一種改善植物性狀的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種改善植物性狀的方法,將外源的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因轉(zhuǎn)入植物中。本發(fā)明的方法可極好地應(yīng)用于植物品種的改良,為運(yùn)用轉(zhuǎn)基因等分子育種技術(shù)培育植物新品種提供了非常有價(jià)值的基因資源。
【專利說明】一種改善植物性狀的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程和植物學(xué)領(lǐng)域,更特別地,本發(fā)明涉及一種改善植物性狀的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]植物是人類社會(huì)食物和和生活生產(chǎn)資料的重要來源,幾乎所有的人類食物都直接或間接的來源于植物。隨著世界人口的增長(zhǎng),對(duì)糧食的需求量在不停增加,提高植物尤其是農(nóng)作物的產(chǎn)量是人類社會(huì)發(fā)展的關(guān)鍵。更高的植物產(chǎn)量意味著在相同的耕地面積下收獲更多的糧食,水果或者木材,為人類社會(huì)的發(fā)展提供強(qiáng)大的支持。傳統(tǒng)的農(nóng)作物育種方式包括雜交育種,誘變育種等,這些技術(shù)的特點(diǎn)相對(duì)來說進(jìn)展緩慢,定向改造性不強(qiáng),且耗費(fèi)時(shí)間極長(zhǎng)。利用基因工程技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高植物產(chǎn)量日漸成為現(xiàn)今人們改造植物尤其是農(nóng)作物的主要手段?;蚬こ碳夹g(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的主要特點(diǎn)是定向改造,改造的時(shí)間周期大大縮短,且能夠在已有的優(yōu)良品種基礎(chǔ)上特異的增加所需的植物性狀,例如增加產(chǎn)量,抵抗包括聞鹽等不良環(huán)境,抗病蟲害等。
[0003]在當(dāng)今世界森林資源日益匱乏的環(huán)境下,林木育種已成為高效、優(yōu)質(zhì)實(shí)現(xiàn)林業(yè)生產(chǎn)任務(wù)的重要措施之一。林木的特點(diǎn)是生長(zhǎng)發(fā)育周期長(zhǎng),遺傳雜合性高,個(gè)體占據(jù)空間大,性狀在幼年和成年期變化大等,這些特性對(duì)于林木育種的進(jìn)展都有很大影響。
[0004]傳統(tǒng)的林木育種有樹種、種源和優(yōu)樹選擇,雜交育種及倍性育種等方式,選育一個(gè)世代的時(shí)間由十幾年到幾十年不等,非常漫長(zhǎng)。利用生物技術(shù)手段可以顯著縮短育種時(shí)間,林木遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的日臻成熟也為利用基因工程培育林木新品種提供了基礎(chǔ)。但是,由于生物技術(shù)育種研究工作開展時(shí)間不長(zhǎng),林木遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)相對(duì)不夠成熟,真正能夠應(yīng)用于林木育種的基因還很有限,這都限制了林木基因工程育種的發(fā)展。因此,在進(jìn)一步完善遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)、開發(fā)新的功能基因的同時(shí)·,充分挖掘已知功能基因的新功能和應(yīng)用價(jià)值也是培育林木新品種的一個(gè)快速有效的手段。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種改善植物性狀的方法。
[0006]本發(fā)明還有另一目的在于提供一種提高植物抗鹽能力的方法。
[0007]在本發(fā)明的第一方面,提供一種改善木本植物性狀的方法,包括:將外源的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因或其變體轉(zhuǎn)入木本植物中。
[0008]在一個(gè)優(yōu)選例中,所述的外源的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因來源于草本植物。
[0009]在另一優(yōu)選例中,所述的外源的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因包括:CYP714D、CYP714A、CYP714E, CYP714F。
[0010]在另一優(yōu)選例中,所述的外源的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因來源于禾本科。[0011]在另一優(yōu)選例中,所述的外源的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因來源于水稻屬或玉米屬。
[0012]在另一優(yōu)選例中,所述的CYP714D1基因是:
[0013](a)核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 30的基因;
[0014](b)核苷酸序列在嚴(yán)格條件下能夠與(a)限定的多核苷酸序列雜交的基因;
[0015](c)核苷酸序列與(a)限定的多核苷酸序列有80%以上同源性的基因;或
[0016](d)核苷酸序列與(a)限定的多核苷酸序列完全互補(bǔ)的多核苷酸。
[0017]在另一優(yōu)選例中,所述的草本植物包括:禾本科植物(如水稻、玉米、小麥),十字花科植物(如擬南芥),茄科植物(如番茄)和豆科植物(如大豆)。
[0018]在另一優(yōu)選例中,所述的草本植物是禾本科稻屬的植物。
[0019]在另一優(yōu)選例中,所述木本植物包括:楊柳科植物,??浦参?,桃金娘科植物,松科植物,柏科植物,胡桃科植物,樺科植物,懸鈴木科,錦葵科植物,椴樹科植物,梧桐科植物,薔薇科植物,蝶形花科植物,黃楊科植物,漆樹科植物。
[0020]在另一優(yōu)選例中,所述的木本植物是楊柳科植物、桑科植物、桃金娘科(如桉屬)植物。
[0021]在另一優(yōu)選例中,在木本植物中表達(dá)外源的來源于草本植物的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因或其變體,從而下調(diào)木本植物中細(xì)胞色素P450家族714亞家族的基因的表達(dá)。
[0022]在另一優(yōu)選例中,所述的方法包括:
[0023](I)將外源的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因或其變體轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞、組織、器官或種子,獲得轉(zhuǎn)化入所述基因的植物細(xì)胞、組織、器官或種子;和
[0024](2)將步驟⑴獲得的轉(zhuǎn)入了所述基因的植物細(xì)胞、組織、器官或種子再生成植物。
[0025]在另一優(yōu)選例中,所述的方法包括:
[0026](Si)提供攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌,所述的表達(dá)載體含有外源的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因或其變體;
[0027](s2)將植物細(xì)胞、組織、器官或種子與步驟(Si)中的農(nóng)桿菌接觸,從而使外源的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因或其變體轉(zhuǎn)入植物。
[0028]在另一優(yōu)選例中,所述的方法還包括:(S3)選擇出轉(zhuǎn)入了外源的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因的植物細(xì)胞、組織、器官或種子;以及(s4)將步驟(s3)中的植物細(xì)胞、組織、器官或種子再生成植物。
[0029]在另一優(yōu)選例中,所述的方法中,所述的改善木本植物性狀包括:
[0030]增加株高;
[0031]增加生物量;
[0032]增加果實(shí)產(chǎn)量;
[0033]增加果實(shí)數(shù)量;
[0034]增加花朵數(shù)量;
[0035]促進(jìn)生長(zhǎng);
[0036]增加莖的直徑、節(jié)間長(zhǎng)度、葉片面積或葉柄長(zhǎng)度;或[0037]提高內(nèi)源GA或/和IAA的含量。
[0038]在本發(fā)明的另一方面,提供來源于草本植物的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因或其變體的用途,用于改善木本植物性狀。
[0039]在一個(gè)優(yōu)選例中,所述的來源于草本植物的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因包括:CYP714D、CYP714A、CYP714E, CYP714F。
[0040]在本發(fā)明的另一方面,提供一種改善草本植物性狀的方法,包括:將外源的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因或其變體轉(zhuǎn)入草本植物中。
[0041]在一個(gè)優(yōu)選例中,所述的外源的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因來源于木本植物。
[0042]在一個(gè)優(yōu)選例中,所述的外源的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因來源于楊柳科。
[0043]在另一優(yōu)選例中,所述的外源的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因包括:CYP714A3、CYP714E2、CYP714E4、CYP714E5、CYP714E6 和 CYP714F1。
[0044]在另一優(yōu)選例中,所述的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因是:
[0045](a)核苷酸序列如SEQ ID NO:31的基因;
[0046](b)核苷酸序列在嚴(yán)格條件下能夠與(a)限定的多核苷酸序列雜交的基因;
[0047](c)核苷酸序列與(a)限定的多核苷酸序列有80%以上同源性的基因;或
[0048](d)核苷酸序列與(a)限定的多核苷酸序列完全互補(bǔ)的多核苷酸。
[0049]在另一優(yōu)選例中,所述的草本植物包括:禾本科植物(如水稻、玉米、小麥),十字花科植物(如擬南芥),茄科植物(如番茄)和豆科植物(如大豆)。
[0050]在另一優(yōu)選例中,所述的草本植物是茄科茄屬的植物。
[0051]在另一優(yōu)選例中,所述木本植物包括:楊柳科植物,桑科植物,桃金娘科植物,松科植物,柏科植物,胡桃科植物,樺科植物,懸鈴木科,錦葵科植物,椴樹科植物,梧桐科植物,薔薇科植物,蝶形花科植物,黃楊科植物,漆樹科植物。
[0052]在另一優(yōu)選例中,所述的木本植物是楊柳科植物、桑科植物、桃金娘科(如桉屬)植物。
[0053]在另一優(yōu)選例中,在草本植物中表達(dá)外源的來源于木本植物的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因或其變體,從而下調(diào)草本植物中細(xì)胞色素P450家族714亞家族的基因的表達(dá)。
[0054]在另一優(yōu)選例中,所述的方法包括:
[0055](I)將外源的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因或其變體轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞、組織、器官或種子,獲得轉(zhuǎn)化入所述基因的植物細(xì)胞、組織、器官或種子;和
[0056](2)將步驟(1)獲得的轉(zhuǎn)入了所述基因的植物細(xì)胞、組織、器官或種子再生成植物。
[0057]在另一優(yōu)選例中,所述的方法包括:
[0058](Si)提供攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌,所述的表達(dá)載體含有外源的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因或其變體;
[0059](s2)將植物細(xì)胞、組織、器官或種子與步驟(Si)中的農(nóng)桿菌接觸,從而使外源的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因或其變體轉(zhuǎn)入植物。[0060]在另一優(yōu)選例中,所述的方法還包括:(s3)選擇出轉(zhuǎn)入了外源的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因的植物細(xì)胞、組織、器官或種子;以及(s4)將步驟(s3)中的植物細(xì)胞、組織、器官或種子再生成植物。
[0061]在另一優(yōu)選例中,所述的方法中,所述的改善草本植物性狀包括:
[0062]增加株高;
[0063]增加生物量;
[0064]增加果實(shí)產(chǎn)量;
[0065]增加果實(shí)數(shù)量;
[0066]增加花朵數(shù)量;
[0067]促進(jìn)生長(zhǎng);
[0068]增加莖的直徑、節(jié)間長(zhǎng)度、葉片面積或葉柄長(zhǎng)度;或
[0069]提高內(nèi)源GA或/和IAA的含量。
[0070]在本發(fā)明的另一方面,提供來源于木本植物的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因或其變體的用途,用于改善草本植物性狀。
[0071]在一個(gè)優(yōu)選例中 ,所述的來源于木本植物的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因包括:CYP714A3、CYP714E2、CYP714E4、CYP714E5、CYP714E6 和 CYP714F1。
[0072]在本發(fā)明的另一方面,提供一種提高植物抗鹽能力的方法,包括:將外源的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因或其變體轉(zhuǎn)入植物中。
[0073]在一個(gè)優(yōu)選例中,所述的外源的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因來源于木本植物,被轉(zhuǎn)入的植物來源于草本植物。
[0074]在另一優(yōu)選例中,所述的外源的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因包括:CYP714A3、CYP714E2、CYP714E4、CYP714E5、CYP714E6 和 CYP714F1。
[0075]在另一優(yōu)選例中,所述的CYP714A3基因是:
[0076](a)核苷酸序列如SEQ ID NO:31的基因;
[0077](b)核苷酸序列在嚴(yán)格條件下能夠與(a)限定的多核苷酸序列雜交的基因;
[0078](c)核苷酸序列與(a)限定的多核苷酸序列有80%以上同源性的基因;或
[0079](d)核苷酸序列與(a)限定的多核苷酸序列完全互補(bǔ)的多核苷酸。
[0080]在另一優(yōu)選例中,所述的草本植物包括:禾本科植物(如水稻、玉米、小麥),十字花科植物(如擬南芥),茄科植物(如番茄)和豆科植物(如大豆)。
[0081]在另一優(yōu)選例中,所述的草本植物是禾本科稻屬的植物。
[0082]在另一優(yōu)選例中,所述木本植物包括:楊柳科植物,桑科植物,桃金娘科植物,松科植物,柏科植物,胡桃科植物,樺科植物,懸鈴木科,錦葵科植物,椴樹科植物,梧桐科植物,薔薇科植物,蝶形花科植物,黃楊科植物,漆樹科植物。
[0083]在另一優(yōu)選例中,所述的木本植物是楊柳科植物、??浦参?、桃金娘科(如桉屬)植物。
[0084]在另一優(yōu)選例中,所述的木本植物是楊柳科楊樹屬的植物。
[0085]在另一優(yōu)選例中,在草本植物中表達(dá)外源的來源于木本植物的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因或其變體,從而下調(diào)草本植物中細(xì)胞色素P450家族714亞家族的基因的表達(dá)。[0086]在另一優(yōu)選例中,所述的方法包括:
[0087](I)將外源的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因或其變體轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞、組織、器官或種子,獲得轉(zhuǎn)化入所述基因的植物細(xì)胞、組織、器官或種子;和
[0088](2)將步驟(1)獲得的轉(zhuǎn)入了所述基因的植物細(xì)胞、組織、器官或種子再生成植物。
[0089]在另一優(yōu)選例中,所述的方法包括:
[0090](Si)提供攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌,所述的表達(dá)載體含有外源的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因或其變體;
[0091](s2)將植物細(xì)胞、組織、器官或種子與步驟(Si)中的農(nóng)桿菌接觸,從而使外源的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因或其變體轉(zhuǎn)入植物。
[0092]在另一優(yōu)選例中,所述的方法還包括:(S3)選擇出轉(zhuǎn)入了外源的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因的植物細(xì)胞、組織、器官或種子;以及(s4)將步驟(s3)中的植物細(xì)胞、組織、器官或種子再生成植物。
[0093]在本發(fā)明的另一方面,提供細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因或其變體的用途,用于提高植物抗鹽能力。
[0094]在一個(gè)優(yōu)選例中,所述的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因包括:CYP714A3、CYP714E2、CYP714E4、CYP714E5、CYP714E6 和 CYP714F1。
[0095]本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容,對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0096]圖1、轉(zhuǎn)化載體及轉(zhuǎn)基因鑒定。A,植物表達(dá)載體結(jié)構(gòu)圖;B,轉(zhuǎn)基因楊樹的PCR鑒定;C,轉(zhuǎn)基因楊樹的RT-PCR分析;D,轉(zhuǎn)基因楊樹的⑶S染色分析。
[0097]圖2、轉(zhuǎn)基因楊樹表型。A,株高表型;B,根;C,節(jié)間和莖粗;D,葉片和葉柄;E,Southern blot 分析。
[0098]圖3、生長(zhǎng)曲線和生物量。A,生長(zhǎng)曲線;B,葉片數(shù)量;C,莖的直徑;D,節(jié)間和葉柄長(zhǎng)
度;E,鮮重;F,干重。
[0099]圖4、莖的顯微觀察。A-C,莖橫切面;D_F,木質(zhì)部;G_I,韌皮部纖維;J_L,莖外皮縱切面。
[0100]圖5、莖的顯微測(cè)量。A,總長(zhǎng)度(T)、木質(zhì)部(X)、形成層(Ca)、韌皮部(P)、外皮(OB) ;B,木質(zhì)部細(xì)胞數(shù)量;C,木纖維長(zhǎng)度;D,木質(zhì)部纖維(Xf)和韌皮部纖維(Pf)細(xì)胞壁厚度;E,皮層細(xì)胞縱長(zhǎng),Ep,表皮,Co,周皮,Pa,皮下組織。
[0101]圖6、轉(zhuǎn)基因楊樹與野生型內(nèi)源GA和IAA的含量測(cè)定。
[0102]圖7、野生型與轉(zhuǎn)基因楊樹中GA途徑相關(guān)基因的表達(dá)量分析。
[0103]圖8、野生型與轉(zhuǎn)基因楊樹中PtCYP714基因家族成員的表達(dá)量分析。
[0104]圖9、ZmCYP714轉(zhuǎn)基因楊樹的表型,WT為野生型楊樹,L1-L3為轉(zhuǎn)基因楊樹。
[0105]圖10、PtCYP714A3轉(zhuǎn)基因番茄的PCR鑒定。M:DNA分子量Marker ;P:質(zhì)粒正對(duì)照;N:負(fù)對(duì)照;WT:野生型番茄;L2-L14:不同的轉(zhuǎn)基因番茄株系。
[0106]圖11、PtCYP714A3轉(zhuǎn)基因番茄的RT-PCR鑒定。WT:野生型番茄;L2_L14:不同的轉(zhuǎn)基因番爺株系。
[0107]圖12、楊樹PtCYP714A3基因在MicroTom番茄品種中異源表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因番茄的株高和生物量。WT:野生型番茄;L3,L5,Lll和L14:不同的轉(zhuǎn)基因番茄株系。
[0108]圖13、楊樹PtCYP714A3基因在PKM番茄品種中異源表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因番茄的株高。PKM:野生型番茄;L53:轉(zhuǎn)基因番茄。
[0109]圖14、轉(zhuǎn)基因水稻的PCR和RT-PCR鑒定。
[0110]M,DNA分子量Marker ;P,質(zhì)粒正對(duì)照;N,負(fù)對(duì)照;WT,野生型水稻;2_38,不同的轉(zhuǎn)基因株系。
[0111]圖15、NaCl(150mM)處理。WT,野生型水稻;Z33和Z38,兩個(gè)轉(zhuǎn)基因水稻株系。
[0112]圖16、NaCl(150mM)處理12天后野生型和轉(zhuǎn)基因水稻的存活率。
【具體實(shí)施方式】
[0113]本發(fā)明人經(jīng)過廣泛的研究,找到一種對(duì)于改善植物性狀有用的方法,通過將外源的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因轉(zhuǎn)入植物中,進(jìn)而促進(jìn)植物生長(zhǎng),同時(shí)使得植物抗鹽能力增強(qiáng)。本發(fā)明的方法可極好地應(yīng)用于植物品種的改良,為運(yùn)用轉(zhuǎn)基因等分子育種技術(shù)培育木本植物新品種提供了非常有價(jià)值的基因資源。
[0114]本發(fā)明中,所述的“草本植物”是一類植物的總稱,其植物體木質(zhì)部較不發(fā)達(dá)至不發(fā)達(dá),莖多汁,較柔軟;且,所述的“草本植物”天然基因組中含有細(xì)胞色素P450家族714亞家族(CYP714)家族的基因。例如,所述的“草本植物”可以是:禾本科(Gramineae),露3?樹科(Pandanaceae),黑三棱科(Sparganiaceae),水蕹科(Aponogetonaceae),眼子菜科(Potamogetonacea·e),茨藻科(Najadaceae,冰沼草科(Scheuchzeriaceae),澤 ?寫科(Alismataceae)花菌科(Butomaceae),水瞥科(Hydrocharitaceae),霉草科(Triuridaceae),莎草科(Cyperaceae),掠桐科(模柳科)(Palmae(Arecaceae)),天南星科(Araceae),浮萍科(Lemnaceae),須葉藤科(Flagellariaceae),帚燈草科(Restionaceae),刺鱗草科(Centrolepidaceae),黃眼草科(Xyridaceae),谷精草科(Eriocaulaceae),鳳梨科(Bromeliaceae),鴨妬草科(Co_elinaceae),雨久花科(Pontederiaceae),田蔥科(Philydraceae),燈心草科(Juncaceae),百部科(Stemonaceae),百合科(Liliaceae),石蒜科(Amaryllidaceae),菌葡薯科(箭根薯科)(Taccaceae),暮葡科(Dioscoreaceae),鸞尾科(Iridaceae),色蓮科(Musaceae),姜科(Zingiberaceae),美人蓮科(annaceae),竹芋科(Marantaceae),水玉替科(Burmanniaceae)或蘭科的植物。
[0115]作為本發(fā)明的優(yōu)選方式,所述的草本植物是:禾本科植物,例如禾本科稻屬的水稻,十字花科植物;以及茄科植物,例如茄科茄屬的番茄。所述的禾本科植物包括但不限于:水稻、小麥、大麥、玉米、高粱等;所述的茄科植物包括但不限于:番茄,顛茄等;或所述的十字花科植物包括但不限于:擬南芥。
[0116]本發(fā)明中,所述的林木是指“木本植物”,指根和莖因增粗生長(zhǎng)形成大量的木質(zhì)部、而細(xì)胞壁也多數(shù)木質(zhì)化的堅(jiān)固的植物;且所述的木本植物天然基因組中含有CYP714家族的基因。例如,所述的“木本植物”可以是:楊柳科(Salicaceae)、桑科(Moraceae)、桃金娘科(Myrtaceae)、石松科(Lycopodiaceae)、(Selaginellaceae)、銀杏科(Ginkgoaceae)、松科(Pinaceae)、蘇鐵科(Cycadaceae)、天南星科(Araceae)、毛莫科(Ranunculaceae)、懸鈴木科(Platanaceae)、偷科(Ulmaceae)、胡桃科(Juglandaceae)、樣科(Betulaceae)、稱猴桃科(Actinidiaceae)、錦奏科(Malvaceae)、梧桐科(Sterculiaceae)、鍛樹科(Tiliaceae)、徑柳科(Tamaricaceae)、蓄薇科(Rosaceae)、景天科(Crassulaceae)、蘇木科(Caesalpinaceae)、蝶形花科(Fabaceae)、石槽科(Punicaceae)、拱桐科(Nyssaceae)、山萊英科(Cornaceae)、八角柄科(Alangiaceae)、衛(wèi)矛科(Celastraceae)、冬青科(Aquifoliaceae)、黃楊科(Buxaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、小盤木科(Pandaceae)、鼠李科(Rhamnaceae)、葡萄科(Vitaceae)、漆樹科(Anacardiaceae),撤攬科(Burseraceae)、結(jié)???Campanulaceae)、紅樹科(Rhizophoraceae)、植香科(Santalaceae)、木庫(kù)科(Oleaceae)或玄參科(Scrophulariaceae)的植物。
[0117]作為本發(fā)明的優(yōu)選方式,所述的木本植物是指楊柳科(如楊屬,更特別如楊樹)或???如構(gòu)樹屬,更特別如光葉楮)、桃金娘科(如桉屬,更特別如桉樹)的木本植物。
[0118]草本植物和木本植物最顯著的區(qū)別在于它們莖的結(jié)構(gòu),草本植物的莖為“草質(zhì)莖”,莖中密布很多相對(duì)細(xì)小的維管束,充斥維管束之間的是大量的薄壁細(xì)胞,在莖的最外層是堅(jiān)韌的機(jī)械組織。草本植物的維管束也與木本植物不同,維管束中的木質(zhì)部分布在外側(cè)而韌皮部則分布在內(nèi)側(cè),這是與木本植物完全相反的,另外草本植物的維管束不具有形成層,不能不斷生長(zhǎng),因而樹會(huì)逐年變粗而草和竹子就沒有這樣的本領(lǐng)。
[0119]細(xì)胞色素P450家族(CYP450)基因是古老的超基因家族,對(duì)P450的分類和命名是根據(jù)基因編碼的氨基酸序列的相似性進(jìn)行的。如果一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的P450基因的氨基酸序列與其他已知的P450氨基酸序列相同性大于40%,則它們屬于同一個(gè)家族;如果兩個(gè)P450的氨基酸序列相同性大于40%而小于55%,則它們分屬于同一個(gè)家族的兩個(gè)不同亞家族;如果兩個(gè)P450的氨基酸序列相同性大于55%,則它們屬于同一個(gè)亞家族。本發(fā)明中所述的“細(xì)胞色素P450家族714亞家族”,或“CYP714亞家族”,或“P450家族714亞家族”,或“CYP714家族”,是指與SEQ ID NO:1或SEQ ID N0:30或SEQ ID NO:31所編碼的多肽的氨基酸序列相同性大于40% 的基因,優(yōu)選大于55%的基因,例如:CYP714D、CYP714A、CYP714E,CYP714FCYP714A3、CYP714E2、CYP714E4、CYP714E5、CYP714E6 和 CYP714F1。
[0120]在水稻中目前發(fā)現(xiàn)的CYP714家族只有714D1 —個(gè)成員,在楊樹中通過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)的 CYP714 家族包括:CYP714A3、CYP714E2、CYP714E4、CYP714E5、CYP714E6 和 CYP714F1 共6 個(gè)成員。(The P450Homepage, http://drnelson.uthsc.edu)
[0121]本發(fā)明中,“轉(zhuǎn)基因”,系指通過任何方法導(dǎo)入植物個(gè)體一段外源的雙鏈脫氧核糖核苷酸(DNA)片段,可以是游離在染色體外,也可以整合到受體植物染色體的基因組上;可以通過生殖過程傳遞到后代,也可以不傳遞到后代。外源基因可以是從任何生物基因組中克隆的,也可以是人工合成的或用PCR在體外擴(kuò)增的。
[0122]本發(fā)明中,除非另外說明,所述的“外源基因”也稱為“異源基因”是指與待轉(zhuǎn)基因的植株本身不同種植物來源的基因。例如,相對(duì)于茄科的植物,來源于楊柳科的基因?yàn)橥庠椿颉?br>
[0123]本發(fā)明人發(fā)現(xiàn),CYP714基因家族成員所編碼的蛋白具有降解赤霉素的作用,而赤霉素是一種雙萜類化合物的植物激素,其廣泛存在于植物中,可發(fā)揮促進(jìn)植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)等作用。下調(diào)CYP714基因家族成員的表達(dá)或活性可以有效地減少赤霉素受降解的比例,使得植物中赤霉素保留較高的含量,有利于林木的生長(zhǎng)。
[0124]進(jìn)一步地,本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn),外源的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因,在轉(zhuǎn)入木本植物中后,可有效地改善木本植物的性狀,同時(shí)木本植物來源的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因,在轉(zhuǎn)入草本植物中后,也可有效地改善草本植物的性狀。
[0125]現(xiàn)有技術(shù)中,一些草本植物(如水稻)來源的CYP714家族基因已知是一個(gè)降解赤霉素的基因,然而,本發(fā)明人在深入研究后意外地發(fā)現(xiàn),外源的CYP714家族基因在轉(zhuǎn)化木本植物中后,并非發(fā)揮降解赤霉素的功能,反而可以顯著下調(diào)木本植物自身CYP714家族的基因的表達(dá),使得相應(yīng)轉(zhuǎn)基因的木本植物中的赤霉素含量和IAA含量升高,從而使得木本植物生物量增加,生長(zhǎng)速度顯著增加。發(fā)明人同時(shí)還發(fā)現(xiàn),木本植物來源的CYP714家族基因在轉(zhuǎn)化草本植物中后,也同樣使得相應(yīng)轉(zhuǎn)基因的草本植物中的赤霉素含量和IAA含量升高,從而使得草本植物生物量增加,經(jīng)濟(jì)作物的果實(shí)數(shù)量和總果實(shí)產(chǎn)量增加,植株增高,生長(zhǎng)速度顯著增加。
[0126]本發(fā)明還涉及上述水稻來源的CYP714基因的變異體(變體)和上述楊樹來源的CYP714基因的變異體(變體)。所述的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的,等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式,它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入,但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
[0127]本發(fā)明還涉及與上述的水稻或楊樹來源的CYP714基因雜交且兩個(gè)序列之間具有至少70%,更佳地至少80%,更佳地至少85%,更佳地至少90%,更佳地至少95%,更佳地至少98%相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中,“嚴(yán)格條件”是指:(I)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫,如0.2XSSC,0.1%SDS,60°C;或⑵雜交時(shí)加有變性劑,如50%(v/v)甲酰胺,0.1%小牛血清/0.l%Ficoll,42°C等;或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90%以上,更好是95%以上時(shí)才發(fā)生雜交。
[0128]因此,作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式,采用草本植物來源的CYP714D1基因來用于轉(zhuǎn)化木本植物。作為本發(fā)明的另一種優(yōu)選方式,采用木本植物來源的CYP714A3基因來用于轉(zhuǎn)化草本植物。 編碼的蛋白與相應(yīng)草本植物來源的CYP714D1基因具有相同功能的CYP714D1的同源基因或類似物或變異體,以及編碼的蛋白與相應(yīng)木本植物來源的CYP714A3基因具有相同功能的CYP714A3的同源基因或類似物或變異體也可被應(yīng)用于本發(fā)明的方法。
[0129]本發(fā)明提供了一種改善植物性狀的方法,該方法包括將外源的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因轉(zhuǎn)入植物中,從而使得所述木本植物發(fā)生以下一種或幾種性狀的改變:增加株高;增加生物量;增加果實(shí)產(chǎn)量;增加果實(shí)數(shù)量;增加花朵數(shù)量;促進(jìn)生長(zhǎng);增加莖的直徑、節(jié)間長(zhǎng)度、葉片面積或葉柄長(zhǎng)度;提高內(nèi)源GA或/和IAA的含量;或提高對(duì)鹽的耐受能力。
[0130]使一種種屬來源的植物表達(dá)另一種種屬來源的基因,例如使木本植物中表達(dá)草本植物來源的基因或使草本植物中表達(dá)木本植物來源的基因的方法是本領(lǐng)域周知的。一般可通過轉(zhuǎn)入一種植物來源的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因的表達(dá)構(gòu)建物使另一種植物過表達(dá)細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因。
[0131]作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式,獲得轉(zhuǎn)基因植株的方法如下:[0132](I)提供攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌,所述的表達(dá)載體含有A植物來源的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因;
[0133](2)將植物細(xì)胞或組織或器官與步驟(1)中的農(nóng)桿菌接觸,從而使該A植物來源的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因轉(zhuǎn)入B植物細(xì)胞,并且整合到B植物細(xì)胞的染色體上;
[0134](3)選擇出轉(zhuǎn)入所述A植物來源的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因的木本植物細(xì)胞或組織;和
[0135](4)將步驟(3)中的B植物的細(xì)胞或組織再生成完整植物。
[0136]其中,可采用任何適當(dāng)?shù)某R?guī)手段,包括試劑、溫度、壓力條件等來實(shí)施此方法。
[0137]此外,還可以應(yīng)用一些特異性的啟動(dòng)子,如組織表達(dá)特異性啟動(dòng)子,來可控地使轉(zhuǎn)入的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因(A植物來源的基因)被表達(dá)于被轉(zhuǎn)入基因的植物(B植物)的特定部位,從而改造B植物的株型。
[0138]下面結(jié)合具體實(shí)施例,進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解,這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法,通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著,分子克隆實(shí)驗(yàn)指南,第三版,科學(xué)出版社,2002中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明,否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。
[0139]實(shí)施例1、轉(zhuǎn)基因楊樹的建立
[0140]水稻來源的0sCYP714Dl基因序列如下(SEQ ID NO:1):
【權(quán)利要求】
1.一種改善植物性狀的方法,其特征在于,包括:將來源于A植物的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因或其變體轉(zhuǎn)入B植物中,從而改善B植物的性狀,并且所述的A植物與B植物分別屬于植物分類學(xué)上兩個(gè)不同的科。
2.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述的B植物為木本植物,并且所述的外源的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因包括但不限于:CYP714D、CYP714A、CYP714E,CYP714F,CYP714A3、CYP714E2、CYP714E4、CYP714E5、CYP714E6 和 CYP714F1。
3.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述的A植物為木本植物,B植物為草本植物,并且所述的外源的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因包括但不限于:CYP714A3、CYP714E2、CYP714E4、CYP714E5、CYP714E6 和 CYP714F1。
4.如權(quán)利要求2或3所述的方法,其特征在于,所述的草本植物包括但不限于:禾本科植物,十字花科植物,茄科植物,豆科植物,薔薇科植物和蝶形花科植物;所述木本植物包括但不限于:楊柳科植物,桑科植物,桃金娘科植物,松科植物,柏科植物,胡桃科植物,樺科植物,懸鈴木科,錦葵科植物,椴樹科植物,梧桐科植物,薔薇科植物,蝶形花科植物,黃楊科植物,漆樹科植物。
5.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述的改善植物性狀包括: 增加株高; 增加生物量; 增加果實(shí)產(chǎn)量; 增加果實(shí)數(shù)量;` 增加花朵數(shù)量; 促進(jìn)生長(zhǎng); 增加莖的直徑、節(jié)間長(zhǎng)度、葉片面積或葉柄長(zhǎng)度; 提高內(nèi)源GA或/和IAA的含量。
6.一種提高植物抗鹽能力的方法,其特征在于,包括:將外源的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因或其變體轉(zhuǎn)入植物中。
7.如權(quán)利要求6所述的方法,其特征在于,所述的外源的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因包括:CYP714D、CYP714A、CYP714E, CYP714FCYP714A3、CYP714E2、CYP714E4、CYP714E5、CYP714E6 和 CYP714F1。
8.如權(quán)利要求6所述的方法,其特征在于,所述的植物包括但不限于:禾本科植物,十字花科植物,茄科植物,豆科植物,楊柳科植物,??浦参铮医鹉锟浦参?,松科植物,柏科植物,胡桃科植物,樺科植物,懸鈴木科,錦葵科植物,椴樹科植物,梧桐科植物,薔薇科植物,蝶形花科植物,黃楊科植物,漆樹科植物。
9.如權(quán)利要求1或6所述的方法,其特征在于,包括: (1)將外源的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因或其變體轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞、組織、器官或種子,獲得轉(zhuǎn)化入所述基因的植物細(xì)胞、組織、器官或種子;和 (2)將步驟(1)獲得的轉(zhuǎn)入了所述基因的植物細(xì)胞、組織、器官或種子再生成植物。
10.如權(quán)利要求9所述的方法,其特征在于,包括: (Si)提供攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌,所述的表達(dá)載體含有外源的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因或其變體;(s2)將植物細(xì)胞、組織、器官或種子與步驟(Si)中的農(nóng)桿菌接觸,從而使外源的細(xì)胞色素P450家族714亞家族基因`或其變體轉(zhuǎn)入植物。
【文檔編號(hào)】C12N15/53GK103865939SQ201310676182
【公開日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2013年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月11日
【發(fā)明者】張洪霞, 王翠亭 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院