一種堿性脂肪酶突變體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種堿性脂肪酶突變體，是氨基酸序列為SEQ?ID?NO：1的脂肪酶第207位氨基酸由Ala變?yōu)镚ln，第252位氨基酸由Gly變?yōu)锳sp，第270位氨基酸由Asn變?yōu)镚ln。本發(fā)明的堿性脂肪酶突變體的最適作用溫度為15℃，且在15-25℃的較低溫條件下仍能保持95%以上的酶活力，比野生型在低溫下的酶活水平更高；所述堿性脂肪酶突變體的最適作用pH值為9.5，且在pH9.0-13.0范圍內(nèi)能保持50%以上的酶活，比野生型在堿性條件下的酶活力更高，其作用pH范圍更為寬泛。
【專利說(shuō)明】一種堿性脂肪酶突變體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于功能基因改造與篩選【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種堿性脂肪酶體變體及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]脂肪酶即三酰基甘油?；饷福艽呋烊坏孜镉椭?，生成脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯。脂肪酶的基本組成單位僅為氨基酸，通常只有一條多肽鏈，它的催化活性僅僅決定于它的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)(Schmid等，1998)。
[0003]堿性脂肪酶是在堿性條件下水解的脂肪酶，生產(chǎn)的主要原料為小麥、玉米等農(nóng)副產(chǎn)物，通過(guò)生物發(fā)酵技術(shù)轉(zhuǎn)化。它可以水解天然油脂，生產(chǎn)脂肪酸和甘油，是一種專門在異相系統(tǒng)油水接口上水解特殊酯類的酶。
[0004]目前堿性脂肪酶主要應(yīng)用于洗滌劑行業(yè)，單獨(dú)或與堿性蛋白酶一起添加在洗滌劑中，作為洗滌劑的一種添加成分，它有助于脂肪油潰和人體皮脂污垢的去除。人們通過(guò)對(duì)織物的污垢進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，由人體皮脂腺分泌的皮脂類污垢約占總污垢的四分之三以上，僅靠表面活性劑和助劑的作用是不能完全去除的，添加于洗滌劑中的脂肪酶可將這些難于除去的脂類物質(zhì)降解為易于出去的物質(zhì)，從而提高洗滌劑的去污效果。1988年，丹麥NoVo公司報(bào)道了堿性脂肪酶在洗滌劑中的應(yīng)用，并將其投入到工業(yè)化生產(chǎn)中。日本獅子油脂公司同年也推出了加脂肪酶的洗衣粉。P&G公司和聯(lián)合利華公司等中外合資公司也推出了含脂肪酶和蛋白酶的高檔洗衣粉，但目前脂肪酶完全依賴進(jìn)口。國(guó)內(nèi)對(duì)堿性脂肪酶的研究起步較晚，在堿性脂肪酶發(fā)酵菌種、提取工藝、酶活性以及顆粒酶制備技術(shù)等方面與國(guó)外的先進(jìn)技術(shù)有很大的差距，急需開發(fā)新的酶學(xué)性質(zhì)優(yōu)良、產(chǎn)量高的堿性脂肪酶，提高洗滌效果，并降低生產(chǎn)成本，從而促進(jìn)堿性脂肪酶的廣泛應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種新型堿性脂肪酶突變體及其應(yīng)用，本發(fā)明通過(guò)定向進(jìn)化技術(shù)對(duì)黑葡萄穗霉(Stachybotrys chartarum)的堿性脂肪酶進(jìn)行突變,篩選到一種耐低溫、耐堿的脂肪酶突變體，并構(gòu)建得到高效表達(dá)該突變體的基因工程菌株，有利于實(shí)現(xiàn)該突變體的工業(yè)化生產(chǎn)和在洗滌領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明一個(gè)方面涉及一種堿性脂肪酶突變體，是氨基酸序列為SEQ ID N0:1的脂肪酶的第207位氨基酸由Ala變?yōu)镚ln，第252位氨基酸由Gly變?yōu)锳sp，第270位氨基酸由Asn變?yōu)镚ln。
[0007]上述脂肪酶突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO:3，其編碼基因的核酸序列為SEQID NO:4。
[0008]本發(fā)明另一方·面涉及攜帶有編碼序列為SEQ ID NO:4的脂肪酶突變體基因的重組質(zhì)粒。
[0009]本發(fā)明還涉及一種工程菌株，其攜帶有上述重組質(zhì)粒。[0010]所述工程菌株為畢赤酵母(Pichia pastoris)。
[0011]本發(fā)明還涉及上述堿性脂肪酶突變體在洗滌劑中的應(yīng)用。
[0012]本發(fā)明提供了一種堿性脂肪酶突變體，并通過(guò)構(gòu)建畢赤酵母工程菌高效體外表達(dá)該脂肪酶突變體，發(fā)酵酶活高達(dá)1697U/mL。本發(fā)明所述堿性脂肪酶突變體的最適作用溫度為15°C，且在15-25°C的較低溫條件下仍能保持95%以上的酶活力，比野生型在低溫下的酶活水平更高；所述堿性脂肪酶突變體的最適作用PH值為9.5，且在pH9.0-13.0范圍內(nèi)能保持50%以上的酶活，比野生型在堿性條件下的酶活力更高，其作用pH范圍更為寬泛。本發(fā)明所述堿性脂肪酶突變體在低溫、堿性條件下酶活水平高的特性，特別適合應(yīng)用于洗滌領(lǐng)域。通過(guò)在洗滌劑中添加本發(fā)明所述堿性脂肪酶突變體，能顯著提高污布的白度，且在低溫和堿性條件下效果更好，因此本發(fā)明提供的堿性脂肪酶突變體具有更廣闊的市場(chǎng)空間。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0013]圖1:為畢赤酵母Lip3404和畢赤酵母Lip-15發(fā)酵上清液SDS-PAGE電泳分析圖，其中箭頭所指34kD處為重組表達(dá)的堿性脂肪酶。
[0014]圖2:為本發(fā)明堿性脂肪酶突變體與野生型的最適作用pH比較圖。
[0015]圖3:為本發(fā)明堿性脂肪酶突變體與野生型的最適作用溫度比較圖。
【具體實(shí)施方式】
[0016]以下實(shí)施例是為了更好地說(shuō)明闡述本
【發(fā)明內(nèi)容】
，本領(lǐng)域相關(guān)的技術(shù)人員可以借助實(shí)施例更好地理解和掌握本發(fā)明。
[0017]實(shí)施例1堿性脂肪酶基因的合成與擴(kuò)增
[0018]使用真菌基因組DNA提取試劑盒(Omega)從黑葡萄穗霉過(guò)夜培養(yǎng)物中提取基因組DNA。
[0019]以黑葡萄穗霉基因組DNA為模板擴(kuò)增黑葡萄穗霉中的堿性脂肪酶基因Lip3404，其中所用到的正向引物F序列為(下劃線所示序列為EcoRI酶切位點(diǎn))；
[0020]5' -CG GAATTC GCTCCTCTGAGCGCTACAG-3'，
[0021]反向引物R序列為(下劃線所示序列為NotI酶切位點(diǎn)):
[0022]5' -TAAAGCGGCCGCTTAAGCAGCA GGAGCAGCAG-3,
[0023]將該基因用Phusion DNA聚合酶(Thermo scientific)從黑葡萄穗霉基因組DNA中擴(kuò)增出來(lái)。
[0024]使用凝膠純化試劑盒(Fermentas)將上述PCR產(chǎn)物純化。用限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI(Fermentas)對(duì)純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切；同時(shí)，用限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI對(duì)質(zhì)粒pPIC9K進(jìn)行酶切。使用凝膠純化試劑盒將酶切產(chǎn)物純化，并用T4DNA連接酶(Fermentas)將上述兩個(gè)酶切產(chǎn)物連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)Trans5 α大腸桿菌(Transgen),用氨節(jié)青霉素進(jìn)行選擇。為確保準(zhǔn)確,對(duì)若干克隆進(jìn)行測(cè)序(Invitrogen)。測(cè)序結(jié)果顯示，黑葡萄穗霉中堿性脂肪酶Lip3404的基因序列為SEQ ID N0:2，其編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO:1。
[0025]使用質(zhì)粒中量制備試劑盒(Axygen)從測(cè)序結(jié)果正確的大腸桿菌克隆中純化質(zhì)粒。所得I個(gè)重組質(zhì)粒為pPIC9K-Lip3404。[0026]為了改善堿性脂肪酶Lip3404的低溫耐受性， 申請(qǐng)人:通過(guò)定向進(jìn)化技術(shù)對(duì)該酶進(jìn)行了大量突變的篩選，設(shè)計(jì)PCR引物L(fēng)ip-FULip-Rl如下:
[0027]Lip-Fl:GGCGAATTC GCTCCTCTGAGCGCTACAG (下劃線為限制性內(nèi)切酶 EcoRI 識(shí)別位點(diǎn))
[0028]Lip-Rl:ATAGCGGCCGCTTAAGCAGCA GGAGCAGCAG (下劃線為限制性內(nèi)切酶 NotI 識(shí)別位點(diǎn))
[0029]以SEQ ID NO: 2為模板，以上述引物用GeneMorph 11隨機(jī)突變PCR試劑盒(Stratagene)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，膠回收PCR產(chǎn)物，EcoR1.Notl進(jìn)行酶切處理后與經(jīng)同樣酶切后的pET21a載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)中，涂布于LB+Amp平板，37°C倒置培養(yǎng)，待轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)后，用牙簽逐個(gè)挑至96孔板，每個(gè)孔中加入150ul含有0.1mM IPTG的LB+Amp培養(yǎng)基，370C 220rpm培養(yǎng)6h左右，離心棄上清，菌體用緩沖液重懸，反復(fù)凍融破壁，獲得含有堿性脂肪酶的大腸桿菌細(xì)胞裂解液。
[0030]分別取出30ul裂解液至兩塊新的96孔板，分別在10°C下測(cè)定其脂肪酶酶活。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有些突變對(duì)脂肪酶的低溫耐受性沒有影響，有些突變甚至使其低溫耐受性降低了，對(duì)在10°C下依然保持高活性的突變子進(jìn)行DNA測(cè)序，最終， 申請(qǐng)人:獲得了能提高脂肪酶低溫耐受性的突變組合A207Q，G252D和N270Q。
[0031]含A207Q，G252D和N270Q三點(diǎn)突變的脂肪酶突變體，其氨基酸序列為SEQ ID NO:3，編碼核苷酸序列為SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:4由上海捷瑞生物公司合成。
[0032]將合成的脂肪酶突變體基因命名為L(zhǎng)ip-15，用引物L(fēng)ip-Fl、Lip-Rl進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物兩端引入EcoR 1、Not I位點(diǎn)。PCR反應(yīng)條件為:94°C變性5min;然后94°C變性30s，56°C復(fù)性30s，72°C延伸lmin，30個(gè)循環(huán)后，72°C保溫lOmin。
[0033]使用凝膠純化試劑盒(Fermentas)將上述PCR產(chǎn)物純化。用限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI(Fermentas)對(duì)純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切；同時(shí)，用限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI對(duì)質(zhì)粒pPIC9K進(jìn)行酶切。使用凝膠純化試劑盒將酶切產(chǎn)物純化，并用T4DNA連接酶(Fermentas)將上述兩個(gè)酶切產(chǎn)物連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)Trans5 α大腸桿菌(Transgen),用氨節(jié)青霉素進(jìn)行選擇。為確保準(zhǔn)確,對(duì)若干克隆進(jìn)行測(cè)序(Invitrogen)。
[0034]使用質(zhì)粒中量制備試劑盒(Axygen)從測(cè)序結(jié)果正確的大腸桿菌克隆中純化質(zhì)粒。所得I個(gè)重組質(zhì)粒為pPIC9K-Lip-15。
[0035]實(shí)施例2畢赤酵母工程菌的構(gòu)建與篩選
[0036]將重組質(zhì)粒pPIC9K-Lip_15用SalI酶切，電泳鑒定后，經(jīng)乙醇沉淀濃縮，測(cè)定DNA濃度，以3μ8/μ L濃度稀釋質(zhì)粒片段保存?zhèn)溆谩Ｖ苽洚叧嘟湍窯Sl 15電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，最后重懸于ImL預(yù)冷的電泳緩沖液中(含ImM MgCl2, IOmM HEPES, 250mM蔗糖，pH7.8)。在80 μ L感受態(tài)細(xì)胞中加入5 μ L線性化重組質(zhì)粒；電轉(zhuǎn)化(條件為1500V、200 Ω、25 μ F);最后涂布于MM平板(麗培養(yǎng)基組分:1.34%YNB，4X10-5%生物素，0.5%甲醇)，得到重組轉(zhuǎn)化子。
[0037]用適量無(wú)菌水將MM板上的重組轉(zhuǎn)化子清洗下來(lái)，轉(zhuǎn)接到含有l(wèi)mg/mLG418(抗生素)的液體YPD培養(yǎng)基(1%酵母提取物，2%蛋白陳，2%葡萄糖)中，生長(zhǎng)兩天后轉(zhuǎn)接4mg/mL G418的液體YPD培養(yǎng)基中，最后將培養(yǎng)基中G418的濃度升至8mg/mL ;將獲得的高拷貝轉(zhuǎn)化子于YPD平板上劃線，培養(yǎng)， 挑取單菌落；將其中一株工程菌命名為畢赤酵母Lip-15 (Pichiapastoris Lip-15)。[0038]通過(guò)上述同樣的酶切連接方法將野生型堿性脂肪酶Lip3404克隆到畢赤酵母GS115宿主中，構(gòu)建得到重組表達(dá)野生型脂肪酶的畢赤酵母工程菌，命名為畢赤酵母Lip3404 (Pichia pastoris Lip3404)o
[0039]實(shí)施例3搖瓶誘導(dǎo)表達(dá)及酶活測(cè)定
[0040]將所得的畢赤酵母工程菌Lip-15和畢赤酵母Lip3404接種于5mL BMGY (I %酵母提取物，2%蛋白陳，1.34%YNB, 4X10-5%生物素，1%甘油)，30°C培養(yǎng)過(guò)夜，離心收集菌體，把菌體加入50ml BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基(I %酵母提取物，2 %蛋白陳，1.34%YNB, 4X 10-5%生物素，0.5%甲醇)，每12小時(shí)補(bǔ)加120 μ L甲醇；離心去除菌體，得到發(fā)酵上清液；將上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)分析，結(jié)果如圖1所示，箭頭所指處即為目的蛋白條帶，分子量大小約為34kDa，與本發(fā)明所述脂肪酶的理論分子量大小一致。說(shuō)明本發(fā)明構(gòu)建的畢赤酵母工程菌Lip-15和畢赤酵母Lip3404均能重組表達(dá)所述堿性脂肪酶。
[0041](I)堿性脂肪酶活性單位定義
[0042]在30°C、pH值為8.0的條件下，每分鐘從濃度為6%對(duì)硝基苯酚-棕櫚酸酯的溶液中降解釋放I微摩爾對(duì)硝基酚所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位U。
[0043](2)酶活測(cè)定方法
[0044]取四支15*150試管(一支空白管，三支樣品管)，分別向四支管中，準(zhǔn)確加入底物
2.7mL ;將四支試管同時(shí)置于30±0.1°C水浴中，預(yù)熱5min ;取稀釋好的酶液，30±0.1°C水浴中。C預(yù)熱5min ;準(zhǔn)確向空白試管中加入0.3mL緩沖液,迅速潤(rùn)旋混合,將混合液倒入Icm比色皿中，作為空白在400nm下調(diào)零；準(zhǔn)確向樣品試管中加入0.3mL酶液，此時(shí)開始計(jì)時(shí)并迅速渦旋混合、倒入比色皿，400nm下記錄吸光值變化，每0.5min讀取一次數(shù)值，即讀取
0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5min,共10次數(shù)據(jù)。取I~5min內(nèi)的測(cè)定值，用來(lái)繪制曲線。
[0045]酶活的計(jì)算:
【權(quán)利要求】
1.一種堿性脂肪酶突變體，其特征在于，所述的堿性脂肪酶突變體是氨基酸序列為SEQID NO:1的脂肪酶的第207位氨基酸由Ala變?yōu)镚ln，第252位氨基酸由Gly變?yōu)锳sp，第270位氨基酸由Asn變?yōu)镚in。
2.如權(quán)利要求1所述的堿性脂肪酶突變體，其特征在于所述的脂肪酶突變體的氨基酸序列為 SEQ ID NO:3o
3.一種基因，其特征在于，所述的基因用于編碼權(quán)利要求1或2所述的堿性脂肪酶突變體。
4.如權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于，所述基因的核酸序列為SEQID Ν0:4。
5.一種重組質(zhì)粒，其特征在于，所述的重組質(zhì)粒及攜帶有權(quán)利要求3所述的基因。
6.一種工程菌株，其特征在于，所述的工程菌株其攜帶有權(quán)利要求5所述的重組質(zhì)粒。
7.如權(quán)利要求6所述的工程菌株，其特征在于，所述工程菌株為畢赤酵母。
8.權(quán)利要求1所述的`堿性脂肪酶突變體在洗滌劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/81GK103667207SQ201310717314
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月23日
【發(fā)明者】黃亦鈞, 許麗紅, 許韡, 徐娟, 王華明 申請(qǐng)人:青島蔚藍(lán)生物集團(tuán)有限公司