專(zhuān)利名稱(chēng)：：核酸擴(kuò)增用器件的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因解析技術(shù)。更詳細(xì)地講，涉及核酸擴(kuò)增用器件，所述核酸擴(kuò)增用器件在獨(dú)立地在微珠等固相表面對(duì)作為測(cè)定對(duì)象的mRNA等靶分子進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，使這些靶分子的利用率提高，消除靶分子的混合或過(guò)度擴(kuò)增。
背景技術(shù)：
：在基因序列解析技術(shù)中，對(duì)于作為測(cè)定對(duì)象的mRNA或DNA片段等靶分子，在保存其序列信息的狀態(tài)下對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增是重要的技術(shù)。作為其一例，有利用焦磷酸測(cè)序(Pyrosequencing)的序列解析系統(tǒng)(非專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。該系統(tǒng)中，為了使作為測(cè)定對(duì)象的靶分子在1個(gè)微珠表面上僅為1種，需要實(shí)現(xiàn)靶分子的獨(dú)立擴(kuò)增。另一方面，還有利用通過(guò)油中的水溶液膠束進(jìn)行的分離作為實(shí)現(xiàn)獨(dú)立擴(kuò)增的要素技術(shù)的方法(非專(zhuān)利文獻(xiàn)2)。該方法中，通過(guò)2相(水相、油相)的攪拌，形成水溶液膠束，在該膠束內(nèi)保持微珠、靶分子和核酸擴(kuò)增所需要的一組試劑等，通過(guò)擴(kuò)增儀在微珠表面擴(kuò)增核酸。因此，理想的情況是在l個(gè)膠束內(nèi)放入微珠和靶分子各l個(gè)。但是，對(duì)于全部膠束，實(shí)現(xiàn)這樣的條件是不可能的，通常存在如下情況，即，有微珠但不含靶分子的膠束、反之有靶分子但沒(méi)有微珠的膠束、進(jìn)而放入有多個(gè)微珠和耙分子的膠束、微珠和耙分子都沒(méi)有放入的膠束等(非專(zhuān)利文獻(xiàn)2)。在1個(gè)膠束內(nèi)放入有多個(gè)靶分子的情況下，擴(kuò)增時(shí)發(fā)生它們的混合存在，使序列解析成為不可能。另外，盡管膠束中存在靶分子，但在沒(méi)有放入孩史珠的情況下，靶分子不能在微珠表面擴(kuò)增，導(dǎo)致靶分子的損失。進(jìn)而，在膠束內(nèi)放入有多個(gè)微珠的情況下，由于來(lái)自相同靶分子的擴(kuò)增在多個(gè)微珠表面發(fā)生，因此產(chǎn)生過(guò)度解析的問(wèn)題。進(jìn)而，還報(bào)告有在載玻片等平板表面上生成部分的聚集區(qū)域(集落)的擴(kuò)增方法(非專(zhuān)利文獻(xiàn)3)。該方法是，使用在平板上固定有擴(kuò)增用引物的物質(zhì)，以確保某種距離的濃度分布使靶分子與平板上的引物進(jìn)行互補(bǔ)鏈結(jié)合，之后，利用周邊的引物，反復(fù)進(jìn)行引物延伸和橋狀的互補(bǔ)鏈結(jié)合，從而形成擴(kuò)增物質(zhì)的集落。該方法的問(wèn)題是，由于對(duì)平面上的引物的互補(bǔ)鏈結(jié)合的效率低，因此需要過(guò)量的靶分子，并且如果多個(gè)靶分子接近進(jìn)行互補(bǔ)鏈結(jié)合時(shí)，則擴(kuò)增物的集落結(jié)合，發(fā)生混合。非專(zhuān)利文獻(xiàn)1:NATURE,Vol.437,pp.376-380(2005)非專(zhuān)利文獻(xiàn)2:PNAS，VoU00，No.15，p8817-8822(2003)非專(zhuān)利文獻(xiàn)3:Cell,Vol.l29，p823-837(2007)
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明要解決的問(wèn)題如上所述，現(xiàn)有技術(shù)中，就靶分子的擴(kuò)增來(lái)說(shuō)，存在如下問(wèn)題(1)由于水滴(膠束)內(nèi)沒(méi)有微珠，因此不能對(duì)該膠束內(nèi)的靶分子進(jìn)行解析；(2)膠束內(nèi)存在多個(gè)微珠，生成多個(gè)固定來(lái)自靶分子的擴(kuò)增產(chǎn)物的微珠，形成過(guò)度解析。因此，在稱(chēng)為擴(kuò)增工序的解析前處理的前后，不能維持靶分子的存在比例，即使統(tǒng)計(jì)性地解析得到的序列信息的頻度，也不能得知所用的靶分子的比例，難以應(yīng)用于基因表達(dá)解析。另夕卜，各膠束的大小即容量依賴(lài)于膠束生成時(shí)的攪拌，因此其大小的變動(dòng)很大。故此,擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)的試劑量變動(dòng)，結(jié)果，得到的微珠上的擴(kuò)增物的量也有很大變動(dòng)。因而，例如，在利用上述焦磷酸測(cè)序的解析中，每個(gè)微珠的信號(hào)量大幅變動(dòng)，因此存在檢測(cè)系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)范圍(dynamicrange)不足，存在發(fā)生由檢測(cè)限以下或超出檢測(cè)靈敏度引起的無(wú)法檢測(cè)的事故這樣的問(wèn)題。本發(fā)明的課題是解決這些現(xiàn)有技術(shù)的問(wèn)題，提供高效率高精度的核酸擴(kuò)增用器件。解決問(wèn)題的手段本發(fā)明人等，為了解決上述問(wèn)題，想出了能夠使直徑數(shù)十微米以下的微小微珠一個(gè)一個(gè)地反應(yīng)、大規(guī)才莫的平行擴(kuò)增用器件。也就是說(shuō)，本發(fā)明涉及核酸擴(kuò)增用器件，作為一個(gè)例子，其為平面狀配置多個(gè)反應(yīng)池的核酸擴(kuò)增用器件，所述反應(yīng)池具有1組能夠保持1個(gè)第1微珠的第1空間和與所述第1空間相對(duì)的第2空間，該核酸擴(kuò)增用器件的特征在于，按照使所述第l微珠不位于從所述平面狀的面看時(shí)的所述第1空間和所述第2空間不重疊的區(qū)域的方式來(lái)配置所述第1空間和所述第2空間。某實(shí)施方式中，纟敫珠保持空間(能夠保持1個(gè)第14鼓珠的第1空間)和試劑反應(yīng)空間(相對(duì)的第2空間)直接上下連接。這時(shí)，相對(duì)于1微珠的直徑r，各空間的高度和直徑滿足以下條件，從而按照使1個(gè)微小反應(yīng)池保持1個(gè)微珠的方式來(lái)構(gòu)成反應(yīng)池(微小反應(yīng)池)1)微珠保持空間的高度大于1/2r且小于3/2r;2)微珠保持空間的高度和試劑保持空間的高度之和為2r以下；3)微珠保持空間的直徑大于r且小于2r。微珠保持空間和試劑反應(yīng)空間也可以用細(xì)管連接，所述細(xì)管具有比微珠的直徑小的直徑。本發(fā)明還提供一種核酸擴(kuò)增用器件，其具有這樣的結(jié)構(gòu)平面狀配置多個(gè)微小反應(yīng)池，所述微小反應(yīng)池具有1組能夠僅保持1個(gè)解析用微珠的微珠保持空間1、不保持微珠的試劑反應(yīng)空間和能夠僅保持1個(gè)與所述解析用微珠不同種類(lèi)的微珠的微珠保持空間2。該器件，例如可以使預(yù)先固定有試樣核酸的微珠保持于微珠保持空間2。某個(gè)實(shí)施方式中，試劑反應(yīng)空間位于微珠保持空間1和微珠保持空間2之間。此時(shí)，對(duì)于微珠的直徑r,各空間的高度和直徑滿足以下條件，從而按照使1個(gè)微小反應(yīng)池保持1個(gè)微珠的方式來(lái)構(gòu)成1)微珠保持空間1和2的高度大于1/2r且小于3/2r;2)微珠保持空間1或2的高度和試劑保持空間的高度之和為2r以下；3)微珠保持空間1和2的直徑大于r且小于2r。另外的實(shí)施方式中，微珠保持空間1和微珠保持空間2用細(xì)管連接，所述細(xì)管具有比微珠的直徑小的直徑。本發(fā)明的器件中，所述微小反應(yīng)池能夠通過(guò)組裝而流通池(flowcell)化，另外，通過(guò)設(shè)置覆蓋其開(kāi)口面的部件(上板)，各微小反應(yīng)池的獨(dú)立化成為可能。該覆蓋開(kāi)口面的部件(上板)最好具有含密封材料等彈性材料的層。另夕卜，微小反應(yīng)池的與流通池接觸的空間的壁面不一定必須是垂直的，通過(guò)按照朝流通池側(cè)打開(kāi)來(lái)使其傾斜，可以使多余的微珠容易流出。發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明，在大規(guī)模平行型核酸序列技術(shù)中，能夠減少不實(shí)施解析的靶分子，提高應(yīng)用于基因表達(dá)解析時(shí)的解析精度。另外，能夠減少大規(guī)模平行解析時(shí)不能解析的試樣，使解析效率提高。圖l是器件的部分截面圖。圖2是器件的整體圖。圖3是微小反應(yīng)池的擴(kuò)大圖。圖4是將器件流通池化的組裝圖。圖5是說(shuō)明微珠被保持于微珠保持空間的構(gòu)造的圖。圖6是說(shuō)明微珠保持及流出的圖。圖7是說(shuō)明試劑反應(yīng)空間的直徑大、微珠保持空間的第1微珠和第2微珠不接觸時(shí)，微珠保持及流出的圖。圖8是說(shuō)明試劑反應(yīng)空間的壁面傾斜時(shí)，微珠保持及流出的圖。圖9是表示微小反應(yīng)池的獨(dú)立化的圖。圖10是表示上板具有2層結(jié)構(gòu)的構(gòu)成的圖。圖ll是微小反應(yīng)池被獨(dú)立化的器件的整體圖。圖12是說(shuō)明使用2種微珠的器件的微珠保持及流出的圖。圖13是說(shuō)明第2種微珠比第l種微珠大時(shí)，微珠保持及流出的圖。圖14是將2種微珠1個(gè)1個(gè)地獨(dú)立化的微小反應(yīng)池的圖。圖15是說(shuō)明第2種微珠比第l種微珠小時(shí)，微珠保持及流出的圖。圖16是說(shuō)明2個(gè)空間用細(xì)管連接的結(jié)構(gòu)的微小反應(yīng)池的圖。圖17是表示器件的流通池化的圖。圖18是表示微小反應(yīng)池的獨(dú)立化的圖。圖19是表示第l種微珠保持空間和第2種微珠保持空間用細(xì)管連接的構(gòu)成的圖。圖20是說(shuō)明第1種微珠保持空間和第2種微珠保持空間用細(xì)管連接的構(gòu)成中，微珠保持及流出的圖。圖21是說(shuō)明1個(gè)微珠被微小反應(yīng)池捕捉的情況的圖。符號(hào)說(shuō)明101......微小反應(yīng)池；301……微珠保持空間；302......試劑反應(yīng)空間；310……微珠保持空間高度；311……試劑反應(yīng)空間高度；320……微珠保持空間直徑；321……試劑反應(yīng)空間直徑；401……平行擴(kuò)增器件；402……上板；403…...隔離(spacer)材料；404…...成為流通池的空間；405……流入口；406……排出口；501,502……微珠；503……空間；601,701……觸點(diǎn)；702……角度；901……上板；902……試劑反應(yīng)空間；1001……主體；1002……密封材料；1202……微珠；1201……微小反應(yīng)池；1203……微珠保持空間；1204……上板；1205……密封材料；1303……上板；1301,1302……微珠；1401……上板；1402……密封材料；1601,1604,1607...…直徑；1602,1605,1608……高度；1603……第1空間；1606……第2空間；1609……細(xì)管；1701……下板；1702……上板；1703,1704……微珠；1801……下板；1902,1901……微珠；2001……試劑反應(yīng)空間；2002……瓊脂糖凝膠(Sepharose)擴(kuò)增用微珠；2003……氧化鋯微珠；2101……微珠；2102,2104……捕捉空間(2012和2103之間,2104和2105之間......試劑反應(yīng)空間)。具體實(shí)施例方式通過(guò)本發(fā)明的實(shí)施例詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。實(shí)施例1器件的基本構(gòu)成實(shí)施例1表示本發(fā)明的器件的基本構(gòu)成。圖1是本發(fā)明的對(duì)作為靶分子的核酸進(jìn)行平行擴(kuò)增的器件的部分截面圖。圖2表示器件的整體圖。圖2的虛線部分A-A，的截面圖是圖1。這里，表示的是在長(zhǎng)方形的平板表面具有多個(gè)微小反應(yīng)池101的結(jié)構(gòu)，但本發(fā)明的器件不限于此。圖3是微小反應(yīng)池的截面。本實(shí)施例中，微小反應(yīng)池具有圓柱狀的微珠保持空間301和圓柱狀的試劑反應(yīng)空間302。各自的高度和直徑設(shè)定為310、311和320、321。這里，池的形狀，只要能夠獲得后述的本發(fā)明的效果，就不限于圓柱狀。高度310和直徑320按照以下條件來(lái)設(shè)計(jì)。所用的微珠的直徑設(shè)定為r的話，首先，是高度(310)滿足(1/2r)<高度(310)<(3/2r)的條件。高度(310)和高度(311)之和為2r以下。另外，關(guān)于直徑，微珠保持空間的直徑320需要滿足r〈直徑(320)<2r。通過(guò)該條件，能夠在反應(yīng)池保持1個(gè)微珠。器件的流通池化圖4表示器件的流通池化。如圖4所示，器件具有重疊有平行擴(kuò)增器件401、上板402和隔離材料403的結(jié)構(gòu)，在隔離材料403的中央部分具有成為流通池的空間404?？臻g404投影于器件上的407。器件上的^f敫小反應(yīng)池組用410表示。上板402具有流入口405和排出口406，從流入口405流入含有微珠的溶液，從而使微珠保持于流通池內(nèi)的微小反應(yīng)池。圖5表示微珠被保持于微珠保持空間的構(gòu)造。圖5中，圖示有微珠501和微珠502。空間503凈皮含有孩史珠的溶液充滿，左為流入口側(cè)，右為排出口側(cè)，溶液左右地反復(fù)流動(dòng)，一部分微珠如圖所示地落入微小反應(yīng)池內(nèi)。微珠501進(jìn)入微小反應(yīng)池的微珠保持空間，在左右的溶液流動(dòng)中，由于不容易流出，因此被保持在微珠保持空間。另一方面，微珠502通過(guò)試劑的流動(dòng)，再次流出到流路部分。圖6是表示微珠的保持及流出的圖。微珠501和502接觸的狀態(tài)下，微珠502在觸點(diǎn)601與池的壁面接觸。微珠的切線與壁面的延長(zhǎng)上的微珠接觸的面所成的角用602表示，其不為0時(shí)，隨著試劑的流動(dòng)，孩i珠流出。因此，如圖6所示，在微珠保持空間有1個(gè)微珠的狀態(tài)下，如果第2微珠502與池接觸的角度相比于池壁面與微珠切線一致的條件為正數(shù)的話，第2孩t珠502被排出，因此對(duì)于1個(gè)微小反應(yīng)池，成為僅保持1個(gè)微珠的條件。圖7表示試劑反應(yīng)空間的直徑321大，微珠保持空間的第1微珠與第2微珠不接觸的例子。此時(shí)也同樣地，如果成為對(duì)于觸點(diǎn)701,角度702為正數(shù)的條件，則對(duì)于l個(gè)微小反應(yīng)池，可以期待僅保持l個(gè)微珠。為了使角度702為正數(shù)，高度311需要是高度(311)<(1/2r)。圖8表示試劑反應(yīng)空間的壁面為傾斜的例子。如圖所示，使試劑反應(yīng)空間的壁面相對(duì)于流動(dòng)為不垂直，向外側(cè)傾斜，則第2微珠變得更容易排出。如上所述，本發(fā)明的器件按照1個(gè)微小反應(yīng)池保持1個(gè)微珠的方式來(lái)構(gòu)成(1個(gè)微珠/1個(gè)微小反應(yīng)池)。通過(guò)左右振動(dòng)試劑數(shù)次，能夠容易地使幾乎所有反應(yīng)池保持有微珠。9試劑反應(yīng)空間的獨(dú)立化和核酸擴(kuò)增如果達(dá)到1個(gè)微珠/1個(gè)微小反應(yīng)池的條件，則剩余的微珠全部通過(guò)流通池排出。然后，流通池內(nèi)，流入靶分子和核酸擴(kuò)增所需要的引物、酶等試劑，充滿微小反應(yīng)池。此時(shí)，每1個(gè)池的試劑的容量是微小反應(yīng)池的容量減去1微珠的體積得到的。因此，靶分子的濃度稀釋至1個(gè)池只裝入1分子的程度。這里，稀釋大的話，則不含靶分子的比例變高，但本發(fā)明中，由于在擴(kuò)增結(jié)束后4企測(cè)擴(kuò)增的有無(wú)，因此沒(méi)有問(wèn)題。反而，降低2分子同時(shí)裝入反應(yīng)池的可能性是很重要的。圖9表示微小反應(yīng)池(試劑反應(yīng)空間)的獨(dú)立化。如圖9所示，注入試劑后，通過(guò)拆除流通池，將上板901設(shè)置在池上，使得各微小反應(yīng)池和池內(nèi)的試劑反應(yīng)空間902可以被獨(dú)立化。其結(jié)果是，在具有1個(gè)微珠的各個(gè)微小反應(yīng)池中，能夠獨(dú)立實(shí)施核酸擴(kuò)增。圖IO是上板具有2層結(jié)構(gòu)的例子。如圖所示，上板具有主體1001和硅橡膠等有彈性的薄密封材料1002的2層結(jié)構(gòu)，從而能夠?qū)崿F(xiàn)更確實(shí)的試劑反應(yīng)空間的獨(dú)立化。圖ll表示將試劑反應(yīng)空間獨(dú)立化的器件的整體圖。如圖ll所示，通過(guò)被l片上板(本圖中，是主體1101和密封材料1102的2層結(jié)構(gòu))覆蓋，使得全部微小反應(yīng)池在空間上成為獨(dú)立。圖11的結(jié)構(gòu)的情況下，如果器件的厚度為2mm以下，則使用以往的載玻片用擴(kuò)增儀，就可以容易地實(shí)施核酸擴(kuò)增。核酸擴(kuò)增后，回收全部微珠，檢測(cè)核酸擴(kuò)增的有無(wú)。核酸擴(kuò)增的有無(wú)可以通過(guò)現(xiàn)有報(bào)道(PNAS，VoU00,No.l5，p8817-8822(2003))所記載的方法等來(lái)檢測(cè)。實(shí)施例2這里，作為本實(shí)施例，使用直徑50,的微珠作為固相，說(shuō)明研究DNA擴(kuò)增的結(jié)果。首先，所利用的微小反應(yīng)池的尺寸，在圖3中，直徑320是80pm，直徑321是50(Vm，高度310和高度311分別是40ixm和20^im。微小反應(yīng)池，是利用以聚碳酸酯作為材料的納米壓印(Nanoimprint)形成來(lái)制作的。微小反應(yīng)池，在制作時(shí)顯示疏水性，但通過(guò)表面處理能夠?qū)崿F(xiàn)親水化。例如，熟知的方法有用含有PEG等兩親性聚合物的水溶液洗滌表面，或者照射幾分鐘程度的紫外線燈等方法(Anal.Chem.2001,73,4196-4201)。我們通過(guò)照射水銀燈(40mW/cm2)IO分鐘，在抑制著色的同時(shí)實(shí)現(xiàn)親水化。所利用的微珠是以氧化鋯為材料的微珠。氧化鋯微珠，比重大至5~6,可以通過(guò)自重容易地沉降在池中，因此容易制作1個(gè)微珠的狀態(tài)。微珠表面具有由表面以C12連接鏈(linker)連接的20堿基的低聚物。其與擴(kuò)增對(duì)象DNA分子的擴(kuò)增用引物的單側(cè)是相同序列，作為擴(kuò)增用引物發(fā)揮作用。這里，擴(kuò)增對(duì)象是mRNA時(shí)，可以利用在微珠表面結(jié)合有由表面以C12連接鏈連接(polyT)的低聚物的物質(zhì)。這時(shí)，也能夠應(yīng)用特開(kāi)2007-319028記載的技術(shù)。本實(shí)施例中，用上板覆蓋時(shí)的微小反應(yīng)池的總?cè)萘繛榧s4128pL。1個(gè)微珠的體積為約65pL，因此具有1個(gè)微珠的微小反應(yīng)池的反應(yīng)溶液總量成為約4063pL。如果將擴(kuò)增對(duì)象試樣DNA調(diào)整為最終濃度約0.4fmol/L以下，則可以實(shí)現(xiàn)1微小反應(yīng)池內(nèi)1分子?；虻臄U(kuò)增如下。作為裝入微小反應(yīng)池的反應(yīng)液，除了試樣DNA以外，還使用了表1組成的PCR反應(yīng)溶液。F引物是與微珠表面固定的序列相同的引物。擴(kuò)增的溫度循環(huán)為94°C15秒鐘，56。C30.秒鐘，70°C30秒鐘，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。結(jié)果，在微珠表面可以得到連接于F引物的單鏈化DNA擴(kuò)增物。表lPCR擴(kuò)增試劑條件<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實(shí)施例3本發(fā)明中，微小反應(yīng)池表述為圓柱狀和圓錐狀。就利用球形的微珠來(lái)說(shuō)，認(rèn)為，圓柱狀和圓錐狀的形狀，與樣i珠的水平方向的中心截面形狀相似，試劑反應(yīng)空間從中心360度各向同性擴(kuò)展，因此適于擴(kuò)增物向微珠的固定。但是，根據(jù)本發(fā)明的目的，形狀不限于圓柱狀和圓錐狀。進(jìn)一步來(lái)講，從制造上的適宜性來(lái)看，有時(shí)其他形狀是合適的。例如，如前所述，作為器件，利用有機(jī)樹(shù)脂的納米壓印形成時(shí)，其制造中所使用的壓模制作的筒便性，在實(shí)際中是重要的。壓模，例如容易利用多在通常的半導(dǎo)體制造工藝中所利用的掩模和光曝光帶來(lái)的形成。但是，這時(shí)，作為描畫(huà)為掩模的形狀，含有曲線這是增加工藝的一個(gè)原因。因此，我們發(fā)現(xiàn)，制作近似于圓形的6角形的池，達(dá)到同樣的功能。圖21是微小反應(yīng)池捕捉1個(gè)微珠時(shí)的說(shuō)明圖。(1)是圓柱狀，(2)是6角形狀的例子。捕捉微珠2101時(shí)，圓柱狀時(shí)捕捉空間以2102顯示，試劑反應(yīng)空間成為2102和2103所夾的區(qū)域。如果微小反應(yīng)池由6角柱構(gòu)成，則捕捉空間以2104顯示，試劑反應(yīng)空間成為2104和2105所夾的區(qū)域。這時(shí)，確認(rèn)具有與圓柱狀的池同樣的功能。實(shí)施例4實(shí)施例4中，顯示了將具有2種不同微珠保持空間的微小反應(yīng)池1對(duì)1獨(dú)立化而具備的器件。圖12是，在保持第1種微珠1202的微小反應(yīng)池1201上，設(shè)置具有第2種微珠保持空間1203的上板1204和密封材料1205的狀態(tài)。將該器件與實(shí)施例1的圖4的器件401同樣地，進(jìn)行流通池化，流入含有第2種微珠的試劑。圖13表示在由上板1303流通池化的器件中，第2種孩i珠1301和1302的流入和保持。圖13中，特別表示了第2種微珠比第1種微珠1202大的例子。這時(shí)，與實(shí)施例1同樣地，第2種微珠中，微珠1301保持于微珠保持空間1203，但微珠1302不被保持而再次流出。結(jié)果，微小反應(yīng)池中，第1種微珠1202和第2種微珠1301各被保持1個(gè)。圖14表示通過(guò)用上板覆蓋而獨(dú)立化的微小反應(yīng)池。如圖14所示，上述操作后，通過(guò)設(shè)置上板1401和密封材料1402，能夠?qū)崿F(xiàn)微小反應(yīng)池的獨(dú)立化。通過(guò)該構(gòu)成，能夠?qū)U(kuò)增前的試樣固定于一方的微珠表面，將擴(kuò)增物固定于另一方的孩i珠表面。圖15是第2種微珠比第l種微珠小的例子。這樣的情況下，通過(guò)與上述相同的操作，可以實(shí)現(xiàn)微小反應(yīng)池的獨(dú)立化。實(shí)施例5實(shí)施例5中，顯示了具有用細(xì)管連接微珠保持空間和試劑反應(yīng)空間的結(jié)構(gòu)的器件。圖16表示用細(xì)管連接2個(gè)空間的結(jié)構(gòu)。這里，用直徑1607、高度1608的細(xì)管1609連接直徑1601、高度1602的第1空間1603和直徑1604、高度1605的第2空間1606。該器件中，第1空間作為微珠保持空間，第2空間作為試劑反應(yīng)空間。圖17表示本器件的流通池化。如圖17所示，在通過(guò)下板1701關(guān)閉第2空間的狀態(tài)下，與圖4同樣地，使用上板1702進(jìn)行流通池化，導(dǎo)入含有微珠的水溶液，則微珠1703被保持。微珠1704,與前述的例子同樣地，再次流出，因此達(dá)到微小反應(yīng)池保持1個(gè)微珠的狀態(tài)。圖18表示微小反應(yīng)池(試劑反應(yīng)空間)的獨(dú)立化。如圖18所示，拆除流通池，用板材關(guān)閉第1空間，使上下反轉(zhuǎn)，則如圖18，可以達(dá)到具有用下板1801關(guān)閉的微珠保持空間的器件。在該狀態(tài)下，如果卸下板1701,與圖4同樣地進(jìn)行流通池化，則能夠?qū)⒃噭?dǎo)入試劑反應(yīng)空間。另外，如圖18,如果再次設(shè)置板170h則可以達(dá)到微小反應(yīng)池(試劑反應(yīng)空間)的獨(dú)立化。實(shí)施例6實(shí)施例6表示具有用細(xì)管連接第1種微珠保持空間和第2種微珠保持空間的結(jié)構(gòu)的器件。圖19表示用細(xì)管連接第1種微珠保持空間和第2種微珠保持空間的將誒過(guò)后。與實(shí)施例同樣地，通過(guò)使第2種微珠1901和1902流入、使微珠1902流出流通池化的器件，微小反應(yīng)池中可以保持第1種微珠和第2種微珠1901各1個(gè)。圖20表示試劑反應(yīng)空間的獨(dú)立化。如圖20所示，注入試劑后，通過(guò)拆除流通池，在池上設(shè)置上板，可以實(shí)現(xiàn)含有2種微珠各1個(gè)的微小反應(yīng)池的獨(dú)立化。這時(shí)，試劑反應(yīng)空間是以2001表示的圓柱狀的空間，兼為2個(gè)微珠保持空間的連接部。本例的適宜的應(yīng)用方法如下。在微珠表面擴(kuò)增DNA時(shí)，以及使用微珠表面存在的擴(kuò)增物實(shí)施各種檢測(cè)、測(cè)定、序列確定等時(shí)，需要的微珠的性能不同的情況很多。例如，在微珠表面擴(kuò)增DNA時(shí)，要求作為擴(kuò)增反應(yīng)試劑的成分的引物和酶難以吸附于微珠表面，因此經(jīng)常利用以瓊脂糖凝膠(sepharose)或瓊脂糖(agarose)等親水性聚合物作為原料的微珠。另一方面，就使用存在于微珠表面的擴(kuò)增物，實(shí)施各種檢測(cè)、測(cè)定和序列確定等的情況來(lái)說(shuō)，該利用在流通池內(nèi)實(shí)施時(shí)，就流通來(lái)說(shuō)，為了不發(fā)生樣&朱的流出，孩b朱比重大的物質(zhì)容易利用。因此，利用氧化硅微珠、氧化鋯微珠、各種塑料微珠、金屬微珠等。本實(shí)施例為，事先，在前述實(shí)施例中說(shuō)明的那樣的工序中，在瓊脂糖凝膠擴(kuò)增用微珠2002的表面擴(kuò)增擴(kuò)增物，作為測(cè)定用微珠2003，利用比重大的氧化鋯微珠。試劑反應(yīng)空間填滿可以以微珠2002表面的DNA為模板實(shí)施PCR擴(kuò)增的試劑。在該條件下，裝載于擴(kuò)增儀，通過(guò)在微小反應(yīng)池內(nèi)實(shí)施PCR擴(kuò)增，在測(cè)定用微珠2003表面擴(kuò)增了解析對(duì)象的DNA擴(kuò)增物。工業(yè)上的可應(yīng)用性本發(fā)明能夠應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)療、食品等需要基因解析技術(shù)的一切領(lǐng)域。權(quán)利要求1.核酸擴(kuò)增用器件，其為平面狀地配置多個(gè)反應(yīng)池的核酸擴(kuò)增用器件，所述反應(yīng)池具有1組能夠保持1個(gè)第1微珠的第1空間和與所述第1空間相對(duì)的第2空間，該核酸擴(kuò)增用器件的特征在于，按照使所述第1微珠不位于從所述平面狀的面看時(shí)的所述第1空間和所述第2空間不重疊的區(qū)域的方式來(lái)配置所述第1空間和所述第2空間。2.根據(jù)權(quán)利要求1記載的核酸擴(kuò)增用器件，其中，所述第2空間不保持所述第1孩t珠以外的微珠。3.根據(jù)權(quán)利要求2記載的核酸擴(kuò)增用器件，其中，對(duì)于所述第1微珠的直徑r，滿足下述1)~3)的條件1)所述第1空間的高度大于1/2r且小于3/2r;2)所述第1空間的高度和試劑保持空間的高度之和為2r以下；3)所述第1空間的直徑大于r且小于2r。4.根據(jù)權(quán)利要求1記載的核酸擴(kuò)增用器件，其中，所述第1空間和所述第2空間用細(xì)管連接，所述細(xì)管具有比所述第1微珠的直徑小的直徑。5.根據(jù)權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)記載的核酸擴(kuò)增用器件，其中，所述反應(yīng)池被流通池化。6.根據(jù)權(quán)利要求5記載的核酸擴(kuò)增用器件，其中，所述反應(yīng)池的與流通池接觸的空間的壁面以朝著流通池側(cè)打開(kāi)的方式傾斜。7.根據(jù)權(quán)利要求1~6中任一項(xiàng)記載的核酸擴(kuò)增用器件，其中，具有根據(jù)需要設(shè)置在所述反應(yīng)池的開(kāi)口面上的、能夠?qū)⒏魉龇磻?yīng)池獨(dú)立化的部件。8.根據(jù)權(quán)利要求7記載的核酸擴(kuò)增用器件，其中，所述部件具有含彈性材料的層。9.根據(jù)權(quán)利要求1記載的核酸擴(kuò)增用器件，其中，能夠在所述第2空間保持1個(gè)與所述第1微珠不同的第2微珠。10.根據(jù)權(quán)利要求9記載的核酸擴(kuò)增用器件，其中，所述第1空間和所述第2空間之間具有發(fā)生試劑反應(yīng)的第3空間。11.根據(jù)權(quán)利要求IO記載的核酸擴(kuò)增用器件，其中，對(duì)于所述第l微珠的直徑r,滿足下述1)~3)的條件1)所述第1微珠保持空間1和2的高度大于l/2r且小于3/2r;2)所述第1空間或所述第2空間和所述第3空間的高度之和為2r以下；3)所述第1空間和所述第2空間的直徑大于r且小于2r。12.根據(jù)權(quán)利要求9記載的核酸擴(kuò)增用器件，其中，所述第1空間和所述第2空間用細(xì)管連接，所述細(xì)管具有比所述第l微珠的直徑小的直徑。全文摘要本發(fā)明提供一種核酸擴(kuò)增用器件。所述核酸擴(kuò)增用器件能夠在試樣的獨(dú)立化擴(kuò)增過(guò)程的前后，維持靶分子的存在比例，得到能應(yīng)用于基因表達(dá)解析的高精度的解析結(jié)果。本發(fā)明的核酸擴(kuò)增用器件具有平面狀地配置多個(gè)微小反應(yīng)池的結(jié)構(gòu)，所述反應(yīng)池具有1組微珠保持空間和試劑反應(yīng)空間，所述微珠保持空間能夠僅保持1個(gè)解析用微珠，所述試劑反應(yīng)空間不保持微珠但具有能夠進(jìn)行試劑反應(yīng)的充分的容積。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101514320SQ200810181448公開(kāi)日2009年8月26日申請(qǐng)日期2008年11月13日優(yōu)先權(quán)日2008年2月21日發(fā)明者梶山智晴,白井正敬,神原秀記申請(qǐng)人:株式會(huì)社日立制作所