn)行高密 度培養(yǎng)生產(chǎn)細(xì)菌漆酶突變體蛋白Lacl5 (Del)，發(fā)酵初始培養(yǎng)基為改良后的TB培養(yǎng)基，其中 初始甘油濃度為15_20g · Γ1，接種量為5-7%，維持發(fā)酵罐內(nèi)溫度為26-32°C，較優(yōu)水平為 28-30°C。待甘油耗盡發(fā)酵液溶氧D0上升幅度超過30 %時(shí)，約為接種后8-12小時(shí)，開始 進(jìn)行指數(shù)方法流加補(bǔ)料培養(yǎng)基。按照如下公式計(jì)算補(bǔ)料流加速率：F(t) = (μ^ΧΛ/YmSp) θχρ(μ srtt)。其中，F(xiàn)(t):補(bǔ)料流加速率，單位L · IT1 :流加補(bǔ)料時(shí)的初始生物量，單位： g · L1 ;VQ :發(fā)酵液初始體積，單位：L ;SF :補(bǔ)料中甘油濃度，單位：g · Γ1 ; μ set :比生長(zhǎng)速率為 〇. l-o. ar1 ;YX/S :細(xì)胞對(duì)底物的得率系數(shù)，單位：g 71 ;t :補(bǔ)料開始時(shí)間，單位：h。當(dāng)發(fā)酵液 菌體干重達(dá)到17-26g · Γ1，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)（終濃度為0· 05-0. 2mM)，以6 - 18mL · h-1 的速率流加補(bǔ)料培養(yǎng)基直至發(fā)酵結(jié)束（誘導(dǎo)8-12h結(jié)束）。整個(gè)發(fā)酵過程用25% (v/v)氨 水控制在6. 5-7. 5,較優(yōu)水平為7. 0-7. 3,并調(diào)節(jié)通氣量和攪拌速度將D0控制在20-60%，較 優(yōu)水平為35-40%。
[0015] 2.細(xì)菌漆酶酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定方法：
[0016] 酶活測(cè)定：使用漆酶底物2, 6-DMP (2, 6-二甲基苯酚）檢測(cè)細(xì)菌漆酶Lac 15及其突 變體活性，反應(yīng)體系為 50mM Na2HP04-KH2P04(pH7. 5)、0. ImM CuS04 和 0. ImM 的 2, 6-DMP。在 反應(yīng)體系中加入適量稀釋的酶液后置于45°C反應(yīng)5min，立即冰浴30s，用MV-7200型紫外分 光光度計(jì)測(cè)定477nm的吸收值。2, 6-DMP在477nm處的消光系數(shù)為4. 96X lOf1 cnT1，酶活 力定義為在一定條件下每分鐘氧化1 μ mol底物為1個(gè)酶活力單位。
[0017] 本發(fā)明大幅提高了細(xì)菌漆酶的穩(wěn)定性、可溶性誘導(dǎo)表達(dá)溫度和產(chǎn)量，有利于大規(guī) 模工業(yè)化生產(chǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1. SDS-PAGE電泳圖譜檢測(cè)純化后的野生型細(xì)菌漆酶Lacl5與突變體 Lacl5(Del)在28°C保存時(shí)的降解情況。1-2 :野生型、突變體在28°C放置0時(shí)刻的降解情 況；3-4 :野生型、突變體在28°C放置4天的降解情況；5-6 :野生型、突變體在28°C放置7 天的降解情況；7-8 :野生型、突變體在28°C放置15天的降解情況；9-10 :野生型、突變體在 28 °C放置22天的降解情況。
[0019] 圖 2.以 Escherichia coli BL21(DE3)/pET22b (+)-lacl5 (Del)為出發(fā)菌株進(jìn)行 高密度發(fā)酵，發(fā)酵過程中生物量（DCW g/L)及細(xì)菌漆酶突變體酶活（U/L)變化。

【具體實(shí)施方式】：
[0020] 實(shí)施例中涉及到的培養(yǎng)基配方如下：
[0021] LB液體培養(yǎng)基：酵母粉5g · ΙΛ胰蛋白胨10g · ΙΛ NaCl 10g · ΙΛ使用時(shí)添加氨 節(jié)青霉素至終濃度l〇〇ug · mL'
[0022] 改良TB培養(yǎng)基：甘油15_20g · ΙΛ酵母粉20_26g · ΙΛ胰蛋白胨10_12g · ΙΛ KH2P0417mM，K2HP0472mM，使用時(shí)添加氨芐青霉素 100ug · ml/1 ;
[0023] LB固體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基添加1.5 %瓊脂，使用時(shí)添加氨芐青霉素 lOOug · πιΤΓ1 ；
[0024] 補(bǔ)料培養(yǎng)基：甘油450_500g ·ΙΛ酵母粉40_50g ·ΙΛ胰蛋白胨40_50g ·ΙΛ使用 時(shí)添加氨節(jié)青霉素 lOOug · mL'
[0025] 實(shí)施例1、利用PCR方法講行缺失突奪體DNA編碼序列的構(gòu)律
[0026] 選擇包含斷裂位點(diǎn)氨基酸332位甘氨酸在內(nèi)往蛋白序列上游共10個(gè)氨基酸 (323GAMSRRMMQG332)進(jìn)行定點(diǎn)缺失。引物設(shè)計(jì)如下：
[0027]

【權(quán)利要求】
1. 一種細(xì)菌漆酶突變體蛋白，其特征在于，該突變體蛋白氨基酸序列由SEQ ID No. 1所 示的細(xì)菌漆酶氨基酸序列第323位甘氨酸至332位甘氨酸進(jìn)行缺失突變獲得。
2. 編碼權(quán)利要求1所述的一種細(xì)菌漆酶突變體蛋白的DNA，所述DNA序列如SEQ ID No. 2所示。
3. -種細(xì)菌漆酶突變體蛋白表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于，含有權(quán)利要求2所述的細(xì)菌漆酶 突變體蛋白的DNA序列。
4. 一種具有細(xì)菌漆酶突變體蛋白合成性能的工程菌，其特征在于，含有權(quán)利要求3所 述的表達(dá)質(zhì)粒。
5. -種細(xì)菌漆酶突變體蛋白，其特征在于，由權(quán)利要求4所述的工程菌發(fā)酵獲得。
6. -種利用重組大腸桿菌高密度培養(yǎng)生產(chǎn)細(xì)菌漆酶突變體蛋白的方法：其特征在于， 以權(quán)利要求4所述工程菌為出發(fā)菌株，以改良的TB培養(yǎng)基為初始發(fā)酵培養(yǎng)基，初始接種量 為5-7%。培養(yǎng)過程中，當(dāng)培養(yǎng)基中甘油耗盡、發(fā)酵液溶氧DO上升幅度超過30%時(shí)，按照如下 計(jì)算公式速率流加補(bǔ)料培養(yǎng)基： F (t) = ( y SetX〇V〇/Yx/sSF) exp ( μ sett)； 其中，F(xiàn) (t):補(bǔ)料流加速率，單位：L · IT1 :流加補(bǔ)料時(shí)的初始生物量，單位：g · Γ1 ; :發(fā)酵液初始體積，單位：L ;SF :補(bǔ)料中甘油濃度，單位：g · Γ1 ; μ set :比生長(zhǎng)速率為 0.1-0. ar1 ;YX/S :細(xì)胞對(duì)底物的得率系數(shù)，單位：g · g4;t:補(bǔ)料開始時(shí)間，單位：h; 當(dāng)菌體干重達(dá)到17-26g · L-1，加入終濃度為0. 05-0. 2mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，以 6-18mL · 1Γ1的速率恒速流加補(bǔ)料培養(yǎng)基，誘導(dǎo)8-10h后結(jié)束。
7. 按照權(quán)利要求6所述方法，其特征在于，所述發(fā)酵溫度為28-30°C ;所述發(fā)酵培養(yǎng)基 pH 范圍為 7. 0-7. 3。
8. 按照權(quán)利要求6所述方法，其特征在于，所述改良的TB培養(yǎng)基為：甘油15-2(^·!^， 酵母粉20-26g · L-1，胰蛋白胨10-12g · L-1，KH2P0417mM，K2HP0 472mM，使用時(shí)添加氨芐青霉素 至終濃度100 μ g · mL-1 ;所述補(bǔ)料培養(yǎng)基為：甘油450-500g · L-1，酵母粉40-50g · L-1，蛋白 胨40-50g · Γ1，使用時(shí)添加氨芐青霉素至終濃度100 μ g · mL'
9. 一種重組表達(dá)菌株E. coli BL21(DE3)，其特征在于，所述菌株保藏編號(hào)為CCTCC M2013598。
【文檔編號(hào)】C12R1/19GK104087560SQ201310655726
【公開日】2014年10月8日 申請(qǐng)日期:2013年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月5日
【發(fā)明者】方澤民, 肖亞中, 常飛, 周鵬, 張學(xué)成, 房偉, 袁璟 申請(qǐng)人:安徽大學(xué)