一種巴斯德畢赤酵母培養(yǎng)基的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種巴斯德畢赤酵母培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基中不含KOH和H3PO4，從而降低了對環(huán)境的破壞程度，便于發(fā)酵設備維護，而且使用本發(fā)明所提供的培養(yǎng)基大規(guī)模培養(yǎng)巴斯德畢赤酵母菌株，細胞密度及重組蛋白表達量均能達到較高水平，降低了發(fā)酵的生產(chǎn)成本，利于工業(yè)化規(guī)模的發(fā)酵和生產(chǎn)。
【專利說明】一種巴斯德畢赤酵母培養(yǎng)基
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物發(fā)酵領域，具體涉及一種用于培養(yǎng)巴斯德畢赤酵母的培養(yǎng)基。
【背景技術】
[0002]巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris),是甲醇營養(yǎng)型酵母中的一類能夠利用甲醇作為唯一碳源和能源的酵母菌。巴斯德畢赤酵母是單細胞真核生物，生長快，易于分子遺傳學操作；巴斯德畢赤酵母的醇氧化酶I (Alcohol 0xidaSel，A0Xl)基因的啟動子具有強誘導性和強啟動性，適于外源基因的高水平誘導表達；目的基因整合在染色體上具有高穩(wěn)定性；可高水平分泌表達重組蛋白，純化方便；具有真核細胞的翻譯后修飾功能。以上優(yōu)勢使得巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)成為目前分子生物學領域中用于表達重組蛋白的標準工具之一。
[0003]發(fā)酵培養(yǎng)基是供菌種生長、繁殖和合成產(chǎn)物之用。它既要使種子接種后能迅速生長，達到一定的菌體濃度，又要使長好的菌體能迅速合成產(chǎn)物。因此，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成除有菌體生長所必需的元素和化合物外，還要有產(chǎn)物所需的特定元素、前體和促進劑等。在巴斯德畢赤酵母高密度發(fā)酵培養(yǎng)基方面，人們多采用Invitrogen公司提供的標準配方:小規(guī)模發(fā)酵采用BMGY/BMMY培養(yǎng)基；大規(guī)模發(fā)酵采用BMGY/BSM培養(yǎng)基。
[0004]巴斯德畢赤酵母BMGY/BMMY培養(yǎng)基中，主要成分是酵母提取物(Yeast Extract)、蛋白胨(Peptone)和無氨基酵母氮源(Yeast Nitrogen Base)等。酵母提取物是酵母經(jīng)破壁后將其中蛋白質、核酸、維生素等抽提，再經(jīng)生物酶解的富含小分子的氨基酸、肽、核苷酸、維生素等天然活性成分的物質，其中氨基酸含量30%以上、總蛋白50%以上、核苷酸10%以上。蛋白胨是將肉、酪素或明膠用酸或蛋白酶水解后干燥而成的外觀呈淡黃色的粉劑，富含有機氮化合物，也含有一些維生素和糖類。BMGY/BMMY培養(yǎng)基只適用于巴斯德畢赤酵母的小規(guī)模培養(yǎng)；放大培養(yǎng)時，由于有機氮源單位體積的成本過高,而且上述有機、動物來源的成分存在著外源污染的可能，給下游純化工藝帶來多重困難，所以巴斯德畢赤酵母的大規(guī)模培養(yǎng)多采用BSM無機培養(yǎng)基。
[0005]巴斯德畢赤酵母大規(guī)模發(fā)酵BSM無機培養(yǎng)基中，應用了大量的磷酸和氫氧化鉀。磷酸(H3PO4)是一種中強酸，在空氣中易潮解，對人體的健康危害較大。發(fā)酵生產(chǎn)中，由于其酸的腐蝕性，在設備的材料和制造上均需要考慮其影響。氫氧化鉀(Κ0Η)，在空氣中極易吸濕而潮解，高溫時揮發(fā)而不分解，有強烈腐蝕性，吸入后強烈刺激呼吸道或造成灼傷；皮膚和眼直接接觸可引起灼傷；長期接觸會帶來肺損害、視覺損害、嗅覺損害等諸多不良后果。
[0006]因此，有必要提供一種更加環(huán)保經(jīng)濟的巴斯德畢赤酵母培養(yǎng)基，降低對環(huán)境的破壞程度，便于發(fā)酵設備的維護，同時能夠得到較高的細胞密度及重組蛋白表達量，降低發(fā)酵的生產(chǎn)成本，從而利于巴斯德畢赤酵母工業(yè)化規(guī)模的發(fā)酵和生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于，提供一種巴斯德畢赤酵母培養(yǎng)基，以彌補現(xiàn)有技術的不足。
[0008]本發(fā)明提供的巴斯德畢赤酵母培養(yǎng)基不含KOH和H3PO4,含有NH4H2PO4與ΚΗ2Ρ04。[0009]本發(fā)明提供的巴斯德畢赤酵母培養(yǎng)基不含KOH和H3PO4，含有1.575~31.5g/L的NH4H2PO4 與 1.155 ~23.lg/L 的 KH2PO4。
[0010]本發(fā)明提供的巴斯德畢赤酵母的培養(yǎng)基，按培養(yǎng)基的總體積計，所述培養(yǎng)基含有
以下成分:
[0011]
NH4H2PO41.575~31.5 g/L
KH2PO41.155~23.1 g/L
MgSO4* IU2O1.49~14.9 g/L
K2SO4O~18,2 g/L
CaSO40.093 ~0.93 g/L
甘油IO~40 g/L
PTMl 溶液0.435~4.35ml/L
氨水調pH值至 4 5~6 2
[0012]根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，按培養(yǎng)基的總體積計，所述培養(yǎng)基含有以下成
分:
[0013]
NH4H2PO415.75 g/L
KH2PO41.155 g/L
MgSO4* 7H201.49 g/L
K2SO41.82g/L
CaSO40.093 g/L
甘油I OgZL
PTMl 溶液0.435mL/L
氨水調pH值至 5.0
[0014]本發(fā)明前述提供的培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)巴斯德畢赤酵母。
[0015]根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，前述提供的培養(yǎng)基在培養(yǎng)巴斯德畢赤酵母的過程中作為發(fā)酵培養(yǎng)基使用。
[0016]根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，前述提供的培養(yǎng)基在培養(yǎng)巴斯德畢赤酵母的過程中作為種子培養(yǎng)基使用。
[0017]本發(fā)明所述的巴斯德畢赤酵母是野生型、經(jīng)過改造的含有外源基因的重組工程菌株中的一種。
[0018]本發(fā)明提供的培養(yǎng)基避免了酸、堿對環(huán)境、人員和發(fā)酵設備的危害，降低了發(fā)酵的生產(chǎn)成本，同時也能夠得到較高的細胞密度及重組蛋白表達量。本發(fā)明提供的培養(yǎng)基，在利用巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)表達重組蛋白的生產(chǎn)中具有廣闊的應用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1采用本發(fā)明的培養(yǎng)基作為搖瓶水平的發(fā)酵培養(yǎng)基，整個發(fā)酵周期的菌體生長曲線。
[0020]圖2采用本發(fā)明的培養(yǎng)基作為30L發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基，整個發(fā)酵周期的菌體生長曲線。
[0021]圖3采用本發(fā)明的改良IV培養(yǎng)基作為30L發(fā)酵罐的種子培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基，整個發(fā)酵周期的菌體生長和蛋白表達曲線。
【具體實施方式】
[0022]以下結合實施例進一步說明本發(fā)明，下述實施例不應理解為對本發(fā)明的限制。實施例不包括對傳統(tǒng)方法的詳細描述，如那些用于構建載體和質粒的方法，將編碼蛋白的基因插入到載體和質粒的方法或將質粒引入宿主細胞的方法以及經(jīng)典的細胞融合和純化的方法等。這樣的方法對于本領域中具有普通技術的人員是眾所周知的，并且在許多出版物中都有所描述，包括 Sambrook, J.，F(xiàn)ritsch, E.F.andManiais, T.(1989)MolecularCloning:A Laboratory Manual,2nd edition，Cold spring HarborLaboratory Press.[0023]在本發(fā)明的下述實施例中，使用的巴斯德畢赤酵母為菌種保藏號為CGMCCN0.1360的菌株，以下稱為HSA75-10，該菌含有人血白蛋白的重組基因，經(jīng)誘導可分泌表達重組人血白蛋白(HSA)。巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)HSA75-10已于2005年04月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，登記入冊編號為CGMCCN0.1360，CGMCC位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所。
[0024]實施例中作為對照的培養(yǎng)基及溶液，所有試劑及原料均購自Sigma公司: [0025] I) BMGY 培養(yǎng)基:
[0026]
【權利要求】
1.一種巴斯德畢赤酵母培養(yǎng)基，其特征在于培養(yǎng)基成分中不含KOH和H3PO4，含有NH4H2PO4 與 KH2PO40
2.如權利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于培養(yǎng)基中含有1.575~31.5 g/L的NH4H2PO4 與 1.155 ~23.1 g/L 的 KH2PO4。
3.如權利要求2所述的培養(yǎng)基，按培養(yǎng)基的總體積計，所述培養(yǎng)基含有以下成分: NH4H2PO41.575 ~31.5 g/L KH2PO41.155 ~23.1 g/L MgSO4.7Η201.49 ~14.9 g/L K2SO4O ~18.2 g/L CaSO40.093 ~0.93 g/L 甘油10~40 g/L PTMl 溶液0.435 ~4.35ml/L 氨水調pH值至 4.5~6.2。
4.如權利要求3所述的培養(yǎng)基，按培養(yǎng)基的總體積計，所述培養(yǎng)基含有以下成分: NH4H2PO415.7 5 g/L KH2PO41.155 g/L MgSO4.7Η201.49 g/L K2SO41.82g/L CaSO40.093 g/L 甘油10 g/L PTMl 溶液0.435mL/L 氨水調pH值至5.0。
5.權利要求1-4中任一項所述的培養(yǎng)基在培養(yǎng)巴斯德畢赤酵母中的用途。
6.如權利要求5所述的用途，其中所述的培養(yǎng)為發(fā)酵培養(yǎng)。
7.如權利要求5所述的用途，其中所述的培養(yǎng)為種子培養(yǎng)。
8.如權利要求1-4中任一項所述培養(yǎng)基，其特征在于:所述的巴斯德畢赤酵母是野生型菌株或是經(jīng)過改造的含有外源基因的重組工程菌株。
【文檔編號】C12N1/16GK103923846SQ201310727410
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2013年12月23日 優(yōu)先權日:2013年12月23日
【發(fā)明者】高健, 韓柱, 鄭海洲, 蔣艷, 潘永剛, 申亮, 王志明, 楊麗霞, 胡衛(wèi)國, 段寶玲 申請人:華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責任公司