循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本實(shí)用新型屬于生物及醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種將血液樣品中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞從混合細(xì)胞群體中高純度分離出來(lái)的系統(tǒng)。所述循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離系統(tǒng)，包括進(jìn)樣模塊、第一微流控芯片、釋放模塊和收集模塊，所述樣品準(zhǔn)備模塊用于將血液處理為檢測(cè)樣品，所述進(jìn)樣模塊用于將檢測(cè)樣品注入第一微流控芯片，所述第一微流控芯片用于提取檢測(cè)樣品中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，所述釋放模塊用于使循環(huán)腫瘤細(xì)胞脫離第一微流控芯片獲得采集樣品，所述收集模塊用于收集采集樣品。本實(shí)用新型提供的技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有系統(tǒng)簡(jiǎn)單，易于實(shí)現(xiàn)；成本更低；操作簡(jiǎn)單，自動(dòng)化控制。
【專利說(shuō)明】循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離系統(tǒng)【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型屬于生物及醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種將血樣中循環(huán)腫瘤細(xì)胞從混合細(xì)胞群體中高純度分離出來(lái)的系統(tǒng)。
【背景技術(shù)】
[0002]稀有細(xì)胞是指生物樣本中存在的數(shù)量稀少卻具有重要生物學(xué)功能或臨床檢測(cè)意義的細(xì)胞，如人外周血中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞、循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞、被病毒感染的細(xì)胞，孕婦外周血中的胎兒細(xì)胞，以及實(shí)體腫瘤中的腫瘤干細(xì)胞等。由于稀有細(xì)胞數(shù)量極其稀少，在大量背景細(xì)胞的干擾下通常無(wú)法直接進(jìn)行檢測(cè)，因此必須發(fā)展高效、快速的將稀有細(xì)胞從復(fù)雜生物樣本中分離出來(lái)的方法與設(shè)備。
[0003]人外周血中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)是一類具有代表性的稀有細(xì)胞，它是指自發(fā)或因診療操作由腫瘤病灶播散進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，并在一定條件下可發(fā)展為腫瘤轉(zhuǎn)移性病灶(Racila E, Euhus D, Weiss AJ, et al.Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.1998, 95, 4589-4594; Pantel K, Brakenhoff RH, Nat.Rev.Cancer2004, 4，448-456 ; Zhe XN, Cher ML, Bonfil RD, Am.J.CancerRes.2011, I,740-751;Butler TP,Gullino PM,Cancer Res.1975，35，512-516)。由于超過(guò)90%的癌癥死亡是由轉(zhuǎn)移造成的(Mehlen P, Puisieux A, Nat.Rev.Cancer2006, 6, 449 - 458),而循環(huán)腫瘤細(xì)胞是腫瘤轉(zhuǎn)移灶的直接來(lái)源(DawoodS,Cristofanilli M, Curr.Treat Options Oncol.2007，8，89-95;Fidler IJ, Nat.Rev.Cancer2003, 3，453 - 458)，因此循環(huán)腫瘤細(xì)胞是一種具有重大生物學(xué)意義和臨床價(jià)值的稀有細(xì)胞，從血液中檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞越來(lái)越引起人們的重視。但是，循環(huán)腫瘤細(xì)胞在外周血中含量極少，每IOmL血液可能僅含幾個(gè)到幾十個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞，卻有高達(dá)約I億個(gè)白細(xì)胞和 500億個(gè)紅細(xì)胞(Zhe XN, Cher ML, Bonfil RD, Am.J.Cancer Res.2011，1，740-751)，在數(shù)量巨大的背景細(xì)胞的干擾下無(wú)法對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞直接檢測(cè)，這種檢測(cè)包括基因突變、表面標(biāo)志物、細(xì)胞活性、分泌蛋白譜`以及力學(xué)性質(zhì)等，所以將循環(huán)腫瘤細(xì)胞從外周血中分離出來(lái)成為循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)前的必須的步驟。
[0004]國(guó)際上已有多家公司致力于開(kāi)發(fā)循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離與分析系統(tǒng)，其中唯一被美國(guó)食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)的產(chǎn)品是強(qiáng)生公司的CellSearch?系統(tǒng)被批準(zhǔn)用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌、結(jié)直腸癌與前列腺癌的預(yù)后評(píng)估、無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期的預(yù)測(cè)。我國(guó)國(guó)家食品藥品管理局在2012年8月批準(zhǔn)Ce 11 Search?系統(tǒng)用于乳腺癌的預(yù)后評(píng)估。Ce 11 Search?系統(tǒng)通過(guò)免疫磁珠從血液中捕獲CTC，并通過(guò)對(duì)細(xì)胞核以及細(xì)胞表面標(biāo)志物的多重染色進(jìn)行確認(rèn)并計(jì)數(shù)，然后根據(jù)7.5毫升外周血中檢測(cè)到的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的數(shù)目進(jìn)行預(yù)后評(píng)估。其他開(kāi)發(fā)循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離與分析系統(tǒng)的公司包括Rarecell (德國(guó))、ScreenCell (法國(guó))、Abnova (中國(guó)臺(tái)灣)、Clearbridge (新加坡)、Cytotrack (美國(guó))、Cynvenio Biosystems (美國(guó))、ApoCell (美國(guó))、FLUXION (美國(guó))、Epic Science (美國(guó))、Silicon Biosystems (意大利)、AndaGen (德國(guó))等。[0005]目前從人外周血中分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法主要可分為兩類，這兩類方法同時(shí)也代表了從復(fù)雜生物學(xué)樣品中分離稀有細(xì)胞的主要策略。一類方法是基于循環(huán)腫瘤細(xì)胞與血液中其他細(xì)胞物理性質(zhì)的差異，如密度、大小、軟硬程度等的不同實(shí)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞與其他細(xì)胞的分離；另一類方法主要基于循環(huán)腫瘤細(xì)胞與血液中其他細(xì)胞表面標(biāo)志物的差異，基于循環(huán)腫瘤細(xì)胞表面的特異性抗原，通過(guò)固定在基底表面或磁性顆粒上的針對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞表面特異性抗原的抗體或核算適配體實(shí)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特異性捕獲并與血液中其他細(xì)胞實(shí)現(xiàn)分離。CellSearch系統(tǒng)對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分離就是基于這種方法。
[0006]近年來(lái)通過(guò)將微流控技術(shù)與抗體捕獲相結(jié)合發(fā)展出了一系列的循環(huán)腫瘤細(xì)胞芯片捕獲技術(shù)，可以保持CTC的活性，為了提高其微通道的捕獲效率，目前的研究重點(diǎn)均集中在微通道表面的形狀上，如微柱陣列芯片(Nagrath S，Sequist LV, Maheswaran S，et a1.Nature2007, 450, 1235-1239;Maheswaran S,Sequist LV, Nagrath S, et al.N.Engl.J.Med.2008，359，366-377)、表面具有周期性凹凸結(jié)構(gòu)“魚骨型”芯片(Stott SL, HsuC-H, Tsukrov DI, et al.Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.2010，107，18392-18397)等。
[0007]但是，以上技術(shù)和系統(tǒng)目前仍存在以下缺陷:
[0008]I)捕獲到循環(huán)腫瘤細(xì)胞的純度較低，存在大量白細(xì)胞的非特異性吸附，需要通過(guò)特異性染色鑒別循環(huán)腫瘤細(xì)胞，耗時(shí)且容易出現(xiàn)假陽(yáng)性；
[0009]2)捕獲到的循環(huán)腫瘤細(xì)胞往往被固定在芯片表面，無(wú)法釋放進(jìn)行后續(xù)的檢測(cè)。實(shí)用新型內(nèi)容
[0010]目前，我們研發(fā)出了一種能夠解決以上問(wèn)題的分離方法:主要是對(duì)捕獲抗體進(jìn)行修飾，具體是標(biāo)記上標(biāo)記多核苷酸形成抗體-單鏈標(biāo)記多核苷酸復(fù)合物，微流控芯片內(nèi)負(fù)載有與標(biāo)記多核苷酸互補(bǔ)的單鏈固定多核苷酸。抗體與循環(huán)腫瘤細(xì)胞表面的特異性抗原結(jié)合，標(biāo)記多核苷酸與固定多核苷酸特異性結(jié)合形成穩(wěn)定的雙鏈核苷酸結(jié)構(gòu)，從而從樣品中捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞并固定到微流控芯片的微通道表面。所述標(biāo)記多核苷酸或固定多核苷酸中包含光敏基團(tuán)，在一定波長(zhǎng)的紫外光照射下即可斷裂，因此在原有分離方法的基礎(chǔ)上，通過(guò)紫外光照射切斷雙鏈核苷酸來(lái)釋放被固定在微通道表面的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，并進(jìn)行收集。增加的釋放模塊使循環(huán)腫瘤細(xì)胞的后續(xù)檢測(cè)成為可能，另外通過(guò)捕獲釋放兩個(gè)過(guò)程分別將不吸附的物質(zhì)和非特異性吸附的白細(xì)胞與循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離，大大提高了其純度。該方法目前還沒(méi)有相適應(yīng)的系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0011]基于以上研究成果，本實(shí)用新型提供了一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離系統(tǒng)，能夠從血液樣品中高效捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞，并解決分離系統(tǒng)存在嚴(yán)重的非特異性吸附、無(wú)法收集捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)的問(wèn)題。
[0012]本實(shí)用新型的技術(shù)方案是:所述循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離系統(tǒng)，包括進(jìn)樣模塊、第一微流控芯片、釋放模塊和收集模塊，所述進(jìn)樣模塊用于將檢測(cè)樣品注入第一微流控芯片，所述第一微流控芯片用于提取檢測(cè)樣品中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，所述釋放模塊用于使循環(huán)腫瘤細(xì)胞脫離第一微流控芯片獲得采集樣品，所述收集模塊用于收集采集樣品。
[0013]優(yōu)選地是，還包括第二微流控芯片，所述第二微流控芯片用于提取采集樣品中的殘余白細(xì)胞，并將剔除白細(xì)胞后的樣品導(dǎo)入收集模塊。進(jìn)一步提高采集樣品中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的純度。[0014]優(yōu)選地是，所述進(jìn)樣模塊為樣品注射器件，所述釋放模塊為發(fā)射紫外光光源，所述樣品注射器件出口與第一微流控芯片的進(jìn)樣口相接，所述發(fā)射紫外光光源設(shè)置在第一微流控芯片的微通道上。
[0015]樣品注射器件可以為注射器、自動(dòng)化注射器和恒流泵的一種或者一種以上的組
口 ο
[0016]本領(lǐng)域技術(shù)人員都清楚微流控芯片一般包括進(jìn)樣口、微通道、洗脫液貯液池、廢液收集器和各部分之間的閥門，還可以根據(jù)需要設(shè)置更多檢測(cè)需要的原料貯液池等。
[0017]優(yōu)選地是，所述第一微流控芯片和第二微流控芯片的微通道表面上設(shè)置微結(jié)構(gòu)，所述微結(jié)構(gòu)為周期性的微柱陣列結(jié)構(gòu)、周期性表面凹凸的魚骨型結(jié)構(gòu)、沉積的納米線或沉積的納米帶。
[0018]優(yōu)選地是，所述第一微流控芯片的微通道表面上負(fù)載有固定多核苷酸。
[0019]優(yōu)選地是，所述第二微流控芯片的微通道表面負(fù)載有針對(duì)白細(xì)胞表面特異性抗原的抗體。
[0020]優(yōu)選地是，所述第一微流控芯片與第二微流控芯片的入口通過(guò)微管連接，所述第二微流控芯片與收集模塊相連。從第一微流控芯片中流出攜帶釋放的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的采集樣品通過(guò)微管進(jìn)入第二微流控芯片內(nèi)，在第二微流控芯片中將其中殘留的白細(xì)胞捕獲。
[0021 ] 優(yōu)選地是，所述微管上設(shè)置閥門。
[0022]優(yōu)選地是，還包括控制模塊，所述控制模塊用于控制進(jìn)樣模塊、第一微流控芯片、第二微流控芯片、釋放模塊以及收集模塊的工作。
[0023]優(yōu)選地是，所述控制模塊為計(jì)算機(jī)或單片機(jī)。
[0024]本實(shí)用新型提供的技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn):
[0025]I)系統(tǒng)簡(jiǎn)單，易于實(shí)現(xiàn)。在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上增加釋放模塊即可克服嚴(yán)重的非特異性吸附問(wèn)題，增加的第二微流控芯片更可以進(jìn)一步提高收集的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的純度；
[0026]2)成本更低。商業(yè)化系統(tǒng)，如CellSearch的細(xì)胞捕獲系統(tǒng)，系統(tǒng)復(fù)雜，成本高昂，與之相比本實(shí)用新型提供的技術(shù)方案成本低廉，更易于市場(chǎng)推廣；
[0027]3)操作簡(jiǎn)單，自動(dòng)化控制。本系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)完全自動(dòng)化控制，整個(gè)操作較為簡(jiǎn)便?！緦＠綀D】

【附圖說(shuō)明】
[0028]圖1是本實(shí)用新型所述循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離系統(tǒng)一【具體實(shí)施方式】的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0029]圖2是本實(shí)用新型所述第一微流控芯片、第二微流控芯片和微管的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0030]圖中所示:
[0031]1-注射器,2-微管,21-第一單向閥,3-第一微流控芯片,31-第一微通道,32-進(jìn)樣口，33-第一廢液收集器，34-第一出液口，35-第一閥門，4-第二微流控芯片，41-第二微通道，42-第二廢液收集器，43-第二閥門，44-進(jìn)液口，45-第二出液口，5-紫外燈，6-循環(huán)腫瘤細(xì)胞收集器，61-第二單向閥，7-計(jì)算機(jī)。
【具體實(shí)施方式】
[0032]下面結(jié)合附圖對(duì)本實(shí)用新型作詳細(xì)描述:
[0033]如圖1所示，本實(shí)用新型所述循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離系統(tǒng)包括進(jìn)樣模塊、第一微流控芯片3、第二微流控芯片4、釋放模塊、收集模塊和控制模塊。
[0034]所述進(jìn)樣模塊包括注射器I。
[0035]如圖1和2所示，所述第一微流控芯片3包括第一微通道31、設(shè)置在第一微通道31 一端的進(jìn)樣口 32、設(shè)置在第一微通道31另一端的第一出液口 34、與第一出液口 34相連的第一廢液收集器33,第一廢液收集器33與第一微通道31之間的第一閥門35。
[0036]所述第一微通道31的表面設(shè)有微結(jié)構(gòu)，所述微結(jié)構(gòu)為周期性表面凹凸的魚骨型結(jié)構(gòu)(制作方法 JAL Wang, S.T.; Liu, K.; Liu, J.A.et al,.Angew.Chem.1nt.Ed.2011,50, 3084-3088 )，其中“魚骨”寬度為35 μ m，水平夾角為45度，周期性間隔為100 μ m, 一組共20條“魚骨”。
[0037]如圖1和2所示，所述第二微流控芯片4包括第二微通道41、設(shè)置在第二微通道41 一端的進(jìn)液口 44、設(shè)置在第二微通道41另一端的第二出液口 45、與第二出液口 45相連的第二廢液收集器42以及第二微通道41與第二廢液收集器42之間的第二閥門43。
[0038]所述第二微通道41的結(jié)構(gòu)與第一微通道31相同。
[0039]如圖2所示，所述第一微流控芯片3與第二微流控芯片4之間設(shè)置微管2，所述微管2 —端與第一微流控芯片3的第一出液口 34相連，另一端與第二微流控芯片4的進(jìn)液口44相連，所述微管2上設(shè)置第一單向閥21。
[0040]所述釋放模塊為紫外燈5 (購(gòu)自美國(guó)Cole-Parmer公司，功率為40W，功率密度為
1.19mW/cm2)，所述紫外燈5設(shè)置在第一微通道31上方。
[0041]所述收集模塊為循環(huán)`腫瘤細(xì)胞收集器6，所述循環(huán)腫瘤細(xì)胞收集器6與第二微通道41相通，所述第二微通道41與循環(huán)腫瘤細(xì)胞收集器6之間設(shè)置第二單向閥61。
[0042]所述控制模塊為計(jì)算機(jī)7，所述計(jì)算機(jī)7分別與注射器1、紫外照明燈5、第一單向閥21、第二單向閥61、第一閥門35和第二閥門43相連。
[0043]下面結(jié)合一個(gè)具體事例說(shuō)明循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離系統(tǒng)的工作過(guò)程:
[0044]表1
[0045]
【權(quán)利要求】
1.一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離系統(tǒng)，其特征在于，包括進(jìn)樣模塊、第一微流控芯片、釋放模塊和收集模塊，所述進(jìn)樣模塊用于將檢測(cè)樣品注入第一微流控芯片，所述第一微流控芯片用于提取檢測(cè)樣品中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，所述釋放模塊用于使循環(huán)腫瘤細(xì)胞脫離第一微流控芯片獲得采集樣品，所述收集模塊用于收集采集樣品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離系統(tǒng)，其特征在于，還包括第二微流控芯片，所述第二微流控芯片用于提取采集樣品中的殘余白細(xì)胞，并將剔除白細(xì)胞后的樣品導(dǎo)入收集模塊。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離系統(tǒng)，其特征在于，所述第一微流控芯片和第二微流控芯片的微通道表面上設(shè)置微結(jié)構(gòu)，所述微結(jié)構(gòu)為周期性的微柱陣列結(jié)構(gòu)、周期性表面凹凸的魚骨型結(jié)構(gòu)、沉積的納米線或沉積的納米帶。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離系統(tǒng)，其特征在于，所述第一微流控芯片與第二微流控芯片的入口通過(guò)微管連接，所述第二微流控芯片與收集模塊相連。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離系統(tǒng)，其特征在于，所述微管上設(shè)置閥門。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離系統(tǒng)，其特征在于，還包括控制模塊，所述控制模塊用于控制進(jìn)樣模塊、第一微流控芯片、第二微流控芯片、釋放模塊以及收集模塊的工作。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離系統(tǒng)，其特征在于，所述控制模塊為計(jì)算機(jī)或單片機(jī)。
8.根據(jù)權(quán)利要求2-7任一所述一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離系統(tǒng)，其特征在于，所述第二微流控芯片的微通道表面負(fù)載有針對(duì)白細(xì)胞表面特異性抗原的抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一所述一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離系統(tǒng)，其特征在于，所述第一微流控芯片的微通道表面上負(fù)載有單鏈固定多核苷酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一所述一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離系統(tǒng)，其特征在于，所述進(jìn)樣模塊為樣品注射器件，所述釋放模塊為發(fā)射紫外光光源，所述樣品注射器件出口與第一微流控芯片的進(jìn)樣口相接，所述發(fā)射紫外光光源設(shè)置在第一微流控芯片的微通道上。
【文檔編號(hào)】C12M1/00GK203625357SQ201320725254
【公開(kāi)日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2013年11月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月15日
【發(fā)明者】李小衛(wèi) 申請(qǐng)人:上?？滴⒔】悼萍加邢薰?br>