專利名稱：一種新型脂肪酶抑制劑的制作方法
肥胖是一種世界范圍的常見病，隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生活水平的不斷提高，發(fā)病率日益上升。肥胖能引起多種代謝異常，是糖尿病與心血管疾病的主要危險(xiǎn)因素之一，并與心血管疾患的發(fā)病率與死亡率增高有關(guān)。傳統(tǒng)上基于飲食和運(yùn)動(dòng)對(duì)肥胖癥的非藥物治療的長(zhǎng)期療效往往十分有限。在藥物治療中，中藥制劑目前尚無療效確切的品種，國(guó)外的芬氟拉明與右旋芬氟拉明因出現(xiàn)超聲心動(dòng)圖下可見的瓣膜病變，該兩藥已于1997年撤出市場(chǎng)。1998年問世的食欲抑制劑西布曲明(sibutramine)是5-羥色胺和去甲腎上腺素再攝取的抑制劑，它主要作用于神經(jīng)系統(tǒng)，使人產(chǎn)生厭食，從而通過減少營(yíng)養(yǎng)來達(dá)到減肥目的。該藥可能引起患者血壓升高、心率加快，且不能應(yīng)用于具有冠心病、心率失常和卒中等病史的患者中，而使該藥的應(yīng)用受到了限制(Stone NJ et al.Med Clin North Am，2000，8495～102)。肥胖的發(fā)生，除肥胖基因(Ob)基因的調(diào)控之外，主要是脂肪酶的作用。特別是胰脂肪酶，作用部位在胃腸道。該酶可以先將攝入的脂肪乳化成極小的脂肪球，然后將其轉(zhuǎn)化成游離脂肪酸和甘油三油酸酯，它們與膽鹽相結(jié)合，形成膠束，膠束穿透腸壁細(xì)胞膜，攝入體內(nèi)堆積成脂肪組織。本發(fā)明的脂肪酶抑制劑可以抑制脂肪酶的活性，使脂肪不轉(zhuǎn)化、吸收，直接從糞便中排出。它是一種新型減少營(yíng)養(yǎng)吸收劑，作用于胃腸道，為胰腺酶和其他脂肪酶抑制劑，主要阻止脂肪酶的催化分解，抑制由飲食攝入的1/3的脂肪吸收。適用于肥胖癥，包括健康肥胖者及有II型(非胰島素依賴性)糖尿病的肥胖者。
本發(fā)明的新穎性在于①一種具有高度選擇性、長(zhǎng)效的胃腸道脂肪酶抑制劑，與胃和胰腺中脂肪酶活性位點(diǎn)的絲氨酸殘基共價(jià)鍵合，從而阻斷脂肪和水的吸收，不影響神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道的其他酶活性。②該脂肪酶抑制劑是由鏈霉菌屬微生物經(jīng)誘變育種，發(fā)酵產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，為一種脂肪酶的抑制劑，而非化學(xué)合成化合物。③該種脂肪酶抑制劑與其他減肥藥不同，它不作用于神經(jīng)系統(tǒng)，對(duì)心血管無不良影響。④該酶作用于胃腸道，但不被胃腸道吸收。本發(fā)明的脂肪酶抑制劑是通過抑制脂肪酶活性達(dá)到減肥的目的。
實(shí)施例1、菌種出發(fā)菌株為由土壤中分離的鏈霉菌屬的丁香鏈霉菌(Streptomvcessyringae)，經(jīng)紫外線誘變育種，得到的高產(chǎn)變異菌株作為出發(fā)菌種，保存在瓊脂斜面培養(yǎng)基上。瓊脂斜面培養(yǎng)基的成分為可溶性淀粉10g，KNO32g，NaCl 2g，K2HPO4·7H2O，MgSO4·7H2O 50mg，CaCO320mg，F(xiàn)eSO4·7H2O 10mg，瓊脂20g，蒸餾水加至1L，pH7.0。
2、搖瓶種子培養(yǎng)搖瓶種子培養(yǎng)基成分為脫脂大豆粉10g，甘油10g，酵母浸膏5g，加水至1L，調(diào)pH7.0。滅菌后，取100ml裝入500ml搖瓶，塞上棉塞后再次滅菌。用鉑環(huán)接種Streptomvces syringae斜面菌種的孢子，28℃下通氣培養(yǎng)24h。
3、二級(jí)種子培養(yǎng)將搖瓶種子培養(yǎng)基100ml接種至裝有25L生產(chǎn)培養(yǎng)基的50L發(fā)酵罐內(nèi)。生產(chǎn)培養(yǎng)基的成分為每升含脫脂大豆粉32g，甘油20g，蛋白胨2g，核糖10g，(NH4)2SO42g，聚乙二醇0.25ml(作為消泡劑)，調(diào)pH7.4，28℃下培養(yǎng)72h，通氣量0.5vvm。
4、中試發(fā)酵培養(yǎng)將25L二級(jí)種子培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入裝有500L生產(chǎn)培養(yǎng)基的1噸發(fā)酵罐內(nèi)，于28℃下，通氣量0.5vvm，發(fā)酵96h。放罐后使發(fā)酵液冷卻至2℃，離心收集菌絲體，于-20℃下冷凍保存。
5、粗提菌絲體于4℃下融化，加2倍量甲醇機(jī)械磨碎勻漿處理30min，抽濾，濾餅再用等量甲醇勻漿30min，抽濾，合并濾液。使之濃縮至原體積的1/3，加1倍量水稀釋。然后用等量的己烷-乙酸乙酯(1∶1)提取3次(第2次和第3次提取時(shí)各用NaCl破乳化)，最后用乙酸乙酯提取。合并有機(jī)提取液，減壓濃縮，通過無水硫酸鈉干燥，真空干燥，得淺棕色油狀物，為粗品I。
6、3步層析純化用Merck硅膠60 1kg填裝快速層析柱10×100cm。第1步上樣量為粗品I 100g，用氯仿洗脫，得到粗品II約70g。第2步上樣粗品II 35g，用己烷-乙酸乙酯梯度(9∶1～4∶1)洗脫，得粗品III約4g。第3步用逆向色譜柱純化，用甲醇洗脫，得標(biāo)的脂肪酶抑制劑純品約1.8g。
7、脂肪酶抑制劑對(duì)飲食脂肪吸收的抑制試驗(yàn)選用昆明小鼠(♀)40只，隨機(jī)分成2組，每組20只。禁食過夜，插管灌服液體試餐，試餐含有3H標(biāo)記的甘油三油酸酯(10％)和14C標(biāo)記的油酸(10％)，葡萄糖(28％)，淀粉(32.8％)和脫脂奶粉(14％)的生理鹽水溶液。每只小鼠灌服試餐0.25ml。然后將本發(fā)明制得的脂肪酶抑制劑加入含有5％阿拉伯膠和5％脫脂奶粉的溶液中，每只小鼠灌服0.5ml(n＝20)。對(duì)照組(n＝20)除不給脂肪酶抑制劑外，其余相同。之后的飼養(yǎng)如常。分別收集每只小鼠的3天糞便并使之干燥。通過干糞燃燒經(jīng)閃爍記數(shù)測(cè)定3H和14C放射性，計(jì)算食入和排除的[3H]三油酸酯和[14C]油酸吸收的百分?jǐn)?shù)，以此評(píng)價(jià)脂肪酶抑制劑對(duì)脂肪酶活性的抑制效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，脂肪酶抑制劑可以抑制1/3(胰)脂肪酶的活性，使得1/3飲食脂肪不被吸收，直接經(jīng)消化道由糞便排除。
權(quán)利要求
1.一種脂肪酶抑制劑，其特征在于由鏈霉菌屬微生物發(fā)酵產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，該產(chǎn)物可以抑制脂肪酶尤其是胰脂肪酶的活性，減少飲食脂肪的轉(zhuǎn)化吸收，從而達(dá)到減肥的目的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1，微生物為鏈霉菌屬的S.syringae、S.goshikiensis、S.toxytricini等。經(jīng)紫外線或化學(xué)方法誘變育種，篩選高產(chǎn)菌株作為出發(fā)菌種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1，其特征在于該脂肪酶抑制劑作用部位在胃腸道，抑制脂肪酶尤其胰脂肪酶的活性，致使飲食脂肪的1/3不轉(zhuǎn)化為游離脂肪酸和甘油三油酸酯，使其不被吸收并直接由腸道排出體外。
全文摘要
本發(fā)明提供一種新型胃腸道脂肪酶抑制劑，它是一種由鏈霉菌屬微生物經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，具有高度選擇性地抑制脂肪酶尤其是胰脂肪酶的活性，在胃腸道中使1/3的飲食脂肪不被脂肪酶催化分解轉(zhuǎn)化為游離脂肪酸和甘油三油酸酯，不被胃腸吸收。這種獨(dú)特的作用機(jī)制，使其有望成為新的減肥藥物。
文檔編號(hào)A61P3/00GK1391906SQ0211724
公開日2003年1月22日 申請(qǐng)日期2002年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月22日
發(fā)明者閻家麒 申請(qǐng)人:江蘇佩沃特生物基因工程有限公司, 閻家麒, 金尚明