專利名稱：一種克魯維畢赤酵母克魯維變種菌株及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種克魯維畢赤酵母克魯維變種菌株及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用，特別涉及一種產(chǎn)香的克魯維畢赤氏酵母克魯維變種(Pichia kluyveri var. kluyveri)菌株SS1-5 及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
我國是啤酒飲料生產(chǎn)和消費(fèi)大國，啤酒飲料消費(fèi)人數(shù)眾多，但酒中乙醇及微量甲醇、甲醛對消費(fèi)者健康的危害引起社會的普遍關(guān)注，特別是過量嗜酒習(xí)慣對消費(fèi)者危害極大，易因酒駕導(dǎo)致交通肇事，醉酒引發(fā)家庭矛盾等。為此，開發(fā)無醇或低醇飲品，提高營養(yǎng)水平，既滿足消費(fèi)者需求，也有利于人體健康，又可擴(kuò)大消費(fèi)人群，符合我國食品發(fā)展方向和世界飲料發(fā)展潮流。為此低醇或無醇啤酒飲料應(yīng)運(yùn)而生，具有廣闊的發(fā)展市場。低醇飲料需要在保持普通啤酒風(fēng)味品質(zhì)的同時，還要求乙醇含量應(yīng)低于O. 5%vol。目前無醇啤酒飲料生產(chǎn)方法主要有脫醇法、控制發(fā)酵法和路德類酵母發(fā)酵法，但隨之帶來工藝流程和生產(chǎn)成本的增加，使得其推廣受到限制。
如中國專利文獻(xiàn)CN86104029A (申請?zhí)?6104029)公開了生產(chǎn)低醇飲料的方法，是使高醇飲料，加入的水和再循環(huán)的滯留液之混合物通過反滲透系統(tǒng)，形成滲透物和滯留物。 從系統(tǒng)中排除主要含有醇和水的滲透物，小部分滯留物經(jīng)回收后作為產(chǎn)品，同時將大部分滯留物再循環(huán)到反滲透系統(tǒng)，與新加入的飲料和水混合，這一技術(shù)工序復(fù)雜，能耗高。因此， 通過篩選新的菌株，優(yōu)化生產(chǎn)工藝來生產(chǎn)低醇飲料是解決上述問題的經(jīng)濟(jì)而有效途徑。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種克魯維畢赤酵母克魯維變種菌株及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用。
術(shù)語說明
低醇飲料乙醇含量低于O. 5% (w/w)的啤酒飲料。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下
一種克魯維畢赤酵母克魯維變種(Pichia kluyveri var. kluyveri)菌株SS1-5， 2010年12月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中科院微生物研究所，保藏號CGMCC NO :4494。
上述克魯維畢赤酵母克魯維變種(Pichia kluyveri var. kluyveri)菌株SS1-5 分離自新壓榨的鮮葡萄汁中，菌落邊緣及中心都呈奶油色，球狀突起，表面皺褶粗糙，不透明，不反光，邊緣不整齊，毛絨狀，白色暗淡；細(xì)胞呈橢圓形。液體Yro培養(yǎng)基培養(yǎng)2-3d，有沉淀和絨狀膜出現(xiàn)。該菌株耐45°c，耐ρΗ2· 5-12. O,耐SO2 400mg/L,耐酒精8%(vol)，耐NaCl 為 100. Og/L，耐葡萄糖 500. Og/Lo
上述克魯維畢赤酵母克魯維變種(Pichia kluyveri var. kluyveri)菌株SS1-5 的培養(yǎng)方法，步驟如下
(I)取克魯維畢赤酵母克魯維變種菌株SS1-5，接種于YEro固體培養(yǎng)基，在25 281條件下，活化培養(yǎng)40 48h，制得活化菌株；
(2)將步驟(I)制得的活化菌株接種于YEro液體培養(yǎng)基中，在25 28°C條件下， 培養(yǎng)15 20h，制得種子液；
(3)將步驟(2)制得的種子液按照體積比2% 5%接種于麥芽汁液體培養(yǎng)基中，在25 28°C條件下，培養(yǎng)32 40h，即得生產(chǎn)用種子液。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(I)中的YEro固體培養(yǎng)基每升組分如下葡萄糖20 克，酵母粉10克，蛋白胨10克，瓊脂20克，用蒸餾水定容至1000毫升，pH值自然，115°C滅菌 30min。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中的YEro液體培養(yǎng)基每升組分如下葡萄糖20 克，酵母粉10克，蛋白胨10克，用蒸餾水定容至1000毫升，pH值自然，115°C滅菌30min。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中的麥芽汁液體培養(yǎng)基組分如下麥芽汁濃度 11 13。P，115°C滅菌 30min，pH 值自然。
上述克魯維畢赤酵母克魯維變種(Pichia kluyveri var. kluyveri)菌株SS1-5 在制備低醇飲料中的應(yīng)用。
上述應(yīng)用，步驟如下
(i)將原料大麥芽經(jīng)糖化后，按照2 4g/kg的添加量添加酒花，靜置20 40min， 分離酒花糟及熱凝固物，冷卻，制得糖度為11 13° P的麥芽汁；
(ii)按照體積比為2% 5%的添加量向步驟(I)制得的麥芽汁中添加克魯維畢赤酵母克魯維變種(Pichia kluyveri var. kluyveri)菌株 SS1-5,在 20 24°C、通氧量 100L/ min的條件下發(fā)酵培養(yǎng)7 9d，制得發(fā)酵液；
(iii)將步驟(I)制得的發(fā)酵液，經(jīng)過濾、殺菌后，制得低醇飲料。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(i)中的糖化，步驟如下
將原料大麥芽在50 55°C條件下投料至水中，保持35 45min ;升溫至63 68°C，保持55 65min ;然后升溫至70 75°C，保持12 18min，碘驗；75 80°C保持8 12min ;煮沸時間65 75min，煮沸強(qiáng)度不低于8%。
進(jìn)一步優(yōu)選的，所述大麥芽與水的質(zhì)量比為1: (4. 5 5. 5)。
有益效果
本發(fā)明所述克魯維畢赤酵母克魯維變種(Pichia kluyveri var. kluyveri)菌株 SS1-5可以釀造低醇飲料，該飲料果香味濃，酒精含量低，口感甜潤，風(fēng)味和營養(yǎng)與無醇啤酒接近；此外，該低醇飲料，能夠最大限度地保留麥芽汁中的有機(jī)營養(yǎng)成分，生產(chǎn)工藝簡化， 成本和能顯著耗低，減輕環(huán)境污染。


圖1是實(shí)施例3制得的低醇飲料中揮發(fā)性物質(zhì)的GC-MS總離子流氣相色譜圖2是實(shí)施例3制得的低醇飲料中氨基酸分析色譜圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。
本實(shí)施例中所述大麥芽購自蘭州黃河麥芽有限公司，該麥芽質(zhì)量符合啤酒麥芽國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T1686-2008)；
啤酒花購自新疆綠寶酒花有限公司；
克魯維畢赤酵母克魯維變種(Pichia kluyveri var. kluyveri)菌株SS1-5，在 2010年12月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中科院微生物研究所，保藏號CGMCC NO 4494 ；
其他原料均為本行業(yè)常規(guī)市售產(chǎn)品。
實(shí)施例1
一種克魯維畢赤酵母克魯維變種(Pichia kluyveri var. kluyveri)菌株SS1-5， 在2010年12月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中科院微生物研究所，保藏號CGMCC NO :4494。
上述克魯維畢赤酵母克魯維變種(Pichia kluyveri var. kluyveri)菌株SS1-5 分離自新壓榨的鮮葡萄汁中，菌落邊緣及中心都呈奶油色，球狀突起，表面皺褶粗糙，不透明，不反光，邊緣不整齊，毛絨狀，白色暗淡；細(xì)胞呈橢圓形?！EH)液體培養(yǎng)2-3d，有沉淀和絨狀膜出現(xiàn)。該菌株耐溫450C，耐ρΗ2· 5 12. O,耐SO2 400mg/L,耐乙醇8%(vol)，耐NaCl 為100g/L,耐葡萄糖500g/L。
實(shí)施例2
實(shí)施例1所述克魯維畢赤酵母克魯維變種(Pichia kluyveri var. kluyveri)菌株SS1-5的培養(yǎng)方法，步驟如下
(I)用接種針取克魯維畢赤酵母克魯維變種菌株SS1-5，劃線接種于YEH)固體培養(yǎng)基，在28 °C條件下，活化培養(yǎng)40 48h，制得活化菌株；
(2)將步驟(I)制得的活化菌株接種于YEro液體培養(yǎng)基中，在28°C條件下，120r/ min搖床培養(yǎng)18 22h，制得種子液；
(3)將步驟(2)制得的種子液按照體積百比5%接種于麥芽汁液體培養(yǎng)基中，在 25°C條件下，培養(yǎng)34 36h，即得生產(chǎn)用種子液。
所述步驟(I)中的YEro固體培養(yǎng)基每升組分如下葡萄糖20克，酵母粉10克，蛋白胨10克，瓊脂20克，用蒸餾水定容至1000毫升，pH值自然，115°C滅菌30min。
所述步驟(2)中的YEH)液體培養(yǎng)基每升組分如下葡萄糖20克，酵母粉10克，蛋白胨10克，用蒸餾水定容至1000毫升，pH值自然，115°C滅菌30min。
所述步驟(3)中的麥芽汁液體培養(yǎng)基組分如下12° P麥芽汁，115°C滅菌30min， pH值自然。
實(shí)施例3
上述克魯維畢赤酵母克魯維變種(Pichia kluyveri var. kluyveri)菌株SS1-5 在制備低醇飲料中的應(yīng)用，步驟如下
(i)將原料大麥芽按重量比1:5的比例在52°C投料至水中，保持40min;升溫至 65°C，保持60min ;然后升溫至72°C，保持15min，碘驗；78°C保持IOmin ;完全糖化后，分兩次洗糟，洗糟水溫78°C ;煮沸時間70min，煮沸強(qiáng)度不低于8%，將原料大麥芽經(jīng)糖化后，按照 2 4g/kg的添加量添加酒花，酒花分三次添加，靜置30min，分離酒花糟及熱凝固物，冷卻， 制得糖度為12±0. 3° P的麥芽汁；
(ii)按照體積比為5%的添加量向步驟(I)制得的麥芽汁中添加克魯維畢赤酵母克魯維變種(Pichia kluyveri var. kluyveri)菌株SS1-5的生產(chǎn)用種子液,在21°C、通氧量100L/min的條件下發(fā)酵培養(yǎng)8d，制得發(fā)酵液；
(iii)將步驟(I)制得的發(fā)酵液，經(jīng)過濾、巴氏殺菌(殺菌溫度68°C，持續(xù)30min) 后，制得低醇飲料。
采用無醇啤酒檢測國家標(biāo)準(zhǔn)方法，對低醇飲料基本生化指標(biāo)進(jìn)行檢測。
還原糖測定用斐林試劑法，參照國標(biāo)GB/T15038-2006，經(jīng)S⑶-1II全自動還原糖測定儀測定樣品還原糖含量(儀器購自山東省科學(xué)院生物中心)；經(jīng)檢測，殘?zhí)橇繛?5g/L ；
總酸測定用氫氧化鈉滴定法，參照國標(biāo)GB/T15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》；經(jīng)檢測，總酸為O. 052mol/L ；
雙乙酰按照GB/T4928-2008法測定；經(jīng)檢測，雙乙酰O. 06mg/L ；
乙醇測定用氣相色譜-氫離子火焰法(劉迎春，陳杰，吉華貴，等.直接稀釋-氣相色譜法測定血液中的乙醇含量.華西醫(yī)學(xué)，2011，26 (04):572-575)，乙醇含量約為O. 46% (vol)
Vc 測定參照 GB/T5009. 86. 2003 標(biāo)準(zhǔn)；Vc 含量為 17. 5mg/kg ；
游離氨基酸含量測定參照GB/T5009. 124. 2003標(biāo)準(zhǔn)方法，結(jié)果如圖2所示；經(jīng)檢測，游離氨基酸的含量(單位··%)
天門冬氨酸O. 05、谷氨酸O. 10、絲氨酸O. 05、甘氨酸O. 03、組氨酸O. 02、精氨酸 O. 04、蘇氨酸O. 03、丙氨酸O. 04、脯氨酸O. 10、酪氨酸O. 02、纈氨酸O. 02、蛋氨酸〈O. 01、胱氨酸O. 02、異亮氨酸O. 03、亮氨酸O. 04、苯丙氨酸O. 47、賴氨酸O. 13，氨基酸總量1. 19。
香味分析用GC-MS法，儀器為日本島津GC-MS-QP2010氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，結(jié)果如圖1所示；經(jīng)檢測分析，香味成分主要有
酯類6種異丁酸丁酯、丁酸異丁酯、丁酸丁酯、山梨醇六乙酸酯、生育酚乙酸酯、 三乙基2- 丁基丙烯酯；
酸類3種亞甲基雙硫代乙酸、鵝去氧膽酸、2，4- 二甲氧基肉桂酸；
高級醇3種4,4-二甲基-5 α-膽甾_3 β -醇、膽固醇、4_正癸醇；
酚醛類3種二甲基叔辛基酚、3，5- 二 - (1，1- 二甲基乙基)-1, 2_苯二酚、異丁醛二乙基乙縮醛。
實(shí)施例4
如實(shí)施例3所述的應(yīng)用，不同之處在于按3%的接種量(ν/ν)向5L糖度為 11.5±0. 3° P的麥芽汁中添加上述克魯維畢赤酵母克魯維變種(Pichia kluyveri var. kluyveri)菌株SS1-5的生產(chǎn)用種子液,所得低醇飲料的相關(guān)指標(biāo)如下
表I發(fā)酵產(chǎn)品中基本生化指標(biāo)分析結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種克魯維畢赤酵母克魯維變種(Pichia kluyveri var. kluyveri)菌株SS1-5，在2010年12月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中科院微生物研究所，保藏號CGMCC NO :4494。
2.權(quán)利要求1所述克魯維畢赤酵母克魯維變種(Picchiakluyveri var. kluyveri)菌株SS1-5的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟如下 (O用接種環(huán)取克魯維畢赤酵母克魯維變種菌株SS1-5，接種于YEH)固體培養(yǎng)基，在25 28 °C條件下，活化培養(yǎng)40 48h，制得活化菌株； (2)將步驟(I)制得的活化菌株接種于YEH)液體培養(yǎng)基中，在25 28°C條件下，培養(yǎng)15 20h，制得種子液； (3)將步驟(2)制得的種子液按照2 5%(v/v)接種于麥芽汁液體培養(yǎng)基中，在25 28°C條件下，培養(yǎng)32 40h，即得生產(chǎn)用種子液。
3.如權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟(I)中的YEro固體培養(yǎng)基每升組分如下葡萄糖20克，酵母粉10克，蛋白胨10克，瓊脂20克，用蒸餾水定容至1000毫升，pH值自然，115°C滅菌30min。
4.如權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟(2)中的YEH)液體培養(yǎng)基每升組分如下葡萄糖20克，酵母粉10克，蛋白胨10克，用蒸餾水定容至1000毫升，pH值自然，115°C滅菌 30min。
5.如權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟(3)中的麥芽汁液體培養(yǎng)基組分如下麥芽汁濃度11 13° P，115°C滅菌30min，pH值自然。
6.權(quán)利要求1所述克魯維畢赤酵母克魯維變種(Pichiakluyveri var. kluyveri)菌株SS1-5在制備低醇飲料中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟如下 (i )將原料大麥芽經(jīng)糖化后，按照2 4g/kg的添加量添加酒花，糖化液溫度70 80°C時靜置20 40min，分離酒花糟及熱凝固物，冷卻，制得麥芽汁糖度為11 13° P ; (ii)按照體積比為2 5%的添加量向步驟(I)制得的麥芽汁中添加克魯維畢赤酵母克魯維變種(Pichia kluyveri var. kluyveri)菌株SS1-5的生產(chǎn)用種子液,在20 24°C、通氧量為O.1mVmin條件下發(fā)酵培養(yǎng)7 9d，制得發(fā)酵液； (iii)將步驟(I)制得的發(fā)酵液，經(jīng)過濾、殺菌后，制得低醇飲料。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟(i)中的糖化，步驟如下 將原料大麥芽在50°C 55°C條件下投料至水中，保持35 45min ;升溫至63 68°C，保持55 65min ;然后升溫至70 75°C，保持12 18min，碘驗；75 80°C保持8 12min ；煮沸時間65 75min,煮沸強(qiáng)度不低于8%。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述大麥芽與水的質(zhì)量比為1:(4.5 ·5.5)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種克魯維畢赤酵母克魯維變種菌株及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用，克魯維畢赤酵母克魯維變種(Pichia kluyveri var.kluyveri)菌株SS1-5，在2010年12月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中科院微生物研究所，保藏號CGMCC NO4494。該菌株可以釀造低醇飲料，該飲料果香味濃，酒精含量低，口感甜潤，風(fēng)味和營養(yǎng)與無醇啤酒接近；此外，該低醇飲料，能夠更好地保留麥芽汁中的有機(jī)營養(yǎng)，生產(chǎn)工藝簡化，成本和能耗降低，減輕環(huán)境污染。
文檔編號C12N1/16GK103013845SQ20121035173
公開日2013年4月3日 申請日期2012年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月20日
發(fā)明者劉天明, 趙修報, 王會會 申請人:山東輕工業(yè)學(xué)院