中國虎紋蛙及泰國虎紋蛙的分子鑒定方法
【專利摘要】為了解決中國虎紋蛙實(shí)際保護(hù)工作中對(duì)外形酷似的中國虎紋蛙和泰國虎紋蛙的鑒定，本發(fā)明提供一種中國虎紋蛙及泰國虎紋蛙的分子鑒定方法。該鑒定方法以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，從而達(dá)到對(duì)中國虎紋蛙和泰國虎紋蛙的快速鑒定，具體實(shí)現(xiàn)步驟為：1）提取樣本DNA；2）樣本DNA檢測(cè)；3）PCR擴(kuò)增；分別采用四對(duì)特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增；4）特異擴(kuò)增產(chǎn)物鑒別。本發(fā)明設(shè)計(jì)的四對(duì)引物涉及不同基因位置，只需通過PCR擴(kuò)增即可區(qū)分中國虎紋蛙和泰國虎紋蛙，引物特異性強(qiáng)，瓊脂糖凝膠電泳特征譜帶穩(wěn)定性高，無區(qū)域性差異，在實(shí)際應(yīng)用中能夠獲得可靠而有益的效果。
【專利說明】中國虎紋蛙及泰國虎紋蛙的分子鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及蛙類的分子鑒定方法，具體涉及一種中國虎紋蛙及泰國虎紋蛙的分子鑒定方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]虎紋蛙皮膚粗糙，頭部和身體兩側(cè)有深黑色的斑紋。背部具十幾行縱向排列的膚棱，膚棱之間散布著棕黑色小疣粒。腹面白色或灰色，也有不規(guī)則的斑紋，咽部和胸部具灰棕色斑，前后肢具橫斑。由于受到人為過度捕捉，虎紋蛙數(shù)量大量減少，被列為國家II級(jí)重點(diǎn)保護(hù)動(dòng)物，也是蛙類中唯一的國家級(jí)保護(hù)動(dòng)物。隨著泰國養(yǎng)殖場(chǎng)的泰國虎紋蛙的人工引進(jìn)，國內(nèi)各養(yǎng)殖場(chǎng)大量飼養(yǎng)泰國虎紋蛙。因泰國虎紋蛙和中國虎紋蛙是否屬于同一物種一直存在廣泛爭議，加之兩者形態(tài)特征幾乎一模一樣，無法從形態(tài)上有效進(jìn)行鑒別，導(dǎo)致一些不法商人直接捕捉野外中國虎紋蛙冒充養(yǎng)殖場(chǎng)泰國虎紋蛙進(jìn)行販賣。而林業(yè)執(zhí)法部門缺少相應(yīng)儀器及技術(shù)無法有效對(duì)市場(chǎng)上銷售的虎紋蛙究竟是國家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物中國虎紋蛙還是允許銷售的泰國虎紋蛙進(jìn)行鑒定，導(dǎo)致執(zhí)法難，近幾年野生中國虎紋蛙種群數(shù)量呈直線下降趨勢(shì)，迫切需要快速準(zhǔn)確的鑒定方法協(xié)助執(zhí)法機(jī)構(gòu)用于物種鑒定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]針對(duì)中國虎紋蛙及泰國虎紋蛙難以從形態(tài)特征進(jìn)行鑒定的問題，本發(fā)明應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)解決中國虎紋蛙及泰國虎紋蛙的分子鑒定，提供一種以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，從而實(shí)現(xiàn)快速鑒定中國虎紋蛙及泰國虎紋蛙的方法。
[0004]本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:
[0005]一種中國虎紋蛙及泰國虎紋蛙的分子鑒定方法，其特征在于:該方法以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶的不同實(shí)現(xiàn)對(duì)中國虎紋蛙和泰國虎紋蛙的快速鑒定，包括如下步驟:
[0006]I)提取樣本DNA ；
[0007]2)樣本DNA檢測(cè)；
[0008]3) PCR擴(kuò)增；分別采用以下四對(duì)特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，
[0009]HWW-HlJ/N，其上游引物具有如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；下游引物具有如SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列；
[0010]HWW-H2J/N，其上游引物具有如SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列；下游引物具有如SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列；
[0011]HWW-H3J/N，其上游引物具有如SEQ ID N0.5所示的核苷酸序列；下游引物具有如SEQ ID N0.6所示的核苷酸序列；
[0012]HWW-H4J/N，其上游引物具有如SEQ ID N0.7所示的核苷酸序列；下游引物具有如SEQ ID N0.8所示的核苷酸序列；
[0013]4)特異擴(kuò)增產(chǎn)物鑒別[0014]擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，120V恒壓，核酸染色劑染色；在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行觀察和分析，并記錄結(jié)果；當(dāng)引物HWW-H1J/N、HWW-H2J/N、HWW-H3J/N、HWW-H4J/N分別擴(kuò)增出1000bp、3000bp、3000bp、3500bp片段大小時(shí)，證明是中國虎紋蛙；當(dāng)引物HWW-H1J/N、HWW-H2J/N、HWW-H3J/N不能擴(kuò)增出片段而能HWW-H4J/N能擴(kuò)增出3500bp片段大小時(shí)，證明為泰國虎紋蛙。
[0015]作為優(yōu)選，采用引物HWW-H1J/N時(shí)，PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積為50iU，其中包括以下組分:10 X PCR Buffer (Mg2+free)為 5 y I，dNTP Mixture (各 2.5mM)為 4 y I，MgCl2 為 4 y I，Primer (J)為 2 yl，Primer (N)為 2 yl，雙蒸水為 31.75 yl，樣本總 DNA 為 I yl，TaKaRaTaq 為 0.25 u I。
[0016]作為優(yōu)選，采用引物HWff-HlJ/N、HWW-H2J/N、HWW-H3J/N時(shí)，PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積為 50ii 1，其中包括以下組分:10XLA PCR Buffer (Mg2+free)為 5 ii I，dNTP Mixture (各
2.5mM)為 IjMgCl2 為 4 y l，Primer(J)為 2 u l，Primer(N)為 2 u 1，雙蒸水為 27.75 U 1，樣本總 DNA 為 I ii 1，TaKaRa La Taq 為 0.25 ii I。
[0017]作為優(yōu)選，采用引物HWff-Hl J/N時(shí)，PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5 °C預(yù)變性4min，然后進(jìn)入如下循環(huán):95°C變性40s、55°C退火40s、72°C延伸lmin，循環(huán)35次，循環(huán)結(jié)束后72°C再延伸 IOmin ；
[0018]采用引物HWW-H2J/N時(shí)，PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性4min，然后進(jìn)入如下循環(huán):95°C變性40s、55°C退火lmin、72°C延伸3min，循環(huán)35次，循環(huán)結(jié)束后72°C再延伸IOmin ；
[0019]采用引物HWW-H3J/N時(shí)，PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性4min，然后進(jìn)入如下循環(huán):95°C變性40s、59°C退火lmin、72°C延伸3min，循環(huán)35次，循環(huán)結(jié)束后72°C再延伸IOmin ；
[0020]采用引物HWW-H4J/N時(shí)，PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性4min，然后進(jìn)入如下循環(huán):95°C變性40s、56°C退火lmin、72°C延伸4min，循環(huán)35次，循環(huán)結(jié)束后72°C再延伸IOmin0
[0021]本發(fā)明該方法是一種以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶的不同實(shí)現(xiàn)對(duì)中國虎紋蛙和泰國虎紋蛙的快速鑒定，具體實(shí)現(xiàn)步驟為:
[0022]1)提取樣本DNA:
[0023]①剪取蛙樣本的腳趾3mm，用無菌水反復(fù)沖洗，置于滅菌的1.5ml離心管中充分剪碎；
[0024]②加入800 U I的DNA裂解緩沖液及7 ii L的蛋白酶K(20mg/ml)，在漩渦混合儀上混勻，金屬浴(560C 450rpm)消化5h，不時(shí)上下顛倒，直至溶液澄清透明，消化完全后冷卻至
室溫；
[0025]③于預(yù)冷至4°C的離心機(jī)中4°C 8000rpm離心5min,取750 ii I上清液，向上清液中加入等體積Tris飽和苯酹,金屬浴(4°C 300rpm)混勻15min,不時(shí)上下顛倒至水相成乳膠狀；
[0026]④4°C 8000rpm離心lOmin，取600iil上清液，向上清液中加入等體積溶劑，溶劑由苯酹:氯仿:異戍醇=25:24:1的體積比混合而成,金屬浴(4°C 400rpm)混勻15min ；
[0027]⑤4°C 8000rpm離心IOmin,取400 U I上清液，向上清液中加入2倍體積的預(yù)冷無水乙醇；
[0028]⑥將上述離心管放置于_20°C冰箱中沉淀DNA3h或以上；
[0029]⑦4°C 12000rpm離心15min，棄上清液，用400 iU的70%乙醇洗滌沉淀；
[0030]⑧4°C 12000rpm離心15min，棄上清液，室溫干燥DNA ；
[0031]⑨將上述提取的總DNA溶于200 U I無菌水中，標(biāo)號(hào)后置于_20°C冰箱內(nèi)保存。
[0032]2)樣本DNA檢測(cè)；
[0033]①配制1%瓊脂糖凝膠，取瓊脂糖0.4g、0.5 X TBE液40ml置于錐形瓶中，混勻后微波爐加熱至瓊脂糖完全溶解，室溫冷卻至50°C，加入2 Ul Gold View核酸染色劑，混勻后倒入制膠板中靜置20min ；
[0034]②分別吸取Marker和各樣本總DNA各4 y I于點(diǎn)樣孔內(nèi)，凝膠板置于電泳槽中，由負(fù)極到正極方向120V電泳30min ；
[0035]③將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行檢測(cè)，觀察各泳道是否出現(xiàn)條帶，出現(xiàn)目的條帶則表明樣本總DNA提取成功。
[0036]3) PCR 擴(kuò)增；
[0037]分別采用四對(duì)特異性引物于PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，四對(duì)引物信息如表1所示。
[0038]表1PCR擴(kuò)增引物
[0039]
【權(quán)利要求】
1.一種中國虎紋蛙及泰國虎紋蛙的分子鑒定方法，其特征在于:該方法以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶的不同實(shí)現(xiàn)對(duì)中國虎紋蛙和泰國虎紋蛙的快速鑒定，包括如下步驟: 1)提取樣本DNA; 2)樣本DNA檢測(cè)； 3)PCR擴(kuò)增；分別采用以下四對(duì)特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增， HWff-HlJ/N，其上游引物具有如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；下游引物具有如SEQID N0.2所示的核苷酸序列； HWW-H2J/N，其上游引物具有如SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列；下游引物具有如SEQID N0.4所示的核苷酸序列； HWW-H3J/N，其上游引物具有如SEQ ID N0.5所示的核苷酸序列；下游引物具有如SEQID N0.6所示的核苷酸序列； HWW-H4J/N，其上游引物具有如SEQ ID N0.7所示的核苷酸序列；下游引物具有如SEQID N0.8所示的核苷酸序列； 4)特異擴(kuò)增產(chǎn)物鑒別 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，120V恒壓，核酸染色劑染色；在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行觀察和分析，并記錄結(jié)果；當(dāng)引物HWW-H1J/N、HWW-H2J/N、HWW-H3J/N、HWW-H4J/N分別擴(kuò)增出1000 bp,3000 bp,3000 bp,3500 bp片段大小時(shí)，證明是中國虎紋蛙；當(dāng)引物HWW-H1J/N、HWW-H2J/N、HWW-H3J/N不能擴(kuò)增出片段而能HWW-H4J/N能擴(kuò)增出3500 bp片段大小時(shí)，證明為泰國虎紋蛙。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中國虎紋蛙及泰國虎紋蛙的分子鑒定方法，其特征在于:采用引物HWW-HlJ/N時(shí)，PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積為50 U 1，其中包括以下組分=IOXPCRBuffer (Mg2+ free)為 5 u I, dNTP Mixture (各 2.5mM)為 4 u I, MgCl2 為 4 u I, Primer(J)為 2 u l,Primer (N)為 2 yl，雙蒸水為 31.75 yl，樣本總 DNA 為 I iil，TaKaRa/^為 0.25 u 10
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中國虎紋蛙及泰國虎紋蛙的分子鑒定方法，其特征在于:采用引物HWW-H1J/N、HWW-H2J/N、HWW-H3J/N時(shí)，PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積為50 U 1，其中包括以下組分:10XLA PCR Buffer (Mg2+ free)為 5 y I, dNTP Mixture (各 2.5mM)為 8 y I,MgCl2為 4 u I, Primer (J)為 2 u I, Primer (N)為 2 u I,雙蒸水為 27.75 Ul,樣本總 DNA 為I U I, TaKaRa LaTaq 為 0.25 U I。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的中國虎紋蛙及泰國虎紋蛙的分子鑒定方法，其特征在于: 采用引物HWW-H1J/N時(shí)，PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5 °C預(yù)變性4 min，然后進(jìn)入如下循環(huán):.95 °C變性40 s、55 °C退火40 s、72°C延伸I min，循環(huán)35次，循環(huán)結(jié)束后72 °C再延伸10min ； 采用引物HWW-H2J/N時(shí)，PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5 °C預(yù)變性4 min，然后進(jìn)入如下循環(huán):.95 °C變性40 s、55 °C退火I min、72°C延伸3 min，循環(huán)35次，循環(huán)結(jié)束后72 °C再延伸10min ； 采用引物HWW-H3J/N時(shí)，PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5 °C預(yù)變性4 min，然后進(jìn)入如下循環(huán):.95 °C變性40 s、59 °C退火I min、72 °C延伸3 min，循環(huán)35次，循環(huán)結(jié)束后72 °C再延伸10 min ； 采用引 物HWW-H4J/N時(shí)，PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5 °C預(yù)變性4 min，然后進(jìn)入如下循環(huán):95 °C變性40 s、56 °C退火I min、72°C延伸4 min，循環(huán)35次，循環(huán)結(jié)束后72 °C再延伸10min。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103667482SQ201310656633
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月12日
【發(fā)明者】張加勇, 俞丹娜, 葉麗婷, 朱成成, 於倍菲, 王超峰, 邵晨, 鄭榮泉 申請(qǐng)人:浙江師范大學(xué)