一種全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管的制作方法
【專利摘要】本申請(qǐng)涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是核酸擴(kuò)增與檢測(cè)領(lǐng)域。具體而言，本申請(qǐng)涉及一種全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管。此外，本申請(qǐng)還涉及一種擴(kuò)增和檢測(cè)核酸的方法，其包括使用本申請(qǐng)的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管。此外，本申請(qǐng)還涉及包含所述全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管的試劑盒，以及所述全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管用于制備試劑盒的用途。
【專利說(shuō)明】一種全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本申請(qǐng)涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是核酸擴(kuò)增與檢測(cè)領(lǐng)域。具體而言，本申請(qǐng)涉及一種全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管。此外，本申請(qǐng)還涉及一種擴(kuò)增和檢測(cè)核酸的方法，其包括使用本申請(qǐng)的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管。此外，本申請(qǐng)還涉及包含所述全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管的試劑盒，以及所述全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管用于制備試劑盒的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(以下簡(jiǎn)稱PCR技術(shù))，是一種在體外快速擴(kuò)增DNA的技術(shù)，其通常包括多個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括變性、退火和延伸三個(gè)步驟，并且在理想狀態(tài)下，每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，目的核酸分子的數(shù)目就擴(kuò)增一倍。一般而言，經(jīng)過(guò)30-40個(gè)循環(huán)后，目的核酸分子數(shù)目就能擴(kuò)增到原來(lái)的近IO9倍。因此，PCR是體外大量獲得目的DNA片段的最有效方法，并且所獲得的核酸分子可用于進(jìn)一步的分析和檢驗(yàn)。
[0003]目前，PCR技術(shù)已廣泛地應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究。例如，在基礎(chǔ)研究中，PCR作為一個(gè)“無(wú)細(xì)胞基因擴(kuò)增系統(tǒng)”，可用于克隆基因，并由此可對(duì)基因組DNA進(jìn)行直接序列分析，檢測(cè)突變位點(diǎn)，分析染色體重組等。在應(yīng)用研究中，PCR則可以用于傳染病的診斷、遺傳疾病的檢測(cè)、產(chǎn)前診斷、法醫(yī)研究等。美國(guó)專利4，683，202 ；4, 683, 159 ;4，800，159 ；4，965，188等已對(duì)PCR技術(shù)做出了詳細(xì)描述。
[0004]DNA的體內(nèi)擴(kuò)增是指，在細(xì)胞內(nèi)有關(guān)因子的參與下，雙螺旋的DNA分子被解鏈成2條單鏈，在引物酶的作用下合成DNA引物，引物與單鏈DNA堿基互補(bǔ)配對(duì)，形成引物單鏈DNA復(fù)合物；在0嫩聚合酶作用下，沿著5’ -3’方向，按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，在引物3’端開(kāi)始，逐一將互補(bǔ)的三磷酸脫氧核苷酸接上，最終形成一條新的雙鏈DNA分子。
[0005]DNA分子的體外PCR擴(kuò)增模擬了體內(nèi)的三個(gè)步驟:首先，在大約95°C的高溫下加熱雙鏈DNA分子，以使雙鏈間的氫鍵斷裂，從而使得DNA熱分解成兩條互補(bǔ)的單鏈DNA分子(這一過(guò)程稱為高溫解鏈反應(yīng))；然后，溫度迅速降到大約50-65°C的范圍內(nèi)，在這個(gè)溫度下單鏈DNA與引物按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則結(jié)合(這一過(guò)程稱為低溫退火反應(yīng));退火反應(yīng)結(jié)束后，溫度又迅速升高到72°C左右，在這個(gè)溫度下，在DNA聚合酶以及適當(dāng)鎂離子濃度的條件下，從引物的3’端開(kāi)始結(jié)合單核苷酸，從而形成一條新的DNA (這一過(guò)程稱為延伸反應(yīng))。經(jīng)過(guò)一個(gè)這樣的過(guò)程，原來(lái)的一個(gè)DNA雙鏈分子就形成了兩個(gè)DNA分子，增加了一倍。反復(fù)進(jìn)行高溫解鏈-低溫退火-中溫延伸三個(gè)過(guò)程，就可以獲得數(shù)量更多的復(fù)制雙鏈，并且這些新形成的雙鏈又可以作為下次循環(huán)的模板。
[0006]通過(guò)這樣一種循環(huán)擴(kuò)增方法，經(jīng)過(guò)30-40個(gè)循環(huán)，目的核酸分子數(shù)目可由I個(gè)增加到原來(lái)的近IO9倍。然而，PCR的高靈敏度始終伴隨著這樣的弊端，即，其極其容易被污染。僅僅I個(gè)DNA拷貝的污染就可能會(huì)導(dǎo)致獲得錯(cuò)誤的檢測(cè)結(jié)果。因此，為了避免檢測(cè)過(guò)程中的樣品污染，國(guó)家衛(wèi)生部明確規(guī)定:PCR臨床診斷必須將樣品處理、擴(kuò)增和檢測(cè)在分割的房間進(jìn)行，而且物流是從樣品處理，擴(kuò)增至檢測(cè)一個(gè)方向進(jìn)行，否則擴(kuò)增后的試管不能進(jìn)行開(kāi)放檢測(cè)。
[0007]因此，如何在PCR的全過(guò)程中避免污染也是現(xiàn)今核酸擴(kuò)增和檢測(cè)領(lǐng)域的一個(gè)重要研究方向，并且也取得了很多的進(jìn)展。例如，熒光PCR的出現(xiàn)使得對(duì)核酸產(chǎn)物的檢測(cè)避免了開(kāi)管取樣的步驟，從而大大減少了核酸產(chǎn)物污染的機(jī)會(huì)。另外，UNG酶的使用也避免了 PCR過(guò)程中核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。然而，以上所述方法均需要昂貴的試劑或精密的儀器，且操作復(fù)雜，不適宜用于核酸的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。
[0008]因此，本領(lǐng)域仍然迫切需要一種操作簡(jiǎn)單、快速、成本低廉、能夠有效避免核酸擴(kuò)增和檢測(cè)過(guò)程中的污染的方法和裝置。為此，本申請(qǐng)開(kāi)發(fā)出了一種全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管。當(dāng)使用本申請(qǐng)的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管進(jìn)行核酸擴(kuò)增和檢測(cè)時(shí)，在核酸擴(kuò)增后無(wú)需開(kāi)管即可進(jìn)行核酸檢測(cè)，從而有效避免了擴(kuò)增產(chǎn)物的外泄以及擴(kuò)增和檢測(cè)中的污染。此外，使用本申請(qǐng)的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管進(jìn)行核酸擴(kuò)增和檢測(cè)時(shí)，操作簡(jiǎn)單、成本低廉、無(wú)須使用昂貴的試劑或精密的儀器，從而，本申請(qǐng)的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管可廣泛應(yīng)用于核酸的體外診斷，且特別適宜用于核酸的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。
實(shí)用新型內(nèi)容
[0009]在本申請(qǐng)中，除非另有說(shuō)明，否則本文中使用的科學(xué)和技術(shù)名詞具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理解的含義。并且，本文中所用的分子遺傳學(xué)、核酸化學(xué)、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室操作步驟均為相應(yīng)領(lǐng)域內(nèi)廣泛使用的常規(guī)步驟。同時(shí)，為了更好地理解本申請(qǐng)，下面提供相關(guān)術(shù)語(yǔ)的定義和解釋。
[0010]如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“擴(kuò)增”應(yīng)從廣義上來(lái)理解，其包括從RNA或DNA獲得DNA的過(guò)程，并且包括但不限于PCR反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以及其各種變型(例如實(shí)時(shí)PCR反應(yīng))。
[0011]如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“全封閉”是指，當(dāng)擴(kuò)增管(I)和檢測(cè)管(2)組裝完畢時(shí)，二者構(gòu)成一個(gè)完全封閉的環(huán)境。
[0012]在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管，其包括相互配合的用于完成擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增管(1)，和用于對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)和結(jié)果判讀的檢測(cè)管
(2)，其中擴(kuò)增管(I)與檢測(cè)管(2)是密閉連接的，并且擴(kuò)增管(I)位于檢測(cè)管(2)的下方，并且檢測(cè)管(2 )包括固定在試紙條容納固定區(qū)(7 )中的試紙條(6 )。
[0013]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，擴(kuò)增管(I)和檢測(cè)管(2)通過(guò)螺紋卡口結(jié)構(gòu)、環(huán)狀卡口結(jié)構(gòu)或凸點(diǎn)鎖扣結(jié)構(gòu)而實(shí)現(xiàn)密閉連接。
[0014]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，擴(kuò)增管(I)包括儲(chǔ)液區(qū)(3)及核酸擴(kuò)增區(qū)(4)，其中儲(chǔ)液區(qū)(3)位于核酸擴(kuò)增區(qū)(4)的上方。任選地，儲(chǔ)液區(qū)(3)中預(yù)裝有用于核酸擴(kuò)增的試劑，例如但不限于，引物，dNTP混合物，酶(例如DNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶)，探針，內(nèi)標(biāo)、緩沖液等。
[0015]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，擴(kuò)增管(I)是適用于雷諾-本納德對(duì)流PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增管。雷諾-本納德對(duì)流PCR擴(kuò)增是指，利用自然對(duì)流(即雷諾-本納德對(duì)流)原理進(jìn)行PCR擴(kuò)增的方法。該技術(shù)是將PCR反應(yīng)液置于一個(gè)封閉的柱形反應(yīng)腔內(nèi)，反應(yīng)腔的上下表面分別進(jìn)行恒溫控制，通常上端溫度為60°C，下端溫度為97°C。通過(guò)上下表面的溫差驅(qū)動(dòng)液體經(jīng)過(guò)不同的溫區(qū)，實(shí)現(xiàn)PCR擴(kuò)增。這種方法不需要改變器件的溫度，也不需要外加驅(qū)動(dòng)來(lái)實(shí)現(xiàn)樣品的流動(dòng)，只需要一個(gè)反應(yīng)腔，并控制其上下兩端的溫度為恒溫，就可以實(shí)現(xiàn)PCR擴(kuò)增。因此，該方法具有操作簡(jiǎn)單、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。[0016]因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，擴(kuò)增管(I)是適用于雷諾-本納德對(duì)流PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增管，其包括儲(chǔ)液區(qū)(3)及核酸擴(kuò)增區(qū)(4)，其中儲(chǔ)液區(qū)(3)位于核酸擴(kuò)增區(qū)(4)的上方。
[0017]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸擴(kuò)增區(qū)(4)的高度/內(nèi)徑比值為3 — 12。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸擴(kuò)增區(qū)(4)的高度/內(nèi)徑比值為6 - 9，所述核酸擴(kuò)增區(qū)(4)的最大內(nèi)徑小于或等于10mm，且所述核酸擴(kuò)增區(qū)(4)的內(nèi)徑小于所述儲(chǔ)液區(qū)(3)的內(nèi)徑。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述核酸擴(kuò)增區(qū)(4)的最大內(nèi)徑小于等于5mm。
[0018]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸擴(kuò)增區(qū)(4)的內(nèi)腔為橫截面上寬下窄的錐狀中空結(jié)構(gòu)或多層梯形中空結(jié)構(gòu)。
[0019]在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸擴(kuò)增區(qū)(4)的內(nèi)腔為上下內(nèi)徑相等的柱狀中空結(jié)構(gòu)。
[0020]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸擴(kuò)增區(qū)(4)上設(shè)有可見(jiàn)的體積刻度標(biāo)識(shí)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述儲(chǔ)液區(qū)(3)的外壁上設(shè)有防滑溝槽。
[0021]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸擴(kuò)增區(qū)(4)與儲(chǔ)液區(qū)(3)的連接處內(nèi)部為圓滑導(dǎo)角結(jié)構(gòu)。
[0022]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，擴(kuò)增管(I)通過(guò)螺紋卡口(5)而和檢測(cè)管(2)密閉連接。優(yōu)選地，螺紋卡口(5)位于儲(chǔ)液區(qū)(3)的內(nèi)部。然而，螺紋卡口(5)也可以位于儲(chǔ)液區(qū)
(3)的外部。
[0023]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，試紙條(6)包括用于與擴(kuò)增產(chǎn)物接觸的樣品墊區(qū)(8)及用于反應(yīng)和呈現(xiàn)結(jié)果的檢測(cè)區(qū)(9)。
[0024]在本領(lǐng)域中，利用試紙條來(lái)檢測(cè)核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的方法已得到良好建立。例如,一個(gè)典型的方法是，在核酸擴(kuò)增過(guò)程中，使擴(kuò)增產(chǎn)物同時(shí)攜帶第一標(biāo)記和第二標(biāo)記(例如，通過(guò)使用帶有第一標(biāo)記(例如FITC)的探針以及帶有第二標(biāo)記(例如生物素)的引物對(duì)樣品進(jìn)行擴(kuò)增)，并且在試紙條的上游設(shè)置有可隨流體移動(dòng)的、特異性識(shí)別第一標(biāo)記的檢測(cè)劑(例如標(biāo)記有鼠FITC抗體的乳膠顆粒)，在下游(S卩，檢測(cè)線處)固定有不可移動(dòng)的、特異性識(shí)別第二標(biāo)記的捕獲劑(例如鏈霉親和素)。由此，當(dāng)樣品中存在目的DNA時(shí)，在擴(kuò)增后將產(chǎn)生同時(shí)攜帶第一標(biāo)記和第二標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物；該擴(kuò)增產(chǎn)物在流動(dòng)通過(guò)試紙條時(shí)，首先結(jié)合檢測(cè)劑形成擴(kuò)增產(chǎn)物/檢測(cè)劑復(fù)合物，然后該復(fù)合物進(jìn)一步被捕獲劑捕獲，并在固定捕獲劑的位置處(即，檢測(cè)線處)積累，并最終顯現(xiàn)出有色條帶。另外，為了驗(yàn)證試紙條的有效性，還可以在檢測(cè)線的下游(即，質(zhì)控線處)固定特異性識(shí)別檢測(cè)劑的物質(zhì)(例如羊抗鼠二抗)，從而檢測(cè)劑將在質(zhì)控線處被捕獲和積累，并顯現(xiàn)出有色條帶。此外，為了驗(yàn)證擴(kuò)增過(guò)程的有效性，還可以在擴(kuò)增過(guò)程中添加內(nèi)標(biāo)，并使內(nèi)標(biāo)的擴(kuò)增產(chǎn)物攜帶第一標(biāo)記和第三標(biāo)記(例如，通過(guò)使用帶有第一標(biāo)記(例如FITC)的內(nèi)標(biāo)特異性探針和帶有第三標(biāo)記(例如地高辛)的內(nèi)標(biāo)特異性引物)，并且在檢測(cè)劑下游、質(zhì)控線上游(即，內(nèi)標(biāo)線處)固定有不可移動(dòng)的、特異性識(shí)別第三標(biāo)記的捕獲劑(例如抗地高辛抗體)。由此，在擴(kuò)增過(guò)程中，內(nèi)標(biāo)將被擴(kuò)增并產(chǎn)生攜帶有第一標(biāo)記和第三標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物，該擴(kuò)增產(chǎn)物移動(dòng)通過(guò)試紙條時(shí)將結(jié)合檢測(cè)劑，并被特異性識(shí)別第三標(biāo)記的捕獲劑所捕獲，從而在內(nèi)標(biāo)線處積累并顯色。關(guān)于檢測(cè)試紙條以及相關(guān)檢測(cè)方法的詳細(xì)描述，可參見(jiàn)例如，中國(guó)專利申請(qǐng)200610109620.4和Magda AnastassovaDineva 等人，JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, 2005 年 8 月，第 4015 — 4021 頁(yè)，其全部公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。
[0025]因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，試紙條(6)的檢測(cè)區(qū)(9)包括測(cè)試線，其用于確定目標(biāo)核酸分子是否存在于樣品中；并且任選地包括質(zhì)控線和/或內(nèi)標(biāo)線，其中所述質(zhì)控線用于驗(yàn)證試紙條本身的有效性；所述內(nèi)標(biāo)線用于驗(yàn)證擴(kuò)增過(guò)程的有效性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，試紙條(6 )的檢測(cè)區(qū)(9 )可包括一條或多條測(cè)試線，從而可用于單重或多重檢測(cè)(即，檢測(cè)一種或多重目標(biāo)核酸分子)。
[0026]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，試紙條容納固定區(qū)(7)包括試紙條底座(10)和試紙條上蓋(11 )，其中，試紙條底座部分(10)和試紙條上蓋部分(11)能夠密閉連接且將試紙條
(6)固定在其中。
[0027]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，試紙條底座部分(10)包括用于支撐試紙條(6)的橫隔
(12)、用于試紙條(6)定位的凹槽(13)、用于實(shí)現(xiàn)試紙條(6)的樣品墊區(qū)(8)與檢測(cè)區(qū)(9)物理性分隔的橫隔(14)、用于實(shí)現(xiàn)檢測(cè)管(2)試紙條容納固定區(qū)(7)的試紙條底座部分(10)的上方和試紙條上蓋部分(11)的上方密閉的凸條(15)、用于實(shí)現(xiàn)檢測(cè)管(2)的試紙條容納固定區(qū)(7)的試紙條底座部分(10)的側(cè)邊和試紙條上蓋部分(11)的側(cè)邊密閉的凸點(diǎn)(16)、用于與擴(kuò)增管(I)的螺紋卡口(5)配合的螺紋卡口( 17);并且
[0028]試紙條上蓋部分(11)包括用于將試紙條(6)卡緊的相對(duì)于橫隔(12)的橫隔(18)、用于試紙條(6)定位的相對(duì)于凹槽(13)的凹槽(19)、用于實(shí)現(xiàn)試紙條(6)的樣品墊區(qū)(8)與檢測(cè)區(qū)(9)物理性分隔的相對(duì)于橫隔(14)的橫隔(20)、用于實(shí)現(xiàn)檢測(cè)管(2)的試紙條容納固定區(qū)(7)的試紙條底座部分(10)的上方和試紙條上蓋部分(11)的上方密閉的相對(duì)于凸條(15)的凹槽(21)、用于實(shí)現(xiàn)檢測(cè)管(2)的試紙條容納固定區(qū)(7)的試紙條底座部分(10)的側(cè)邊和試紙條上蓋部分(11)的側(cè)邊密閉的相對(duì)于凸點(diǎn)(16)的凹槽(22)、用于與擴(kuò)增管
(I)實(shí)現(xiàn)密閉的相對(duì)于螺紋卡口( 17 )的螺紋卡口( 23 )。
[0029]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，試紙條上蓋部分(11)還包括用于觀測(cè)試紙條(6)的檢測(cè)區(qū)(9)的透明視窗(24)。
[0030]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在將擴(kuò)增管(I)和檢測(cè)管(2)組裝完畢后，二者構(gòu)成一個(gè)全封閉的環(huán)境，從而防止管內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物外泄，和避免可能的外來(lái)物質(zhì)的污染。
[0031 ] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在將擴(kuò)增管(I)和檢測(cè)管(2 )組裝完畢后，通過(guò)超聲波對(duì)各組裝部件進(jìn)行焊接，和/或，通過(guò)對(duì)所述全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管整體進(jìn)行包膜處理，從而實(shí)現(xiàn)更優(yōu)的密閉效果。
[0032]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，擴(kuò)增管(I)或檢測(cè)管(2)由聚合材料制成。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，擴(kuò)增管(I)或檢測(cè)管(2)由玻璃或塑料制成。
[0033]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸是DNA或RNA。
[0034]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述擴(kuò)增是PCR反應(yīng)。
[0035]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述擴(kuò)增是逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
[0036]在另一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N擴(kuò)增和檢測(cè)樣品中的目的核酸的方法，其包括使用本申請(qǐng)的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管。
[0037]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本申請(qǐng)的方法包括以下步驟:
[0038]a)在擴(kuò)增管(I)內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)；
[0039]b)在擴(kuò)增反應(yīng)完成后，倒轉(zhuǎn)全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管，并且在全封閉條件下，使擴(kuò)增管(I)內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)入檢測(cè)管(2)，并轉(zhuǎn)移至檢測(cè)試紙條(6)上，而無(wú)需打開(kāi)一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管；和
[0040]c)讀取試紙條(6)上的檢測(cè)結(jié)果。
[0041]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟b)中通過(guò)離心或震動(dòng)使擴(kuò)增管(I)內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)入檢測(cè)管(2)，并接觸試紙條(6)的樣品墊區(qū)(8)，然后，擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)毛細(xì)作用遷移經(jīng)過(guò)試紙條(6)的檢測(cè)區(qū)(9)。
[0042]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟c)中，優(yōu)選通過(guò)透明視窗(24)，優(yōu)選通過(guò)肉眼讀取試紙條(6)上的檢測(cè)結(jié)果。
[0043]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在檢測(cè)結(jié)束后，不打開(kāi)所述一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管，并將其整體廢棄于安全處。
[0044]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟a)包括:
[0045]al)將待檢測(cè)的樣品和用于進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的試劑添加至核酸擴(kuò)增區(qū)(4)，并且例如通過(guò)離心或震動(dòng)，使反應(yīng)混合物混勻；
[0046]a2)將檢測(cè)管(2)與擴(kuò)增管(I)密閉連接(例如通過(guò)螺紋卡口(5)、螺紋卡口(17)和螺紋卡口(23));和
[0047]a3)將密閉連接后的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管插入擴(kuò)增儀進(jìn)行核酸擴(kuò)增。
[0048]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸是DNA或RNA。
[0049]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述擴(kuò)增是PCR反應(yīng)。
[0050]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述擴(kuò)增是逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
[0051]在另一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N試劑盒，其包含本申請(qǐng)的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管。本申請(qǐng)的試劑盒可用于在全封閉的條件下，在同一管內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增和檢測(cè)。
[0052]在另一個(gè)方面，還提供了本申請(qǐng)的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管用于進(jìn)行核酸擴(kuò)增和檢測(cè)的用途。核酸擴(kuò)增和檢測(cè)作為一個(gè)通用的平臺(tái)，可廣泛應(yīng)用于各個(gè)方面:例如，其可用于非診斷目的，例如檢測(cè)不與疾病相關(guān)的特定基因或突變的存在；此外，其也可用于診斷目的，例如傳染病的診斷、遺傳疾病的檢測(cè)、產(chǎn)前診斷、法醫(yī)研究等等。
[0053]在另一個(gè)方面，還提供了本申請(qǐng)的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管用于制備試劑盒的用途，所述試劑盒用于進(jìn)行核酸擴(kuò)增和檢測(cè)。
[0054]實(shí)用新型的有益效果
[0055]本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管，以及在所述全封閉一體式管內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增及檢測(cè)的方法。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本申請(qǐng)的技術(shù)方案將核酸擴(kuò)增與試紙檢測(cè)整合至同一密閉式擴(kuò)增與檢測(cè)反應(yīng)管內(nèi)，其具有以下有益效果:
[0056](I)在同一管內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增與試紙條檢測(cè)，即擴(kuò)增與檢測(cè)過(guò)程是全封閉的，可有效防止核酸擴(kuò)增產(chǎn)物外泄，避免交叉污染，并且可有效避免核酸擴(kuò)增與檢測(cè)過(guò)程中的污染；
[0057](2)操作簡(jiǎn)便、快速:不同于傳統(tǒng)的試紙條檢測(cè)方式(其在擴(kuò)增完成后還需進(jìn)行探針添加、孵育和/或稀釋等步驟)，本申請(qǐng)所述的方法僅需在擴(kuò)增完成后倒轉(zhuǎn)反應(yīng)管，通過(guò)離心、震動(dòng)或其他方式，使擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)入檢測(cè)管，并與試紙條接觸，靜置數(shù)分鐘后即可進(jìn)行結(jié)果觀測(cè)；
[0058](3)成本低廉，有效地降低了核酸擴(kuò)增和檢測(cè)的高價(jià)格門檻。[0059]此外，本申請(qǐng)的技術(shù)方案符合國(guó)家衛(wèi)生部門對(duì)核酸診斷試劑的相關(guān)規(guī)定，對(duì)核酸的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)具有重要的意義。
[0060]下面將結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本申請(qǐng)的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，下列附圖和實(shí)施例僅用于說(shuō)明本申請(qǐng)的實(shí)施方案，而不是對(duì)本申請(qǐng)所請(qǐng)求保護(hù)的范圍的限定。根據(jù)附圖和優(yōu)選實(shí)施方案的下列詳細(xì)描述，本申請(qǐng)的各種目的和有利方面對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將變得顯然。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0061]圖1A-圖1D示意性顯示了全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管的結(jié)構(gòu)。其中，圖1A、圖1B、圖1C分別呈現(xiàn)的是正視圖、側(cè)視圖及后視圖。圖1D呈現(xiàn)的是檢測(cè)管(2)的透視圖。
[0062]圖2A-圖2B示意性說(shuō)明了本申請(qǐng)的優(yōu)選全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管的結(jié)構(gòu)。圖2A呈現(xiàn)的是全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管的正視方向分解圖，圖2B呈現(xiàn)的是全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管的后視方向分解圖。其中，試紙條底座部分(10)的凹槽(13)及與其相對(duì)應(yīng)的試紙條上蓋部分(11)的凹槽(19)，用于試紙條定位；試紙條底座部分(10)的橫隔(12)及與其相對(duì)應(yīng)的試紙條上蓋部分(11)的橫隔(18)，用于試紙條(6)的支撐與卡緊；試紙條底座部分(10)的橫隔(14)及與其相對(duì)應(yīng)的試紙條上蓋部分(11)的橫隔(20)，用于實(shí)現(xiàn)試紙條(6)的樣品墊區(qū)(8)與檢測(cè)區(qū)(9)的物理性分隔；試紙條底座部分(10)的凸條(15)及與其相對(duì)應(yīng)的試紙條上蓋部分(11)的凹槽(21)，用于實(shí)現(xiàn)試紙條底座部分(10)與試紙條上蓋部分(11)在上方的密閉；試紙條底座部分(10)的凸點(diǎn)(16)及與其相對(duì)應(yīng)的試紙條上蓋部分(11)的凹槽(22 )，用于實(shí)現(xiàn)試紙條底座部分(10 )與試紙條上蓋部分(11)在側(cè)邊的密閉；試紙條底座部分(10)的螺紋卡口(17)及與其相對(duì)應(yīng)的試紙條上蓋部分(11)的螺紋卡口(23)，用于實(shí)現(xiàn)檢測(cè)管(2)與擴(kuò)增管(I)的密閉；試紙條上蓋部分(11)的透明視窗(24)用于試紙條(6)的檢測(cè)結(jié)果觀測(cè)。
[0063]圖3A-圖3F示意性說(shuō)明了使用本申請(qǐng)的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管進(jìn)行核酸擴(kuò)增與檢測(cè)的流程。其中，圖3A表示，將反應(yīng)試劑注入擴(kuò)增管；圖3B表示，將擴(kuò)增管與檢測(cè)管扣合；圖3C表示，進(jìn)行擴(kuò)增；圖3D表示，在擴(kuò)增后取出全封閉一體式管；圖3E表示，倒轉(zhuǎn)全封閉一體式管并輕甩；圖3F表示，靜置數(shù)分鐘后觀察檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0064]本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管。特別地，圖1A-圖1D和圖2A-圖2B顯示了本申請(qǐng)的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管的一種優(yōu)選實(shí)施方案，其包括相互配合的用于完成擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增管(I)和用于對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)和結(jié)果判讀的檢測(cè)管
(2);其中，擴(kuò)增管(I)包括位于上方的儲(chǔ)液區(qū)(3)及位于下方的核酸擴(kuò)增區(qū)(4)，其中儲(chǔ)液區(qū)(3)內(nèi)部有用于與檢測(cè)管(2)實(shí)現(xiàn)密閉的螺紋卡口(5);檢測(cè)管(2)包括試紙條(6)及試紙條容納固定區(qū)(7)。
[0065]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，試紙條容納固定區(qū)(7)包括試紙條底座部分(10)和試紙條上蓋部分(11)，用于容納和固定試紙條(6 )。其中，試紙條底座部分(10 )的凹槽(13 )及與其相對(duì)應(yīng)的試紙條上蓋部分(11)的凹槽(19)，用于試紙條定位；試紙條底座部分(10)的橫隔(12)及與其相對(duì)應(yīng)的試紙條上蓋部分(11)的橫隔(18)，用于試紙條(6)的支撐與卡緊；試紙條底座部分(10)的橫隔(14)及與其相對(duì)應(yīng)的試紙條上蓋部分(11)的橫隔(20)，用于實(shí)現(xiàn)試紙條(6)的樣品墊區(qū)(8)與檢測(cè)區(qū)(9)的物理性分隔；試紙條底座部分(10)的凸條
(15)及與其相對(duì)應(yīng)的試紙條上蓋部分(11)的凹槽(21)，用于實(shí)現(xiàn)試紙條底座部分(10)與試紙條上蓋部分(11)在上方的密閉；試紙條底座部分(10)的凸點(diǎn)(16)及與其相對(duì)應(yīng)的試紙條上蓋部分(11)的凹槽(22 )，用于實(shí)現(xiàn)試紙條底座部分(10 )與試紙條上蓋部分(11)在側(cè)邊的密閉；試紙條底座部分(10)的螺紋卡口(17)及與其相對(duì)應(yīng)的試紙條上蓋部分(11)的螺紋卡口(23)，用于實(shí)現(xiàn)檢測(cè)管(2)與擴(kuò)增管(I)的密閉；試紙條上蓋部分(11)的透明視窗(24)用于試紙條(6)的檢測(cè)結(jié)果觀測(cè)。
[0066]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在將擴(kuò)增管(I)與檢測(cè)管(2)組裝完畢后，可通過(guò)超聲波對(duì)各組裝部件進(jìn)行焊接，和/或，通過(guò)對(duì)所述全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管整體進(jìn)行包膜處理，以實(shí)現(xiàn)更優(yōu)的密閉效果。
[0067]本申請(qǐng)還提供了一種擴(kuò)增和檢測(cè)樣品中的目的核酸的方法，其包括使用本申請(qǐng)的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管。特別地，圖3A-圖3F顯示了本申請(qǐng)方法的一種優(yōu)選實(shí)施方案，其包括:
[0068]I)將待檢測(cè)的樣品和用于進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的試劑添加至擴(kuò)增管(I)的核酸擴(kuò)增區(qū)
(4)，并且例如通過(guò)離心或震動(dòng)，使反應(yīng)混合物混勻；
[0069]2)通過(guò)螺紋卡口(5)、螺紋卡口( 17)和螺紋卡口(23)將檢測(cè)管(2)與擴(kuò)增管(I)密閉連接(即，扣合)；
[0070]3)將密閉連接后的管插入擴(kuò)增儀進(jìn)行核酸擴(kuò)增；
[0071]4)在擴(kuò)增反應(yīng)完成后，取出全封閉一體式管；
[0072]5)倒轉(zhuǎn)全封閉一體式管，并通過(guò)離心或震動(dòng)使擴(kuò)增管(I)內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)入檢測(cè)管(2)，并轉(zhuǎn)移至檢測(cè)試紙條(6)上；和
[0073]6)通過(guò)透明視窗(24)讀取試紙條(6)上的檢測(cè)結(jié)果。
[0074]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在檢測(cè)結(jié)束后，不打開(kāi)所述一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管，并將其整體廢棄于安全處。
[0075]實(shí)施例
[0076]現(xiàn)參照下列意在舉例說(shuō)明本申請(qǐng)的實(shí)施方案(而非限定本申請(qǐng)所請(qǐng)求保護(hù)的范圍)的實(shí)施例來(lái)描述本申請(qǐng)。
[0077]除非特別指明，本申請(qǐng)中所使用的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法和免疫檢測(cè)法，基本上參照J(rèn).SambiOOk等人，分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人,精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南,第3版,John ffiley&Sons, Inc., 1995中所述的方法進(jìn)行；酶的使用依照產(chǎn)品制造商推薦的條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，實(shí)施例以舉例方式描述本申請(qǐng)的實(shí)施方案，且不意欲限制本申請(qǐng)所要求保護(hù)的范圍。
[0078]實(shí)施例1:全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管
[0079]如圖1A-圖1D和圖2A-圖2B所示，本申請(qǐng)的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管包括相互配合的用于完成擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增管(I)和用于對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)和結(jié)果判讀的檢測(cè)管(2);其中，檢測(cè)管(2)包括試紙條(6)及試紙條容納固定區(qū)(7)。在擴(kuò)增結(jié)束后，將全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管從擴(kuò)增儀從取出，整管倒轉(zhuǎn)并通過(guò)離心、震動(dòng)或其他方式，在全封閉條件下，使擴(kuò)增產(chǎn)物從擴(kuò)增管(I)進(jìn)入檢測(cè)管(2)，并與其中的試紙條(6)接觸，而后，擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)毛細(xì)現(xiàn)象向試紙條檢測(cè)區(qū)(9)遷移，并在檢測(cè)線和/或質(zhì)控線上發(fā)生抗原一抗體的特異性免疫反應(yīng)。
[0080]在本實(shí)施例中，全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管中的擴(kuò)增管(I)包括位于上方的儲(chǔ)液區(qū)(3)及位于下方的核酸擴(kuò)增區(qū)(4)，其中儲(chǔ)液區(qū)(3)內(nèi)部有用于與檢測(cè)管(2)實(shí)現(xiàn)密閉的螺紋卡口(5)。
[0081]同時(shí)，全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管的檢測(cè)管(2)包括試紙條底座部分(10)和試紙條上蓋部分(11)，用于容納和固定試紙條(6)。其中，試紙條底座部分(10)的凹槽
(13)及與其相對(duì)應(yīng)的試紙條上蓋部分(11)的凹槽(19)，用于試紙條定位；試紙條底座部分(10)的橫隔(12)及與其相對(duì)應(yīng)的試紙條上蓋部分(11)的橫隔(18)，用于試紙條(6)的支撐與卡緊；試紙條底座部分(10)的橫隔(14)及與其相對(duì)應(yīng)的試紙條上蓋部分(11)的橫隔(20)，用于實(shí)現(xiàn)試紙條(6)的樣品墊區(qū)(8)與檢測(cè)區(qū)(9)的物理性分隔；試紙條底座部分
(10)的凸條(15)及與其相對(duì)應(yīng)的試紙條上蓋部分(11)的凹槽(21)，用于實(shí)現(xiàn)試紙條底座部分(10)與試紙條上蓋部分(11)在上方的密閉；試紙條底座部分(10)的凸點(diǎn)(16)及與其相對(duì)應(yīng)的試紙條上蓋部分(11)的凹槽(22)，用于實(shí)現(xiàn)試紙條底座部分(10)與試紙條上蓋部分(11)在側(cè)邊的密閉；試紙條底座部分(10)的螺紋卡口( 17)及與其相對(duì)應(yīng)的試紙條上蓋部分(11)的螺紋卡口(23)，用于實(shí)現(xiàn)檢測(cè)管(2)與擴(kuò)增管(I)的密閉；試紙條上蓋部分
(11)的透明視窗(24)用于試紙條(6 )的檢測(cè)結(jié)果觀測(cè)。
[0082]另外，在將擴(kuò)增管(I)與檢測(cè)管(2)組裝完畢后，可通過(guò)超聲波對(duì)各組裝部件進(jìn)行焊接，和/或，通過(guò)對(duì)所述全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管整體進(jìn)行包膜處理，以實(shí)現(xiàn)更優(yōu)的密閉效果。
[0083]實(shí)施例2:應(yīng)用實(shí)施例1的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管進(jìn)行的、以DNA為模板的擴(kuò)增與檢測(cè)
[0084]1、實(shí)驗(yàn)材料
[0085]化學(xué)試劑:LightCyclerFastStart DNA Master HybridizationMixture (Roche, Germany), 二價(jià)續(xù)離子，超純水
[0086]儀器耗材:自制核酸擴(kuò)增儀(參見(jiàn)申請(qǐng)CN201110456811.9);實(shí)施例1的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管，其中檢測(cè)管(2)中的試紙條(6)在上游設(shè)置了標(biāo)記有抗FITC鼠抗體的乳膠顆粒，在下游的檢測(cè)線(T)上固定有鏈霉親和素(SA)，在更下游的質(zhì)控線(C)上固定有羊抗鼠二抗(GAM-1gG)。
[0087]引物:B3F(生物素標(biāo)記的):5’-GGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGC-3’
[0088]B3R:5’ -AGGACAAACGGGCAACATACCTTGATAGT-3’
[0089]探針:B3T(FITC 標(biāo)記的):5，-CATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTT-3，
[0090]檢測(cè)范本1:HBV全長(zhǎng)質(zhì)粒，濃度為IO3拷貝/ml
[0091]檢測(cè)范本2:超純水
[0092]2、實(shí)驗(yàn)方法:
[0093]a)擴(kuò)增試劑的配置:lpmol B3F, lpmol B3R, 0.25pmol B3T, 4 μ I LightCyclerFastStart DNA Master Hybridization Mixture, 4mM 二價(jià)續(xù)離子，10 μ I 檢測(cè)范本 I 或檢測(cè)范本2,總體積40 μ I,剩余體積用超純水補(bǔ)足。
[0094]b)核酸擴(kuò)增:將配置好的擴(kuò)增反應(yīng)混合物添加至擴(kuò)增管(I)的儲(chǔ)液區(qū)(3)中，將檢測(cè)管(2)與擴(kuò)增管(I)扣合，并通過(guò)離心、振動(dòng)或其他方式，使擴(kuò)增反應(yīng)混合物從儲(chǔ)液區(qū)(3)流至核酸擴(kuò)增區(qū)(4)并混勻；將裝有擴(kuò)增反應(yīng)混合物的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管插入自制核酸擴(kuò)增儀，進(jìn)行PCR核酸擴(kuò)增。
[0095]c)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè):將全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管倒置并通過(guò)離心、振動(dòng)或其他方式，在全封閉條件下，使擴(kuò)增產(chǎn)物從擴(kuò)增管(I)進(jìn)入檢測(cè)管(2)，并與試紙條(6)的樣品墊區(qū)(8)接觸并被其吸附，而后，擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)毛細(xì)現(xiàn)象向試紙條的檢測(cè)區(qū)(9)遷移，并依次通過(guò)標(biāo)記有抗FITC鼠抗體的乳膠顆粒、固定有鏈霉親和素(SA)的檢測(cè)線和固定有羊抗鼠二抗(GAM-1gG)的質(zhì)控線，并在檢測(cè)線和質(zhì)控線上發(fā)生特異性相互作用。靜置5分鐘后，即可通過(guò)透明檢測(cè)視窗(24 )肉眼觀測(cè)檢測(cè)結(jié)果。
[0096]實(shí)施例2的檢測(cè)結(jié)果顯示了以HBV全長(zhǎng)質(zhì)粒為范本的檢測(cè)結(jié)果:檢測(cè)線(T線)與質(zhì)控線(C線)均呈紅色。質(zhì)控線(C線)呈紅色說(shuō)明檢測(cè)有效，檢測(cè)線(T線)呈紅色說(shuō)明檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。實(shí)施例2的檢測(cè)結(jié)果還顯示了以超純水為范本的檢測(cè)結(jié)果:檢測(cè)線(T線)不呈色，質(zhì)控線(C線)呈紅色。質(zhì)控線(C線)呈紅色說(shuō)明檢測(cè)有效，檢測(cè)線(T線)不呈色說(shuō)明檢測(cè)結(jié)果為陰性。
[0097]實(shí)施例3:應(yīng)用實(shí)施例1的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管進(jìn)行的、以RNA為模板的擴(kuò)增與檢測(cè)
[0098]1、實(shí)驗(yàn)材料
[0099]化學(xué)試劑:AccessQuickMaster Mix (Promega), AMV Reverse Transcriptase,DEPC 水。
[0100]儀器耗材:自制核酸擴(kuò)增儀(參見(jiàn)申請(qǐng)CN201110456811.9)、實(shí)施例1的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管，其中檢測(cè)管(2)中的試紙條(6)在上游設(shè)置了標(biāo)記有抗FITC鼠抗體的乳膠顆粒，在下游的檢測(cè)線(T)上固定有鏈霉親和素(SA)，在更下游的質(zhì)控線(C)上固定有羊抗鼠二抗(GAM-1gG)。
[0101]引物:C3F(生物素標(biāo)記的):5’-AGTGCCCCGGGAGGTCTCGTAGACCGTG-3’
[0102]C3R: 5，-ACCTGGGGCCCCTGCGCGGCAACAAGTATA-3，
[0103]探針:C3T(FITC 標(biāo)記的):5’ -TCCTAAACCTCAAAGA-3’
[0104]檢測(cè)范本1:HCV血清提取模板，濃度為IO4拷貝/ml
[0105]檢測(cè)范本2 =DEPC水。
[0106]2、實(shí)驗(yàn)方法:
[0107]a)擴(kuò)增試劑的配置:lpmol C3F, lpmol C3R, 0.25pmol C3T, 20 μ I AccessQuickMaster Mix (Promega), AMV Reverse Transcriptase8u, 10 μ I 檢測(cè)范本 I 或檢測(cè)范本 2,總體積40 μ I,剩余體積用超純水補(bǔ)足。
[0108]b)核酸擴(kuò)增:將配置好的擴(kuò)增反應(yīng)混合物添加至擴(kuò)增管(I)的儲(chǔ)液區(qū)(3)中，將檢測(cè)管(2)與擴(kuò)增管(I)扣合，并通過(guò)離心、振動(dòng)或其他方式，使擴(kuò)增反應(yīng)混合物從儲(chǔ)液區(qū)(3)流至核酸擴(kuò)增區(qū)(4)并混勻；將裝有擴(kuò)增反應(yīng)混合物的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管插入自制核酸擴(kuò)增儀，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增。
[0109]c)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè):將全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管倒置并通過(guò)離心、振動(dòng)或其他方式，在全封閉條件下，使擴(kuò)增產(chǎn)物從擴(kuò)增管(I)進(jìn)入檢測(cè)管(2)，并與試紙條(6)的樣品墊區(qū)(8)接觸并被其吸附，而后，擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)毛細(xì)現(xiàn)象向試紙條的檢測(cè)區(qū)(9)遷移，并依次通過(guò)標(biāo)記有抗FITC鼠抗體的乳膠顆粒、固定有鏈霉親和素(SA)的檢測(cè)線和固定有羊抗鼠二抗(GAM-1gG)的質(zhì)控線，并在檢測(cè)線和質(zhì)控線上發(fā)生特異性相互作用。靜置5分鐘后，即可通過(guò)透明檢測(cè)視窗(24)肉眼觀測(cè)檢測(cè)結(jié)果
[0110]實(shí)施例3的檢測(cè)結(jié)果顯示了以HCV血清提取模板為范本的檢測(cè)結(jié)果:檢測(cè)線(T線)與質(zhì)控線(C線)均呈紅色。質(zhì)控線(C線)呈紅色說(shuō)明檢測(cè)有效，檢測(cè)線(T線)呈紅色說(shuō)明檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。實(shí)施例3的檢測(cè)結(jié)果還顯示了以超純水為范本的檢測(cè)結(jié)果:檢測(cè)線(T線)不呈色，質(zhì)控線(C線)呈紅色。質(zhì)控線(C線)呈紅色說(shuō)明檢測(cè)有效，檢測(cè)線(T線)不呈色說(shuō)明檢測(cè)結(jié)果為陰性。實(shí)施例2和3的結(jié)果表明，本申請(qǐng)的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管以及相關(guān)方法不僅適合用于DNA分子的擴(kuò)增與檢測(cè)，而且適用于RNA分子的擴(kuò)增與檢測(cè)。
[0111]實(shí)施例4:應(yīng)用實(shí)施例1的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管進(jìn)行的、含內(nèi)標(biāo)監(jiān)控的、以DNA為范本的擴(kuò)增與檢測(cè)
[0112]1、實(shí)驗(yàn)材料
[0113]化學(xué)試劑:LightCyclerFastStart DNA Master HybridizationMixture (Roche, Germany), 二價(jià)續(xù)離子，超純水
[0114]儀器耗材:自制核酸擴(kuò)增儀(參見(jiàn)申請(qǐng)CN201110456811.9);實(shí)施例1的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管，其中檢測(cè)管(2)中的試紙條(6)在上游設(shè)置了標(biāo)記有抗FITC鼠抗體的乳膠顆粒，在下游的檢測(cè)線(T)上固定有鏈霉親和素(SA)，在內(nèi)標(biāo)線(I)上固定有抗地高辛抗體，在更下游的質(zhì)控線(C)上固定有羊抗鼠二抗(GAM-1gG)。
[0115]引物:B3F(生物素標(biāo)記的):5’-GGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGC-3’
[0116]B3R: 5 ’ -AGGACAAACGGGCAACATACCTTGATAGT-3，
[0117]IF (地高辛標(biāo)記的):5’ -TTGGCGATGGCTGTATCTGTGGGCT-3’
[0118]IR:5’ -AACGGACAAGCGGCAAACCTAGATTGTTA-3’
[0119]探針:B3T(FITC 標(biāo)記的):5’ -CATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTT-3’
[0120]IT (FITC 標(biāo)記的):5，-GCCTCATCCTGCTTGTTGGTTAAGCTGA-3’
[0121]內(nèi)標(biāo):T-1(在 pMD-18T 載體中)
[0122]5，-TTGGCGATGGCTGTATCTGTGGGCTGTTTTATCATCTTCCTCTGGCCTCATCCTGCTTGTTGGTTAAGCTGAGTTGGTTCTTCTGGTAACAATCTAGGTTTGCCGCTTGTCCGTT-3’
[0123]檢測(cè)范本1:HBV全長(zhǎng)質(zhì)粒，濃度為IO3拷貝/ml
[0124]檢測(cè)范本2:超純水。
[0125]2、實(shí)驗(yàn)方法:
[0126]a)擴(kuò)增試劑的配置:lpmol B3F, lpmol B3R, 0.25pmol B3T, lpmol IF, lpmol IR,0.25pmol IT,4 μ I LightCycler FastStart DNA Master Hybridization Mixture,4mM 二價(jià)鎂離子，2 μ I內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒T-1 (濃度為IO5拷貝/ml)，10 μ I檢測(cè)范本I或10 μ I檢測(cè)范本
2,總體積40 μ I,剩余體積用超純水補(bǔ)足。
[0127]b)核酸擴(kuò)增:將配置好的擴(kuò)增反應(yīng)混合物添加至擴(kuò)增管(I)的儲(chǔ)液區(qū)(3)中，將檢測(cè)管(2)與擴(kuò)增管(I)扣合，并通過(guò)離心、振動(dòng)或其他方式，使擴(kuò)增反應(yīng)混合物從儲(chǔ)液區(qū)(3)流至核酸擴(kuò)增區(qū)(4)并混勻；將裝有擴(kuò)增反應(yīng)混合物的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管插入自制核酸擴(kuò)增儀，進(jìn)行PCR核酸擴(kuò)增。[0128]c)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè):將全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管倒置并通過(guò)離心、振動(dòng)或其他方式，在全封閉條件下，使擴(kuò)增產(chǎn)物從擴(kuò)增管(I)進(jìn)入檢測(cè)管(2)，并與試紙條(6)的樣品墊區(qū)(8)接觸并被其吸附，而后，擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)毛細(xì)現(xiàn)象向試紙條的檢測(cè)區(qū)(9)遷移，并依次通過(guò)標(biāo)記有抗FITC抗體的乳膠顆粒、固定有鏈霉親和素(SA)的檢測(cè)線、固定有抗地高辛抗體的內(nèi)標(biāo)線(I)和固定有羊抗鼠二抗(GAM-1gG)的質(zhì)控線，并在檢測(cè)線、內(nèi)標(biāo)線和質(zhì)控線上發(fā)生特異性相互作用。靜置5分鐘后，即可通過(guò)透明檢測(cè)視窗(24)肉眼觀測(cè)檢測(cè)結(jié)果O
[0129]實(shí)施例4的檢測(cè)結(jié)果顯示了以HBV全長(zhǎng)質(zhì)粒為范本的檢測(cè)結(jié)果:檢測(cè)線(T線)、內(nèi)標(biāo)線(I線)與質(zhì)控線(C線)均呈紅色。內(nèi)標(biāo)線(I線)呈紅色說(shuō)明擴(kuò)增有效，質(zhì)控線(C線)呈紅色說(shuō)明試紙條檢測(cè)有效，檢測(cè)線(T線)呈紅色說(shuō)明檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。若質(zhì)控線(C線)和/或內(nèi)標(biāo)線(I線)之任一不呈色，則說(shuō)明擴(kuò)增和/或檢測(cè)有問(wèn)題:內(nèi)標(biāo)線(I線)不呈色說(shuō)明擴(kuò)增存在問(wèn)題；質(zhì)控線(C線)不呈色說(shuō)明檢測(cè)試紙存在問(wèn)題。實(shí)施例4的檢測(cè)結(jié)果還顯示了以超純水為范本的檢測(cè)結(jié)果:檢測(cè)線(T線)不呈色，內(nèi)標(biāo)線(I線)與質(zhì)控線(C線)均呈紅色。內(nèi)標(biāo)線(I線)呈紅色說(shuō)明擴(kuò)增有效，質(zhì)控線(C線)呈紅色說(shuō)明試紙條檢測(cè)有效，檢測(cè)線(T線)不呈色說(shuō)明檢測(cè)結(jié)果為陰性。實(shí)施例4的結(jié)果還表明，本申請(qǐng)的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管以及相關(guān)方法適合用于多重檢測(cè)，即，可用于檢測(cè)一種或多種目標(biāo)核酸分子。
[0130]最后應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是:以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本申請(qǐng)的技術(shù)方案而非對(duì)其進(jìn)行限制。盡管本申請(qǐng)的【具體實(shí)施方式】已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解:根據(jù)已經(jīng)公開(kāi)的所有教導(dǎo)，可以對(duì)細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改和變動(dòng)，并且這些改變均在本申請(qǐng)的保護(hù)范圍之內(nèi)。本申請(qǐng)的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。
【權(quán)利要求】
1.一種全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管，其包括相互配合的用于完成擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增管(1)，和用于對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)和結(jié)果判讀的檢測(cè)管(2)，其中擴(kuò)增管(I)與檢測(cè)管(2)是密閉連接的，并且擴(kuò)增管(I)位于檢測(cè)管(2)的下方，并且檢測(cè)管(2)包括固定在試紙條容納固定區(qū)(7)中的試紙條(6)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管，其特征是，擴(kuò)增管(I)和檢測(cè)管(2)通過(guò)螺紋卡口結(jié)構(gòu)、環(huán)狀卡口結(jié)構(gòu)或凸點(diǎn)鎖扣結(jié)構(gòu)而實(shí)現(xiàn)密閉連接。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管，其特征是，擴(kuò)增管(I)包括儲(chǔ)液區(qū)(3)及核酸擴(kuò)增區(qū)(4)，其中儲(chǔ)液區(qū)(3)位于核酸擴(kuò)增區(qū)(4)的上方。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管，其特征是，擴(kuò)增管(I)通過(guò)螺紋卡口(5)而和檢測(cè)管(2)密閉連接。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管，其特征是，螺紋卡口(5)位于儲(chǔ)液區(qū)(3)的內(nèi)部或者位于儲(chǔ)液區(qū)(3)的外部。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管，其特征是，試紙條(6)包括用于與擴(kuò)增產(chǎn)物接觸的樣品墊區(qū)(8)及用于反應(yīng)和呈現(xiàn)結(jié)果的檢測(cè)區(qū)(9)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管，其特征是，試紙條(6)的檢測(cè)區(qū)(9)包括一條或多測(cè)試線，其用于確定目標(biāo)核酸分子是否存在于樣品中；并且任選地包括質(zhì)控線和/或內(nèi)標(biāo)線，其中所述質(zhì)控線用于驗(yàn)證試紙條本身的有效性；所述內(nèi)標(biāo)線用于驗(yàn)證擴(kuò)增過(guò)程的有效性。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管，其特征是，試紙條容納固定區(qū)(7 )包括試紙條底座(10 )和試紙條上蓋(11)，其中，試紙條底座部分(10 )和試紙條上蓋部分(11)能夠密閉連接且·將試紙條(6 )固定在其中。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管，其特征是，試紙條底座部分(10)包括: 用于支撐試紙條(6)的橫隔(12)， 用于試紙條(6)定位的凹槽(13), 用于實(shí)現(xiàn)試紙條(6)的樣品墊區(qū)(8)與檢測(cè)區(qū)(9)物理性分隔的橫隔(14)， 用于實(shí)現(xiàn)檢測(cè)管(2)試紙條容納固定區(qū)(7)的試紙條底座部分(10)的上方和試紙條上蓋部分(11)的上方密閉的凸條(15)， 用于實(shí)現(xiàn)檢測(cè)管(2)的試紙條容納固定區(qū)(7)的試紙條底座部分(10)的側(cè)邊和試紙條上蓋部分(11)的側(cè)邊密閉的凸點(diǎn)(16 )，和 用于與擴(kuò)增管(I)的螺紋卡口(5)配合的螺紋卡口( 17);并且 試紙條上蓋部分(11)包括: 用于將試紙條(6)卡緊的相對(duì)于橫隔(12)的橫隔(18)， 用于試紙條(6)定位的相對(duì)于凹槽(13)的凹槽(19)， 用于實(shí)現(xiàn)試紙條(6)的樣品墊區(qū)(8)與檢測(cè)區(qū)(9)物理性分隔的相對(duì)于橫隔(14)的橫隔(20)， 用于實(shí)現(xiàn)檢測(cè)管(2)的試紙條容納固定區(qū)(7)的試紙條底座部分(10)的上方和試紙條上蓋部分(11)的上方密閉的相對(duì)于凸條(15)的凹槽(21)， 用于實(shí)現(xiàn)檢測(cè)管(2)的試紙條容納固定區(qū)(7)的試紙條底座部分(10)的側(cè)邊和試紙條上蓋部分(11)的側(cè)邊密閉的相對(duì)于凸點(diǎn)(16)的凹槽(22)，和 用于與擴(kuò)增管(I)實(shí)現(xiàn)密閉的相對(duì)于螺紋卡口( 17)的螺紋卡口(23)。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管，其特征是，試紙條上蓋部分(11)包括用于觀測(cè)試紙條(6 )的檢測(cè)區(qū)(9 )的透明視窗(24 )。
11.根據(jù)權(quán)利要求1一 10任一項(xiàng)所述的全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管，其特征是，在將擴(kuò)增管(I)和檢測(cè)管(2)組裝完畢后，通過(guò)超聲波對(duì)各組裝部件進(jìn)行焊接，和/或，對(duì)所述全封閉一體式核酸擴(kuò)增與檢測(cè)管整·體進(jìn)行包膜處理。
【文檔編號(hào)】C12M1/34GK203639460SQ201320429171
【公開(kāi)日】2014年6月11日 申請(qǐng)日期:2013年7月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月19日
【發(fā)明者】周文彬, 張師音, 葛勝祥, 陳杰裕, 張軍, 夏寧邵 申請(qǐng)人:廈門萬(wàn)泰滄海生物技術(shù)有限公司, 廈門大學(xué)