一種以中性脂肪為底物生物合成順式-3-己烯醇的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種以中性脂肪為底物生物合成順式-3-己烯醇的方法，屬于生物工程領域。本發(fā)明在以中性脂肪為底物生產C3H的過程中，通過在酵母細胞中表達可分泌到胞外的脂肪酶基因或者直接加入商業(yè)化的脂肪酶，首先實現以中性脂肪為原料生產C3H。本發(fā)明的技術方案克服了亞麻酸對宿主細胞有毒，而且價格昂貴的問題，具有工業(yè)化應用前景。
【專利說明】—種以中性脂肪為底物生物合成順式-3-己烯醇的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種以中性脂肪為底物生物合成順式-3-己烯醇的方法，屬于生物工程領域。
【背景技術】
[0002]順式-3-己烯醇(C3H, cis-3-hexen-l-ol),又名順式-3-己烯_1_醇、葉醇,是一種無色油狀液體，具有強烈的剛被修割過的綠色草地和葉子的氣味。大多數植物能夠少量合成順式-3-己烯醇用于引誘許多捕食性昆蟲。當植物遭遇機械損傷或者食草動物捕食時,會產生順式-3-己烯醇作為一種“呼救”信號分子來引誘食草動物的天敵-捕食性昆蟲。順式-3-己烯醇作為一種重要的芳香化合物應用于果蔬香料和香水。然而，由于順式-3-己烯醇在植物中的含量低，相應地，天然順式-3-己烯醇的價格很昂貴，順式-3-己烯醇的年產量約為30噸。
[0003]在植物中，順式-3-己烯醇是以α -亞麻酸為底物先后經脂肪氧合酶(LOX)、脂氫過氧化物裂解酶(HPL)和乙醇脫氫酶(ADH)這3種酶作用生成。從20世紀90年代開始，編碼這些酶的基因已經相繼從多種植物中克隆得到，為在微生物(如大腸桿菌和酵母)中異源表達這些基因產C3H創(chuàng)造了可能。
[0004]合成C3H的關鍵酶之一是脂肪氧合酶。脂肪氧合酶是一類含鐵酶，能夠催化含有順式，順式-1，4-戊二烯結構(如α -亞麻酸)的脂質中的多元不飽和脂肪酸發(fā)生雙加氧。它催化的反應如下:脂肪酸+O2=脂肪酸過氧化氫物。脂肪酸過氧化氫物是許多重要激素(如前列腺素類、脂氧素、茉莉酸、創(chuàng)傷激素)以及上文提到的香料/香氣物質(如C3H、1_辛烯-3-醇)的前體。
[0005]C3H合成過程中的第二個酶是脂氫過氧化物裂解酶。當存在亞麻酸過氧化氫物底物時，脂氫過氧化物裂解酶會催化亞麻酸過氧化氫物生成順式-3-己烯醛，再由乙醇脫氫酶將順式-3-己烯醛轉化為C3H。`
[0006]α-亞麻酸(ALA)是種子(如芡歐鼠尾草、亞麻籽、堅果(值得注意的是核桃)以及多種常見植物油)的必要Ω-3脂肪酸和有機化合物。從結構的角度，α-亞麻酸被命名為全-順式-9，12，15-十八碳三烯酸。在生理學文獻中，α-亞麻酸被命名為18:3 (η_3)。α -亞麻酸是一種具有18碳碳鏈和3個順式雙鍵的羧酸。其中，第一個雙鍵位于從甲基末端(即η末端)起第三個碳，因此，α-亞麻酸是一種多元不飽和η-3 (Ω-3)脂肪酸，是多元不飽和η-6 (Ω-6)脂肪酸，即Y-亞麻酸的異構體。
[0007]然而，游離脂肪酸，如α -亞麻酸，不但昂貴還對微生物具有毒性，使得目前的生物技術合成從經濟和生物學角度變得不可行。而另一方面，甘油三酯或其他中性脂質則價格便宜且對微生物沒有毒害作用。甘油三酯由甘油和3個脂肪酸合成得到，甘油三酯是多種多樣的，根據油的來源，有的甘油三酯是高度不飽和的，有的不飽和度低。飽和化合物是指氫飽和，即碳原子中所用能結合氫原子的位置都結合上了氫原子。
[0008]但面包酵母由于缺乏胞外脂肪酶不能從甘油三酯中釋放出游離C18:3，從而不能直接利用中性脂質來生成C3H。因此，開發(fā)一種新的在合成C3H的過程中不影響微生物細胞(如細菌和酵母)存活的C3H生物合成方法十分必要。

【發(fā)明內容】

[0009]本發(fā)明要解決技術問題是提供一種以中性脂肪為底物生物合成順式-3-己烯醇的方法，是以脂肪酶輔助過量表達脂肪氧合酶和脂氫過氧化物裂解酶的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)WATlI,以中性脂肪為原料生產 C3H。
[0010]所述中性脂肪是C18:3酯或亞麻油。C18:3酯是α-亞麻酸甲酯、α-亞麻酸乙酯、α-亞麻酸甘油三酯中的一種或者多種的組合。亞麻油可以是來源于芡歐鼠尾草、獼猴桃籽、紫蘇、亞麻、越橘、薺、馬齒覓、沙棘、大麻、油菜籽或大豆中的一種或幾種的組合。
[0011]所述脂肪酶源自皺褶假絲酵母。還可以是源自豬胰、皺褶假絲酵母、麥芽或雪白根霉中的一種或幾種的組合。所述脂肪酶的基因是來自豬胰、麥芽或雪白根霉的脂肪酶基因。
[0012]編碼所述脂肪氧合酶(LoxD-TP)的基因序列如SEQ ID N0.5所示，將LoxD-TP基
因擴增產物用pCR?8/GW/T0P0? TA克隆試劑盒處理，將基因導入Gateway?重組克隆載體
T D O
[0013]編碼所述脂氫過氧化物裂解酶(HPL)的基因序列如SEQ ID N0.3所示。
[0014]所述LoxD-TP和HPL 基因分別通過LR反應克隆進入酵母表達載體pAG424GPD_ccdB 和 pAG425GPD_ccdB (Life Technologies)并用于轉化 S.cerevisiaeWATllo
[0015]所述釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) WATll的構建方法參照文獻UrbanP, Mignotte C，Kazmaier M, Delorme F，Pompon D (1997)Cloning, yeast expression, andcharacterization of the coupling of two distantly related Arabidopsis thalianaNADPH-cytochrome P450reductases with P450CYP73a5.J Biol Chem272 (31): 19176-19186 中該細胞的構建方法。
[0016]所述以脂肪酶輔助生產C3H可通過兩種方式實現，以中性脂肪為底物，外源添加脂肪酶或過量表達編碼脂肪酶的基因:
[0017](I)外源添加脂肪酶
[0018]培養(yǎng)收集過量表達LoxD-TP和HPL基因的S.cerevisiae WATlI，培養(yǎng)收集過量表達脂肪氧合酶和脂氫過氧化物裂解酶基因的S.cerevisiae WATlI，將細胞重新懸浮在IOOmM pH6.8的磷酸緩沖液中得到細胞懸浮液，然后，添加中性脂肪和脂肪酶反應生成C3H。
[0019]所述細胞懸浮液OD6qq=IO。
[0020]所述脂肪酶來源于皺裙假絲酵母(Candida rugosa),購自Sigma公司，產品號L1754，添加量是 3mg/10mL。
[0021]所述中性脂肪是終濃度(v/v)為0.5%的亞麻油或5%的亞麻油或0.1%的甲酯亞麻酸或0.1%的乙酯亞麻酸。
[0022](2)過量表達脂肪酶基因LIP2
[0023]是將序列如SEQ ID N0.4所示的脂肪酶基因克隆進入酵母表達載體pAG423GPD-ccdB,并轉化進入已過量表達脂肪氧合酶和脂氫過氧化物裂解酶基因的
S.cerevisiae WATll中；培養(yǎng)重組菌，將細胞重新懸浮在IOOmM pH6.8的磷酸緩沖液中得到細胞懸浮液，然后，添加中性脂肪到反應體系，反應生成C3H。
[0024]所述細胞懸浮液OD6qq=IO。
[0025]所述中性脂肪是終濃度(v/v)為2%的亞麻油或0.05%的甲酯亞麻酸或0.1%的甲酯亞麻酸或0.05%的乙酯亞麻酸或0.1%的乙酯亞麻酸。
[0026]本發(fā)明要解決的第二個技術問題是提供一株酵母基因工程菌，是以釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) WATll為宿主，表達基因序列如SEQ ID N0.5所示的脂肪氧合酶和基因序列如SEQ ID N0.3所示的脂氫過氧化物裂解酶。更具體地，是將編碼所述脂肪氧合酶和脂氫過氧化物裂解酶的基因分別通過LR反應克隆進入酵母表達載體pAG424GPD-ccdB 和 pAG425GPD_ccdB，并轉化 S.cerevisiae WATlI。
[0027]應用所述酵母基因工程菌生產C3H的方法，是培養(yǎng)收集過量表達LoxD-TP和HPL基因的S.cerevisiae WATlI，培養(yǎng)收集過量表達脂肪氧合酶和脂氫過氧化物裂解酶基因的
S.cerevisiae WATlI，將細胞重新懸浮在IOOmM pH6.8的磷酸緩沖液中得到細胞懸浮液，然后，添加中性脂肪和脂肪酶反應生成C3H。
[0028]所述細胞懸浮液OD6tltl=IO。所述脂肪酶來源于皺裙假絲酵母(Candida rugosa),購自Sigma公司，產品號L1754，添加量是3mg/10mL。所述中性脂肪是終濃度(v/v)為0.5%的亞麻油或5%的亞麻油或0.1%的甲酯亞麻酸或0.1%的乙酯亞麻酸。
[0029]本發(fā)明要解決的第三個技術問題是提供一株酵母基因工程菌，是以釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) WATll為宿主,表達基因序列如SEQ ID N0.5所示的脂肪氧合酶、基因序列如SEQ ID N0.3所示的脂氫過氧化物裂解酶和基因序列如SEQ ID N0.4所示的脂肪酶。更具體地，是將編碼所述脂肪氧合酶、脂氫過氧化物裂解酶和脂肪酶的基因分別通過 LR 反應克隆進入酵母表達載體 pAG424GPD-ccdB、pAG425GPD-ccdB 和 pAG423GPD_ccdB，并轉化 S.cerevisiae WAT11 ?
[0030]應用所述酵母基因工程菌生產C3H的方法，是培養(yǎng)重組菌，將細胞重新懸浮在100mMpH6.8的磷酸緩沖液中得到細胞懸浮液，然后，添加中性脂肪到反應體系，反應生成C3H。
[0031]所述細胞懸浮液0D_=10。所述中性脂肪是終濃度(v/v)為2%的亞麻油或0.05%的甲酯亞麻酸或0.1%的甲酯亞麻酸或0.05%的乙酯亞麻酸或0.1%的乙酯亞麻酸。
[0032]目前C3H的工業(yè)化生產以游離亞麻酸為原料，而亞麻酸對宿主細胞有毒，而且價格昂貴。本發(fā)明通過在酵母細胞中表達可分泌到胞外的脂肪酶基因或者直接向反應體系中加入商業(yè)化的脂肪酶，首先實現以中性脂肪為原料生產C3H，具有工業(yè)化應用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1是順式-3-己烯醇的結構式。
[0034]圖2是亞麻酸的結構式。
[0035]圖3是C3H的生物合成過程。
[0036]圖4是經基因改造的過量表達LoxD_TP、HPL、Lip2的S.cerevisiae Watll細胞以0.1%的游離亞麻酸或2%的亞麻油為底物生產C3H。
[0037]圖5是經基因改造的過量表達LoxD-TP、HPL的S.cerevisiae Watll細胞生產C3H ；CK:以0.2%的C18:3為底物生產C3H ；P0.5:以0.5%亞麻油為底物及來自豬胰的脂肪酶生產C3H ；C0.5:以0.5%亞麻油為底物及來自皺褶假絲酵母的脂肪酶生產C3H ；W0.5:以
0.5%亞麻油為底物及來自麥芽的脂肪酶生產C3H ；R0.5:以0.5%亞麻油為底物及來自麥芽的脂肪酶生產C3H ;P5:以5%亞麻油為底物及來自豬胰的脂肪酶生產C3H ;C5:以5%亞麻油為底物及來自皺褶假絲酵母的脂肪酶生產C3H ；W5:以5%亞麻油為底物及來自麥芽的脂肪酶生產C3H ;R5:以5%亞麻油為底物及來自麥芽的脂肪酶生產C3H。
[0038]圖6是經基因改造的過量表達LoxD-TP、HPL、Lip2的S.cerevisiae Watll細胞以C18:3、甲酯亞麻酸或乙酯亞麻酸為底物生產C3H ；CK:0.1%的C18:3 ;ΜΕ_0.05:0.05%的甲酯亞麻酸；ME-0.1:0.1%的甲酯亞麻酸；ΕΤ-0.05:0.05%的乙酯亞麻酸;ΕΤ_0.1:0.1%的乙
酯亞麻酸。
[0039]圖7是經基因改造的過量表達LoxD-TP和HPL的S.cerevisiae Watll細胞生產C3H的產量；CK-0.1:代表飼喂0.1%游離亞麻酸；ΜΕ-0.1及ΕΤ-0.1:分別代表飼喂0.1%甲酯亞麻酸或乙酯亞麻酸；ME+LP及ET+LP，分別代表添加來自皺褶假絲酵母的脂肪酶并同時飼喂0.1%甲酯亞麻酸或乙酯亞麻酸。【具體實施方式】
[0040]實施例1以表達LoxD、HLP基因的面包酵母WATll生產C3H
[0041](I)表達載體的構建
[0042]Lox 基因(Lycopersicon esculentum, GenBank:U37840)序列如 SEQ ID N0.1 所示，將Lox基因基于酵母基因組密碼子進行優(yōu)化后得到LoxD基因，序列如SEQ ID N0.2所示，將該基因連接到pUC57載體(GenScript USA Inc.，Piscataway, NJ, USA),得到重組載體pUC57-LoxD。
[0043]LoxD-TP基因序列如SEQ ID N0.5所示，是通過PCR從pUC57_LoxD載體上擴增得到，所用引物為 LoxD-TPF:ATGATTTCAGAAAACTTGGTTAA 和 LoxD-R:CTAGATGGAAACACTATTAGGA。LoxD-TP基因缺失5’端174個堿基，編碼由58個氨基酸組成的葉綠體定位序列，將LoxD-TP基因擴增產物克隆進pCR?少GW/TOPO? TA克隆載體(LifeTechnologies)。
[0044]HPL基因的序列如SEQ ID N0.3所示，是基于GenBank:AF230372設計引物，HPL-F:atgaattctgctcctctatcaa 和 HPL-R:tcaactagcctttttcacagatgtga,提取西紅柿葉片 RNA(Solanum lycopersicum Moneymaker),通過 RT-PCR 獲得 HPL 基因。
[0045]將LoxD-TP和HPL基因分別通過LR反應克隆進入酵母表達載體pAG424GPD_ccdB和 pAG425GPD_ccdB (Life Technologies)并用于轉化 S.cerevisiae WAT11。轉化發(fā)方法見文獻(Chen DC, Yang BC, Kuo TT.0ne-step transformation of yeast in stationaryphase.Current Genetics.1992,21:83-84)。
[0046]釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) WATll 的構建方法參照文獻 UrbanP, Mignotte C，Kazmaier M, Delorme F，Pompon D (1997)Cloning, yeast expression, andcharacterization of the coupling of two distantly related Arabidopsis thalianaNADPH-cytochrome P450reductases with P450CYP73a5.J Biol Chem272 (31): 19176-19186。
[0047](2)重組菌的篩選及C3H的轉化合成
[0048]將所得同時過量表達LoxD-TP和HPL基因的S.cerevisiaeffATll在缺失Trp和Leu的合成培養(yǎng)基(SD-Trp-Leu，美國Clontech公司生產)中選育及生長。在30°C、225轉/分鐘的搖床培養(yǎng)兩天后，3000轉離心5分鐘收集細胞，將細胞重新懸浮在IOOmM pH6.8的磷酸緩沖液中至濃度0D_=10，然后，添加0.1%游離亞麻酸(溶解于95%酒精)到反應體系用于C3H的生產，于30°C、225rpm的搖床反應生成C3H。在不同時間點取2ml反應液加入2mlMTBE (Methyl tert-butyl ether)振蕩萃取 C3H。有機相用于 GC/MS 測定 C3H 含量，GC/MS分析采用Shimadzu GC-2010系統(tǒng)，該系統(tǒng)帶有GCMS-QP2010S檢測器，分析柱為:Rtx_5MS(Thickness0.25u; length30m; diameter0.25mm),進樣溫度 265°C，進樣模式為 split,爐溫50°C，溫度梯度:0-4min50°C>4-7.3min50°C -100。。，梯度 15，7.3-15.3minl00°C _260°C，梯度20，C3H的保留時間大約為5.lmin。結果見實施例2的結果分析。
[0049]實施例2 以表達 LoxD、HLP 和 LIP2 基因的 S.cerevisiaeffATll 生產 C3H
[0050]由于實施例1所得重組菌株不能利用中性脂肪，我們在此基礎上繼續(xù)導入脂肪酶基因LIP2 (GenBank:DQ831123)0所述脂肪酶基因LIP2的序列如SEQ ID N0.4所不，是提取 Yarrowia lipolytica ATCC90811 的基因組 DNA (YeaStar?Genomic DNA 試劑合)，通過 PCR 擴增得到，所用引物為 Lip2_F:ATGAAGCTTTCCACCATCCTTTTCA 和 Lip2_R:TTAGATACCACAGACACCCTCGGTGA, PCR 產物連接pCR?M3NV/ΟΡΟ?載體，LIP2 基因通過 LR 反應克隆進入酵母表達載體pAG423GPD-ccdB并用于轉化酵母。
[0051]同時過量表達LoxD-TP、HPL 和 LIP2 基因的 S.cerevisiaeffATll 在缺失 Trp、Leu和His的合成培養(yǎng)基中選育及生長(SD-Trp-Leu，美國Clontech公司生產)，在30°C、225轉/分鐘的搖床培養(yǎng)兩天后，3000轉離心5分鐘收集細胞，將細胞重新懸浮在IOOmM pH6.8的磷酸緩沖液中至濃度0D_=10，然后，添加終濃度為0.1%的甲酯亞麻酸(溶解于95%酒精)到反應體系用于C3H的生產，于30°C、225rpm的搖床反應生成C3H。在不同時間點取2ml 反應液加入 2ml MTBE (Methyl tert-butyl ether)振蕩萃取 C3H。有機相用 GC/MS測定C3H含量，GC/MS分析采用Shimadzu GC-2010系統(tǒng)，該系統(tǒng)帶有GCMS-QP2010S檢測器，分析柱為:Rtx_5MS (Thickness0.25u; length30m; diameter0.25mm),進樣溫度 265。。，進樣模式為 split，爐溫 50°C，溫度梯度:0-4min50°C、4-7.3min50 °C _100°C，梯度 15，7.3-15.3minl00°C _260°C，梯度 20，C3H 的保留時間大約為 5.lmin。
[0052]同時用不表達LIP2基因的菌株并添加甲酯亞麻酸作負對照，用不表達LIP2基因的菌株并添加游離亞麻酸作正對照。如圖4所示，當表達Lip2基因的同時也表達LoxD-TP和HPL，S.cerevisiaeffATll可以直接以亞麻油為底物少量合成C3H。
[0053]對于僅過量表達LoxD-TP和HPL而不表達Lip2的S.cerevisiaeffATll,添加來自皺褶假絲酵母的脂肪酶，可以合成得到C3H (圖5)。僅過量表達LoxD-TP和HPL的
S.cerevisiaeffATll 不能以 C18:3 酯，即 C18:3 甲酯(C18:3_ME)或 C18:3 乙酯(C18:3_ET)為底物得到C3H。這意味著S.cerevisiaeffATll的內源性脂肪酶不能水解C18:3酯。相反，當再在S.cerevisiaeffATll中表達Lip2,或者添加商業(yè)化皺裙假絲酵母脂肪酶時，可以合成 C3H。
[0054]借助脂肪酶時，以甲酯亞麻酸為底物生產C3H的效果好于以亞麻油為底物和以游離脂肪酸為底物生產C3H。
[0055]編碼脂肪酶的基因是從豬胰、皺褶假絲酵母、麥芽、雪白根霉，以及它們的組合中選擇。C18:3酯是從α-亞麻酸甲酯、α-亞麻酸乙酯、α -亞麻酸甘油三酯及它們的組合中選擇。C18:3酯來源于亞麻油。C18:3酯來源于從芡歐鼠尾草、獼猴桃籽、紫蘇、亞麻、越橘、薺、馬齒莧、沙棘、大麻、油菜籽、大豆及它們的組合中挑選的油。
[0056]雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。此外，除特別說明之外，本發(fā)明所涉及的科學術語具有本領域技術人員一般理解的含義。盡管有很多與本發(fā)明的相似、等同的材料方法均可以使用，但本發(fā)明優(yōu)選上述實施方式。
[0057]其他方面，本發(fā)明的目的及優(yōu)勢可以從本發(fā)明記載的附圖、權利要求中得到。
【權利要求】
1.一種以中性脂肪為底物生物合成順式-3-己烯醇的方法，是以脂肪酶輔助過量表達脂肪氧合酶和脂氫過氧化物裂解酶的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)WAT11,以中性脂肪為底物生產C3H。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述中性脂肪是C18:3酯或亞麻油。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述脂肪酶源自皺褶假絲酵母。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，編碼所述脂肪氧合酶的基因序列如SEQID N0.5 所示。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，編碼所述脂氫過氧化物裂解酶的基因序列如SEQ ID N0.3所示。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，編碼所述脂肪氧合酶和脂氫過氧化物裂解酶基因分別通過LR反應克隆進入酵母表達載體pAG424GPD-ccdB和pAG425GPD_ccdB，并用于轉化 S.cerevisiae WAT11。
7.根據權利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，所述以脂肪酶輔助生產C3H可通過外源添加脂肪酶或過量表達編碼脂肪酶的基因實現。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述通過外源添加脂肪酶生成C3H是培養(yǎng)收集過量表達脂肪氧合酶和脂氫過氧化物裂解酶基因的S.cerevisiae WATlI，將細胞重新懸浮在IOOmM pH6.8的磷酸緩沖 液中得到細胞懸浮液，然后，添加中性脂肪和脂肪酶反應生成 C3H。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述細胞懸浮液0D_=10。
10.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述脂肪酶的添加量是3mg/10mL。
11.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述中性脂肪是亞麻油，添加量0.5%。
12.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述中性脂肪是亞麻油，添加量5%。
13.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述中性脂肪是甲酯亞麻酸，添加量.0.1%。
14.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述中性脂肪是乙酯亞麻酸，添加量.0.1%。
15.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述過量表達脂肪酶基因生成C3H是將序列如SEQ ID N0.4所示的脂肪酶基因克隆進入酵母表達載體pAG423GPD-ccdB，并轉化進入已過量表達脂肪氧合酶和脂氫過氧化物裂解酶基因的S.cerevisiae WATll中；培養(yǎng)重組菌，將細胞重新懸浮在IOOmM pH6.8的磷酸緩沖液中得到細胞懸浮液，然后，添加中性脂肪到反應體系，反應生成C3H。
16.根據權利要求15所述的方法，其特征在于，所述細胞懸浮液0D_=10。
17.根據權利要求15所述的方法，其特征在于，所述中性脂肪是亞麻油，添加量2%。
18.根據權利要求15所述的方法，其特征在于，所述中性脂肪是甲酯亞麻酸，添加量.0.05%。
19.根據權利要求15所述的方法，其特征在于，所述中性脂肪是甲酯亞麻酸，添加量.0.1%。
20.根據權利要求15所述的方法，其特征在于，所述中性脂肪是乙酯亞麻酸，添加量.0.05%。
21.根據權利要求15所述的方法，其特征在于，所述中性脂肪是乙酯亞麻酸，添加量0.1%。
22.—株釀酒酵母基因工程菌，其特征在于，是以釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)WATll為宿主，表達基因序列如SEQ ID N0.5所示的脂肪氧合酶和基因序列如SEQ ID N0.3所示的脂氫過氧化物裂解酶。
23.根據權利要求22所示的酵母基因工程菌，其特征在于，編碼所述脂肪氧合酶和脂氫過氧化物裂解酶的基因分別通過LR反應克隆進入酵母表達載體pAG424GPD-ccdB和pAG425GPD-ccdB，并轉化 S.cerevisiae WATlI。
24.—株釀酒酵母基因工程菌，其特征在于，是以釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)WATll為宿主，表達基因序列如SEQ ID N0.5所示的脂肪氧合酶、基因序列如SEQ ID N0.3所示的脂氫過氧化物裂解酶和基因序列如SEQ ID N0.4所示的脂肪酶。
25.根據權利要求24所示的酵母基因工程菌，其特征在于，編碼所述脂肪氧合酶、脂氫過氧化物裂解酶和脂肪酶的基因分別通過LR反應克隆進入酵母表達載體 pAG424GPD-ccdB、pAG425GPD_ccdB 和 pAG423GPD_ccdB，并轉化 S.cerevisiae WATlI。
26.權利要求22-25任一所述酵母基因工程菌應用于生產順式-3-己烯醇。
【文檔編號】C12R1/865GK103725716SQ201310722845
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年12月25日 優(yōu)先權日:2013年12月25日
【發(fā)明者】陳輝, 蔄輝民, 余曉丹 申請人:無錫新和源發(fā)酵技術研究院有限公司