截短表達(dá)的相思子毒素a鏈蛋白抗原及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種截短表達(dá)的相思子毒素A鏈蛋白抗原及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了tATA4片段，是如下（a）或（b）或（c）或（d）：（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；（b）具有序列表的序列2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；（c）由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；（d）將序列2或序列4的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列2或序列4衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供的tATA4片段可以作為抵抗相思子毒素攻擊的疫苗的活性成分。本發(fā)明具有重大的應(yīng)用價(jià)值和深遠(yuǎn)的應(yīng)用前景。
【專利說明】截短表達(dá)的相思子毒素A鏈蛋白抗原及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及截短表達(dá)的相思子毒素A鏈蛋白抗原及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展和生物毒素的開發(fā)利用，毒素在大規(guī)模殺傷性武器中的重要性已凸現(xiàn)出來，生物毒素及其生物恐怖的威脅與日俱增。作為B類生物戰(zhàn)劑，相思子毒素被列入國際生物戰(zhàn)劑核查清單，它和蓖麻毒素在分子結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制上具有高度相似性，由A-B鏈結(jié)構(gòu)組成(A鏈為效應(yīng)鏈，具有RNA N-糖苷酶活性；B鏈為結(jié)合鏈，介導(dǎo)A鏈進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮毒性作用)。相思子毒素小鼠腹腔LD5tl為0.04 μ g/kg，其毒性是蓖麻毒素的75倍。相思豆主要分布在亞熱帶地區(qū)，在我國的南方有廣泛分布，常被用作裝飾品的制作，甚至能在淘寶網(wǎng)上都能購買到大量的原料，而且在許多公開的專業(yè)刊物和互聯(lián)網(wǎng)上都可以找到如何提取制備相思子毒素的詳細(xì)資料，因此其恐怖威脅不容易忽視。尤其是面對(duì)東突、疆獨(dú)、藏獨(dú)等恐怖極端分子危害人類的恐怖活動(dòng)新動(dòng)態(tài)，在我國不排除發(fā)生相思子毒素的生物恐怖襲擊可能性。
[0003]針對(duì)相思子毒素中毒，目前尚無預(yù)防疫苗、特異性抗毒素和解毒藥。通過分析現(xiàn)有的研究進(jìn)展和成果，美軍的生防專家認(rèn)為，疫苗研究是對(duì)抗其中毒的有效預(yù)防手段。因此，開展相思子毒素疫苗的研究，具有十分重要的軍事和社會(huì)意義。
[0004]我國學(xué)者對(duì)相思子毒素生物戰(zhàn)劑的偵檢工作有了初步的發(fā)展，而對(duì)其疫苗作為醫(yī)學(xué)防護(hù)的研究才剛剛起步，針對(duì)潛在相思子毒素的恐怖襲擊尚無有效的免疫治療和防護(hù)手段，因此迫切需要建立和發(fā)展具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的防護(hù)用品，保證及時(shí)采取應(yīng)急措施和對(duì)策，將生物恐怖襲擊造成的破壞降低到最低限度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種截短表達(dá)的相思子毒素A鏈蛋白抗原及其應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明提供了一種蛋白質(zhì)，命名為tATA4片段，是如下(a)或(b)或(C)或(d):(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)具有序列表的序列2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(c)由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(d)將序列2或序列4的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列2或序列4衍生的蛋白質(zhì)。
[0007編碼所述tATA4片段的基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0008]所述基因具體可為如下(I)或(2)或(3)或(4)或(5)或(6)或(7)的DNA分子:(I)編碼區(qū)如序列表的序列I所不的DNA分子；(2)序列表的序列I所不的DNA分子；(3)具有序列表的序列I所示的核苷酸序列的DNA分子；(4)編碼區(qū)如序列表的序列3所示的DNA分子；(5)序列表的序列3所示的DNA分子；(6)在嚴(yán)格條件下與(I)或(2)或(3)或(4 )或(5 )限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；(7 )與(I)或(2 )或(3 )或(4 )或(5)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。上述嚴(yán)格條件可為在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65oC下雜交，然后用2XSSC、0.1%SDS和I X SSC,
0.1%SDS各洗膜一次。
[0009]含有所述基因的表達(dá)盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述重組載體具體可為重組表達(dá)載體。所述重組表達(dá)載體具體可為在pET-His表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)(如EcoR I和Nhe I酶切位點(diǎn)之間)正向插入了序列表的序列I所示的雙鏈DNA分子得到的重組質(zhì)粒。所述重組菌具體可為將所述重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)得到的重組菌。
[0010]本發(fā)明還保護(hù)所述tATA4片段在制備相思子毒素疫苗中的應(yīng)用。所述相思子毒素為天然相思子毒素和/或相思子毒素_a。
[0011]本發(fā)明還保護(hù)所述tATA4片段和佐劑在制備相思子毒素疫苗中的應(yīng)用。所述相思子毒素為天然相思子毒素和/或相思子毒素_a。所述佐劑具體可為鋁佐劑。
[0012]本發(fā)明還保護(hù)一種相思子毒素疫苗，其活性成分為所述tATA4片段。所述疫苗還包括佐劑。所述佐劑具體可為鋁佐劑。所述相思子毒素為天然相思子毒素和/或相思子毒素~?ο
[0013]本發(fā)明以相思子毒素的A鏈為基礎(chǔ)，從中截取得到了 tATA4片段。與相思子毒素的A鏈相比，tATA4片段的毒性大幅降低，但保持了良好免疫原性。將tATA4片段免疫動(dòng)物后，可以保護(hù)動(dòng)物免受相思子毒素的攻擊致死作用。綜上所述，本發(fā)明提供的tATA4片段可以作為抵抗相思子毒素攻擊的疫苗的活性成分。
[0014]本發(fā)明具有重大的應(yīng)用價(jià)值和深遠(yuǎn)的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為pET-His表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0016]圖2為tATA4片段溶液進(jìn)行15%SDS_PAGE的電泳圖譜。
[0017]圖3為tATA4片段和A鏈蛋白對(duì)BEAS-2B細(xì)胞的殺傷作用，細(xì)胞存活率結(jié)果。
[0018]圖4為tATA4片段和A鏈蛋白對(duì)小鼠的毒性，相對(duì)體重結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0019]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
[0020]基于大量的序列分析、片段截取、毒性驗(yàn)證和免疫原性驗(yàn)證，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)相思子毒素A鏈中的一個(gè)多肽片段兼具低毒性和良好的免疫原性，可以作為相思子毒素的疫苗使用。將該片段命名為tATA4片段，其編碼基因如序列表的序列I所示。
[0021]pET-His表達(dá)載體(結(jié)構(gòu)示意圖見圖1):深圳市源動(dòng)力生物技術(shù)開發(fā)公司。大腸桿菌BL21 (DE3):北京全式金生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為⑶601。BEAS-2B細(xì)胞(人肺上皮細(xì)胞)=ATCC細(xì)胞庫，ATCC Number為CRL-9609?。BALB/c小鼠:軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心，產(chǎn)品號(hào)為RB003。鋁佐劑(Imject?鋁劑，佐劑)=Thermo scientific公司，產(chǎn)品號(hào)為77161。羊抗兔IgG:北京鴻躍創(chuàng)新科技有限公司，產(chǎn)品編號(hào)為Hy-5506。[0022]相思子毒素-a (abrin-a):以市售的相思豆為原料，參照文獻(xiàn)的方法制備得到相思子毒素-a ;參考文獻(xiàn)信息:【題名】相思子毒素_a的純化及鑒定，【作者】李小兵謝光洪周昌芳張志剛宋文學(xué)周曉翠張乃生王興龍高宏偉王哲，【機(jī)構(gòu)】吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130062軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，吉林長(zhǎng)春130062，【刊名】中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008(3):310-313。
[0023]如無特殊說明，實(shí)施例中的PBS緩沖液均為pH7.2、0.01M的PBS緩沖液。
[0024]實(shí)施例1、tATA4片段的制備
[0025]1、合成序列表的序列I所示的雙鏈DNA分子(編碼序列表的序列2所示的tATA4片段)。
[0026]2、以步驟I合成的雙鏈DNA分子為模板，用Fl和Rl組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0027]Fl:5，-CCG GAATTC GAAGATCGCCCGATCA-3，；
[0028]Rl:5’ -CTA GCTAGC ATCCGGCTGAAATGCCGTA-3’。
[0029]3、用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Nhe I雙酶切步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。
[0030]4、用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Nhe I雙酶切pET_His表達(dá)載體，回收約2.9kb的載體骨架。
[0031]5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下:在pET-His表達(dá)載體的EcoR I和Nhe I酶切位點(diǎn)之間正向插入了序列表的序列I所示的雙鏈DNA分子。重組質(zhì)粒中，外源插入片段與載體骨架上的部分核昔酸形成序列表的序列3所不的融合基因，表達(dá)序列表的序列4所不的融合蛋白(具有His標(biāo)簽的tATA4片段)。
[0032]6、將步驟5得到的重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21 (DE3)，得到重組菌。
[0033]7、將步驟6得到的重組菌接種至液體LB培養(yǎng)基，37°C、200rpm振蕩培養(yǎng)至OD6tltol約為0.6 ;然后，加入IPTG并使其濃度為0.01mM，然后20°C、200rpm振蕩培養(yǎng)約12_14h，然后8000g離心lOmin，收集菌體。
[0034]8、取步驟7得到的菌體，用蛋白純化A液(溶劑為pH7.5、20mM Tris-cl緩沖液，含0.5M NaCl)重懸后在冰浴中進(jìn)行超聲破碎(總時(shí)間為30min，功率為550W，每工作2s停3s),4°C、9000g離心15min,收集上清液。
[0035]9、取步驟8得到的上清液，進(jìn)行親和層析。
[0036]鎳柱:HiTrap? Chelating HP, 5ml體積，購于GE公司，產(chǎn)品目錄號(hào):lot:10037610。
[0037]純化過程:先用8體積份蛋白純化A液和2體積份蛋白純化B液(溶劑為pH7.5、20mMTris-cl緩沖液，含0.5M NaCl和0.5M咪唑)組成的混合液洗脫6個(gè)柱體積，以去除雜蛋白；然后用8體積份蛋白純化A液和2體積份蛋白純化B液組成的混合液洗脫10個(gè)柱體積，以收集目的蛋白，得到的過柱后溶液即為融合蛋白溶液，簡(jiǎn)稱tATA4片段溶液。
[0038]將tATA4片段溶液進(jìn)行15%SDS_PAGE。電泳圖譜見圖2的泳道I至3，可以觀察到電泳純的蛋白條帶，相對(duì)分子量約為22kDa，與預(yù)期大小相符。
[0039]經(jīng)BandScan凝膠圖像分析軟件分析，tATA4片段溶液中的蛋白純度約為98%。
[0040]實(shí)施例2、制備全長(zhǎng)蛋白[0041]1、在pET-His表達(dá)載體的EcoR I和Nhe I酶切位點(diǎn)之間正向插入序列表的序列5所示的雙鏈DNA分子(序列表的序列5所示的雙鏈DNA分子編碼序列表的序列6所示的A鏈蛋白)，得到重組質(zhì)粒。
[0042]2、將步驟I得到的重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21 (DE3)，得到重組菌。
[0043]3、將步驟2得到的重組菌接種至液體LB培養(yǎng)基，37°C、200rpm振蕩培養(yǎng)至OD6tltol約為0.6 ;然后，加入IPTG并使其濃度為0.01mM，然后20°C、200rpm振蕩培養(yǎng)約12_14h，然后8000g離心lOmin，收集菌體。
[0044]4、取步驟3得到的菌體，用蛋白純化A液(溶劑為pH7.5、20mM Tris-cl緩沖液，含0.5M NaCl)重懸后在冰浴中進(jìn)行超聲破碎(總時(shí)間為30min，功率為550W，每工作2s停3s),4°C、9000g離心15min,收集上清液。 [0045]5、取步驟4得到的上清液，進(jìn)行親和層析。
[0046]具體參數(shù)同實(shí)施例1的步驟9。
[0047]得到的過柱后溶液即為融合蛋白(具有His標(biāo)簽的A鏈蛋白)溶液，簡(jiǎn)稱A鏈蛋白溶液。
[0048]實(shí)施例3、tATA4片段的性能分析
[0049]一、Western 印跡分析
[0050]將實(shí)施例1制備的tATA4片段溶液進(jìn)行Western印跡分析(Western印跡分析采用的一抗為用實(shí)施例2制備的A鏈蛋白溶液免疫家兔后收集的血清，二抗為羊抗兔IgG)，顯示在22KDa附近有特異性顯色帶出現(xiàn)，說明tATA4片段能被A鏈蛋白特異性血清抗體所識(shí)另U，具有良好的抗原性。
[0051]二、毒性分析
[0052]1、通過MTS法測(cè)定tATA4片段和A鏈蛋白對(duì)BEAS-2B細(xì)胞的殺傷作用
[0053](I)將BEAS-2B細(xì)胞接種至96孔板(10000個(gè)細(xì)胞/孔)，培養(yǎng)過夜使細(xì)胞貼壁。
[0054](2)完成步驟(1)后，將孔分成三組(第一組的孔加入實(shí)施例1制備的tATA4片段溶液的3倍梯度稀釋液，第二組的孔加入實(shí)施例2制備的A鏈蛋白溶液的3倍梯度稀釋液，第三組的孔加入相思子毒素_a溶液的3倍梯度稀釋液；均采用RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋，起始稀釋液中的蛋白濃度為450 μ g/ml，設(shè)置5個(gè)稀釋梯度，每個(gè)稀釋度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每孔加入100 μ I稀釋液；同時(shí)設(shè)置5個(gè)陰性對(duì)照孔，每孔加入100 μ IRPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基)，置于37 °C溫箱中培養(yǎng)24小時(shí)，棄上清。
[0055](3)完成步驟(2)后，每孔加入ΙΟΟμ I RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基和20 μ I MTS試劑，37°C培養(yǎng)3h，酶聯(lián)儀562nm處讀數(shù)。
[0056]細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組OD值/陰性對(duì)照組OD值。
[0057]各組的細(xì)胞存活率結(jié)果見圖3 (平均值)。tATA4片段較之a(chǎn)brin和A鏈蛋白的細(xì)胞毒性明顯降低。
[0058]2、tATA4片段和A鏈蛋白對(duì)小鼠的毒性
[0059]第一組:將實(shí)施例1制備的tATA4片段溶液一次性腹腔注射BALB/c小鼠(分別設(shè)置4個(gè)注射劑量，Img/只、0.5mg/只、0.1mg/只、0.05mg/只，均以蛋白量計(jì)；用PBS緩沖液調(diào)整蛋白濃度；每個(gè)注射劑量5只小鼠，每只小鼠的注射體積均為500μ 1)，注射后每隔24h觀察小鼠的生存狀況并記錄小鼠的體重，持續(xù)觀察10天。[0060]第二組:將實(shí)施例2制備的A鏈蛋白溶液一次性腹腔注射BALB/c小鼠(分別設(shè)置4個(gè)注射劑量，Img/只、0.5mg/只、0.1mg/只、0.05mg/只，均以蛋白量計(jì)；用PBS緩沖液調(diào)整蛋白濃度；每個(gè)注射劑量5只小鼠，每只小鼠的注射體積均為500 μ 1)，注射后每隔24h觀察小鼠的生存狀況并記錄小鼠的體重，持續(xù)觀察10天。
[0061 ] 第三組:將PBS緩沖液一次性腹腔注射BALB/c小鼠(5只小鼠，每只小鼠的注射體積為500 μ 1)，注射后每隔24h觀察小鼠的生存狀況并記錄小鼠的體重，持續(xù)觀察10天。
[0062]注射Img A鏈蛋白后，該組小鼠均死亡。注射0.5mg A鏈蛋白后，該組3只小鼠死亡。注射 0.1mg A鏈蛋白，該組小鼠均未死亡。注射0.05mg A鏈蛋白，該組小鼠均未死亡。
[0063]注射Img tATA4片段、注射0.5mg tATA4片段、注射 0.1mg tATA4片段、注射 0.05mgtATA4片段，各組小鼠均未死亡。
[0064]將每24h測(cè)量的體重除以注射前的初始體重，得到相對(duì)體重，結(jié)果見圖4 (該組小鼠的平均值，只統(tǒng)計(jì)存活小鼠)。結(jié)果表明，tATA4片段較A鏈蛋白的毒性明顯降低。
[0065]三、免疫原性分析
[0066]1、制備血清
[0067]實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用BALB/c小鼠。
[0068]取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，共免疫三次，第一次免疫和第二次免疫之間間隔2周，第二次和第三次免疫之間間隔2周，每次免疫I周后尾靜脈取血并分離血清，每次免疫的方法均如下:用PBS緩沖液稀釋實(shí)施例1制備的tATA4片段溶液，得到蛋白濃度為0.15mg/ml的稀釋液，將100 μ I稀釋液與100 μ I鋁佐劑充分混合乳化，每只小鼠皮下兩點(diǎn)共注射200 μ I。
[0069]采用間接ELISA法進(jìn)行血清效價(jià)測(cè)定(采用實(shí)施例2制備的A鏈蛋白溶液作為包被原，包被濃度為5μ g蛋白/ml，ΙΟΟμ I/孔)。將未經(jīng)任何免疫的BALB/c小鼠的血清作為陰性對(duì)照，將PBS緩沖液作為空白對(duì)照。以P/N≥2.1，P — N≥0.2作為陽性血清的判斷標(biāo)準(zhǔn)。其中P/N=(標(biāo)本OD49tlnm值一空白對(duì)照OD49tlnm值)/ (陰性對(duì)照OD49tlnm值一空白對(duì)照
0^49011111
值)；P — N=標(biāo)本

0^49011111 值一陰性對(duì)照 0^49011111 值。
[0070]對(duì)30只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行上述操作，第三次免疫I周后，血清效價(jià)均達(dá)到1X10 —6以上。
[0071]2、攻毒實(shí)驗(yàn)
[0072]取20只步驟I中第三次免疫后I周的小鼠，分成四組，每組5只，分別處理如下:
[0073]第一組:腹腔注射相思子毒素_a溶液，每只小鼠的注射劑量為20XLD5Q ；
[0074]第二組:腹腔注射相思子毒素_a溶液，每只小鼠的注射劑量為30XLD5(i ；
[0075]第三組:腹腔注射相思子毒素_a溶液，每只小鼠的注射劑量為40XLD5Q ；
[0076]第四組:腹腔注射相思子毒素_a溶液，每只小鼠的注射劑量為50XLD5(i ；
[0077]每隔24h觀察小鼠存活情況并記錄小鼠的體重，共觀察10天(每24小時(shí)為I天，注射前為O天，從注射開始計(jì)時(shí)，24小時(shí)后為I天，依次類推)，結(jié)果見表1。tATA4片段能完全保護(hù)40 X LD5tl的相思子毒素_a的攻擊。
[0078]表1各組小鼠每24小時(shí)的體重(g)和生存率
[0079]
【權(quán)利要求】
1.一種蛋白質(zhì),是如下(a)或(b)或(C)或(d): Ca)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)具有序列表的序列2所不的氣基酸序列的蛋白質(zhì)； (c)由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； Cd)將序列2或序列4的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列2或序列4衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于:所述基因?yàn)槿缦?I)或(2)或(3)或(4)或(5)或(6)或(7)的DNA分子: (1)編碼區(qū)如序列表的序列I所示的DNA分子； (2)序列表的序列I所不的DNA分子； (3)具有序列表的序列I所示的核苷酸序列的DNA分子； (4)編碼區(qū)如序列表的序列3所示的DNA分子； (5)序列表的序列3 所不的DNA分子； (6)在嚴(yán)格條件下與(I)或(2)或(3)或(4)或(5)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子； (7 )與(I)或(2 )或(3 )或(4)或(5 )限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的表達(dá)盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)在制備相思子毒素疫苗中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)和佐劑在制備相思子毒素疫苗中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于:所述佐劑為鋁佐劑。
8.一種相思子毒素疫苗，其活性成分為權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)。
9.如權(quán)利要求8所述的疫苗，其特征在于:所述疫苗還包括佐劑。
10.如權(quán)利要求9所述的疫苗，其特征在于:所述佐劑為鋁佐劑。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK103694326SQ201310674693
【公開日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2013年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月11日
【發(fā)明者】王景林, 張弢, 康琳, 高姍 申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所