本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢測分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種結(jié)直腸癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集和分析方法。

背景技術(shù)：

惡性腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致腫瘤患者死亡的重要原因，越來越多的分子生物學(xué)和臨床研究結(jié)果表明，腫瘤轉(zhuǎn)移很可能在腫瘤發(fā)生的早期就已經(jīng)出現(xiàn)。目前腫瘤的發(fā)現(xiàn)和診斷臨床上仍依賴于影像學(xué)檢查及傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志的監(jiān)測，難以早期發(fā)現(xiàn)腫瘤的轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)，也難以及時(shí)反映療效。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell，CTC)是脫落進(jìn)入血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，大量實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)CTCs檢測有助于腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移監(jiān)控、判斷患者預(yù)后、指導(dǎo)術(shù)后輔助治療等。

外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)數(shù)量稀少，且具有異質(zhì)性和易聚集成團(tuán)等特點(diǎn)。目前眾多的檢測技術(shù)在靈敏性、特異性和可重復(fù)性等方面還存在諸多問題。

免疫磁性分離技術(shù)(immunomagnetic separation，IMS)是近年來國內(nèi)外研究的一種新的免疫學(xué)技術(shù)，它能夠從大量外周血中篩選出帶有特異性標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞，其基本原理主要是基于細(xì)胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結(jié)合，形成細(xì)胞-抗原-抗體-磁珠免疫復(fù)合物，該復(fù)合物在外加磁場的作用下發(fā)生力學(xué)移動，將含有靶抗原的目的細(xì)胞與其他細(xì)胞分離，從而達(dá)到特異性分離細(xì)胞的目的。具體分為陽性富集方法和陰性富集方法。前者通過磁珠偶聯(lián)上皮細(xì)胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)等標(biāo)志物直接富集外周血中上皮來源的稀有細(xì)胞。后者通過磁珠偶聯(lián)CD45等白細(xì)胞標(biāo)志，去除外周血白細(xì)胞而間接富集稀有上皮細(xì)胞。

目前基于免疫磁性原理富集或同時(shí)檢測CTCs的技術(shù)主要有CellSearch系統(tǒng)、免疫磁性細(xì)胞分選儀(magnetric cell sorting，MACS)、AdnaTest癌細(xì)胞檢測系統(tǒng)和萊爾系統(tǒng)等。其中CellSearch檢測系統(tǒng)已經(jīng)被美國FDA批準(zhǔn)用于檢測 乳腺癌、結(jié)直腸癌和前列腺癌患者外周血的CTCs。該系統(tǒng)利用EpCAM抗體結(jié)合表達(dá)EpCAM的腫瘤細(xì)胞，然后用免疫磁珠來覆蓋抗EpCAM抗體，最后在磁場的作用下對CTCs進(jìn)行分離。將分離得到的細(xì)胞經(jīng)固定后用4，6-二脒基-2-苯基吲哚(2-(4-amidinophenyl)-6-indole carbamidine dihydrochloride，DAPI)熒光染料標(biāo)記細(xì)胞核，CD45熒光抗體和CK8、CK18、CK19或CKmix熒光抗體標(biāo)記細(xì)胞，結(jié)果分析在四色熒光顯微鏡下進(jìn)行。將DAPI+、CD45-、CK+和EpCAM+的細(xì)胞定義為CTCs。CellSearch系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)能夠較好保存，即通過熒光顯微鏡看到熒光染色的結(jié)果，直接觀察到腫瘤細(xì)胞的形態(tài)。

但CellSearch系統(tǒng)自身也有無法解決的缺陷：1.檢測的靈敏度不夠高。部分癌癥轉(zhuǎn)移期患者，由于其血液中CTC含量過低，或者其CTC本身發(fā)生變化而不能被CellSearch系統(tǒng)所捕獲，因此該檢測存在假陰性率較高的問題。2.無法對CTC深入分析。CellSearch系統(tǒng)只能對捕獲并標(biāo)志CTC的數(shù)量，而不能對CTC進(jìn)行包括基因測序、蛋白表達(dá)、藥物敏感性檢測等更細(xì)致的分析。另外儀器及耗材的成本昂貴也限制了其進(jìn)一步大規(guī)模應(yīng)用于臨床。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明提供了一種結(jié)直腸癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集和分析方法，通過免疫磁珠負(fù)向和正向的富集與qRT-PCR檢測腫瘤標(biāo)記基因表達(dá)相結(jié)合，建立一種高敏感性和特異性、且成本低廉的檢測結(jié)癌癥患者血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：

一種結(jié)直腸癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集和分析方法，其特征在于，所述富集和分析方法，是采集人體血液樣本，并分離血液樣本中的單個(gè)核細(xì)胞，將單個(gè)核細(xì)胞通過CD45磁珠負(fù)向富集、EpCAM磁珠正向富集兩種方式先后兩次富集后得到細(xì)胞懸浮液，裂解細(xì)胞后提取mRNA，通過RT-qPCR檢測方法來檢測結(jié)直腸癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的CK20和Survivin基因的表達(dá)水平，將兩個(gè)基因的表達(dá)水平與已有的正常人和結(jié)直腸癌患者的CK20和Survivin基因的表達(dá)水平數(shù)據(jù)庫對比后，分析得出結(jié)直腸癌患者中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的有無以及腫瘤特異基因的表達(dá)豐度情況。

優(yōu)選的，單個(gè)核細(xì)胞的收集是通過白細(xì)胞分離液或CPT管，去除血液中的紅細(xì)胞、血小板，收集包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的單個(gè)核細(xì)胞；

CD45磁珠負(fù)向富集，是利用偶聯(lián)CD45抗體的磁珠與血液中的白細(xì)胞結(jié)合，去除非循環(huán)腫瘤細(xì)胞，提高后續(xù)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分選特異性；

EpCAM磁珠正向富集：是利用偶聯(lián)EpCAM抗體的磁珠與CD45磁珠負(fù)向負(fù)向篩選后剩余的細(xì)胞進(jìn)一步特異性結(jié)合，收集得到循環(huán)腫瘤細(xì)胞。

本發(fā)明一種結(jié)直腸癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集和分析方法，包括以下具體步驟：

A、單個(gè)核細(xì)胞收集：采集人體血液樣本，并分離血液樣本中的單個(gè)核細(xì)胞；

B、CD45磁珠負(fù)向富集：在離心管中加入步驟A得到的單個(gè)核細(xì)胞和CD45磁珠，2-8℃條件下，旋轉(zhuǎn)混勻，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中；CD45磁珠為偶聯(lián)有CD45抗體的磁珠，CD45抗體能夠特異性吸附血液中的白細(xì)胞，去除大部分非腫瘤細(xì)胞；

C、EpCAM磁珠正向富集：在離心管中加入步驟B得到的上清液和EpCAM磁珠，2-8℃條件下，旋轉(zhuǎn)后靜置，并將上清液移除，得到磁珠懸浮液；EpCAM磁珠為偶聯(lián)有EpCAM抗體的磁珠；因?yàn)槟[瘤細(xì)胞表面上皮粘附因子(EpCAM抗原)表達(dá)高于普通血液細(xì)胞，所以通過偶聯(lián)EpCAM抗體的磁珠，能夠特異性吸附腫瘤細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)檢測；

D、mRNA提取：將步驟C得到的磁珠懸浮液漂洗后，加入裂解液將磁珠吸附的細(xì)胞裂解，釋放核酸；取上清液加入Oligo dT磁珠與mRNA結(jié)合，將包含裂解細(xì)胞的樣本管放置在磁體上，分離得到mRNA；

E、RT-qPCR檢測：將步驟D得到的mRNA進(jìn)行RT-qPCR檢測，其中PCR擴(kuò)增體系中使用的引物序列包括survivin上游引物、survivin下游引物、CK20上游引物、CK20下游引物、beta-actin上游引物和beta-actin下游引物；所述survivin上游引物的序列如SEQ ID NO：1所示，survivin下游引物的序列如SEQ ID NO：2所示，CK20上游引物的序列如SEQ ID NO：3所示，CK20下游引物的序列如SEQ ID NO：4所示，beta-actin上游引物的序列如SEQ ID NO：5所示，beta-actin下游引物的序列如SEQ ID NO：6所示。

經(jīng)過兩次磁珠分離，顯著提高CTC的捕獲效率，提高患者的CTC檢出率。

本發(fā)明的發(fā)明人，通過對比正常人和結(jié)直腸癌患者的血液樣本中基因表達(dá)的差異，篩選出一系列與結(jié)直腸癌相關(guān)的Marker基因，最終確定CTC中CK20和Survivin的表達(dá)水平與患者的預(yù)后和總生存期密切相關(guān)，

如圖1-4所示，本申請的發(fā)明人選擇20個(gè)正常人和88例結(jié)直腸癌患者的血液為樣本進(jìn)行了CTCs的富集以及CK20、Survivin基因表達(dá)水平檢測，建立了判斷結(jié)直腸癌的CK20、Survivin基因表達(dá)的基線。其中CK20的表達(dá)基線敏感性和特異性達(dá)到76％和85％；Survivin的表達(dá)基線敏感性和特異性達(dá)到72％和100％。以CK20和Survivin的表達(dá)水平基線對88例結(jié)直腸癌患者進(jìn)行判斷，真陽性率達(dá)到70％以上。

進(jìn)一步地，如圖5和圖6所示，本申請的發(fā)明人對88例結(jié)直腸癌患者進(jìn)行追蹤研究，結(jié)果表明CK20和Survivin表達(dá)高于基線的患者，生存期是顯著低于基因表達(dá)水平低于基線的患者。這也驗(yàn)證了通過檢測患者CTCs中CK20和Survivin表達(dá)水平預(yù)測患者生存期的方法的可行性與準(zhǔn)確性。

優(yōu)選地，步驟A中，用EDTA抗凝管采集人體血液樣本，加入磷酸緩沖液混合均勻；將稀釋后的血液加到淋巴細(xì)胞分離液的上方；離心后，吸出白色層，重懸于磷酸緩沖液中，混勻；離心后移除上清液，并加入磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞，即得到單個(gè)核細(xì)胞。

進(jìn)一步地，步驟A中，用EDTA抗凝管采集人體血液樣本，加入磷酸緩沖液1∶1混合均勻；將稀釋后的血液加到淋巴細(xì)胞分離液的上方，淋巴細(xì)胞分離液與稀釋后血液的體積比為1∶1；室溫2600rpm離心20分鐘后，吸出白色層，重懸于5倍體積的磷酸緩沖液中，混勻；室溫1500rpm離心5分鐘，移除上清液，并加入磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞，即得到單個(gè)核細(xì)胞。.

步驟B包括準(zhǔn)備CD45磁珠和負(fù)向富集兩個(gè)步驟：

B1、準(zhǔn)備磁珠：將CD45磁珠使用緩沖液洗滌、重懸后備用；此步驟的作用為清洗磁珠；

B2、負(fù)向富集：在離心管中加入步驟B1得到的磁珠和步驟A得到的單個(gè)核細(xì)胞，2-8℃條件下，旋轉(zhuǎn)結(jié)合30-40min后；將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。

步驟C包括準(zhǔn)備準(zhǔn)備EpCAM磁珠和正向富集兩個(gè)步驟：

C1、準(zhǔn)備磁珠：將EpCAM磁珠使用緩沖液洗滌、重懸后備用；此步驟的作用為清洗磁珠；

C2、正向富集：在離心管中加入步驟B得到的上清液和步驟C1上皮富集磁珠，2-8℃條件下，旋轉(zhuǎn)結(jié)合20-40min；再將離心管放置磁體上3min，將上清液移除，得到磁珠懸浮液。

為了收集離心管蓋子上遺留的上皮富集磁珠，以增加所述富集和分析方法結(jié)果的準(zhǔn)確性，優(yōu)選的技術(shù)方案是，步驟C2中，將離心管放置磁體上3min，將上清液移除后，從磁體上取下離心管，加入緩沖液將磁珠重懸，并清洗3次，得到磁珠懸浮液。

步驟D包括準(zhǔn)備Oligo(dT)25磁珠、循環(huán)腫瘤細(xì)胞裂解和mRNA分離三個(gè)步驟：

D1、準(zhǔn)備Oligo(dT)磁珠液：渦旋大于30s或傾斜旋轉(zhuǎn)5min在離心管中重懸Oligo(dT)25磁珠，并加入等體積的Lysis/Binding Buffer，得到Oligo(dT)磁珠液；

D2、循環(huán)腫瘤細(xì)胞裂解：將步驟C得到的磁珠懸浮液漂洗后，使用Oligo(dT)磁珠液重懸所述磁珠懸浮液，使循環(huán)腫瘤細(xì)胞裂解；

D3、mRNA分離：將步驟D2得到的包含裂解細(xì)胞的樣本管放置在磁體上3min，使mRNA充分與磁珠結(jié)合，然后移除上清液，然后用在冰上預(yù)冷的10mM Tris-HCl重懸，重懸完成后，在65-80℃孵育2min，即可分離得到mRNA。

步驟E中，所述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序?yàn)椋?7℃保持60min；然后再93℃保持5min，再置于4℃下保存。

步驟E中，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為：總體積為20μL，10×Buffer RT 2.0μL，dNTPs 2.0μL，Oligo dT primer 2.0μL，Sensicript Reverse Transcriptase 1.0μL，40U/μL的RNase Inhibitor 0.25μL，mRNA-Tris-HCl重懸液12μL，余量為水。

步驟F中，使用的PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋涸?5℃溫度下預(yù)變性2min；然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)依次包括以下步驟：在95℃溫度下保存5s，在60℃溫度下保存30s；完成40個(gè)循環(huán)之后，即完成PCR擴(kuò)增程序。

步驟F中，PCR反應(yīng)體系為：總體積為20μL，2x QuantiNova SYBR Green PCR Master Mix 2.0μL，Rox 0.1μL，10μM的Forward Primer 1.4μL，10μM的Reverse Primer 1.4μL，cDNA 1.0μL，RNase-Free water 6.1μL，余量為水。

本發(fā)明的有益效果為：

1、本發(fā)明提供了一種結(jié)直腸癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集和分析方法，通過免疫磁珠負(fù)向和正向的富集與qRT-PCR檢測腫瘤標(biāo)記基因表達(dá)相結(jié)合，建立一種高敏感性和特異性、且成本低廉的檢測結(jié)癌癥患者血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法。經(jīng)過兩次磁珠分離，顯著提高CTC的捕獲效率，提高患者的CTC檢出率；其次，確定了CK20和Survivin基因的表達(dá)水平在評估腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)、指導(dǎo)個(gè)體化治療、快速判斷化療效果方面具有突出的臨床效用。

2、通過所述結(jié)直腸癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集和分析方法可以有效的分離和鑒定結(jié)直腸癌患者外周血中的CTCs，其陽性檢出率達(dá)到70％以上，并且具備成本較低，無需購置大型儀器，檢測精確，后續(xù)擴(kuò)展性強(qiáng)等特點(diǎn)。

3、利用所述結(jié)直腸癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集和分析方法也能夠?qū)ρ簶颖具M(jìn)行CD45陰性和EpCAM陽性免疫富集CTCs，除了能夠分離結(jié)直腸癌的CTCs，還能夠分離前列腺癌、乳腺癌、胃癌等表達(dá)上皮細(xì)胞黏附因子的CTCs。

附圖說明

圖1是CK20基因的ROC曲線圖；

圖2是Survivin基因的ROC曲線圖；

圖3是CK20基因在健康人和結(jié)腸癌患者CTC中的表達(dá)曲線圖；

圖4是Survivin基因在健康人和結(jié)腸癌患者CTC中的表達(dá)曲線圖；

圖5是CK20基因預(yù)估存活率和CTC檢測后時(shí)間的關(guān)聯(lián)圖；

圖6是Survivin基因預(yù)估存活率和CTC檢測后時(shí)間的關(guān)聯(lián)圖

圖7是本發(fā)明的簡易流程圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例，更具體地說明本發(fā)明的內(nèi)容。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的實(shí)施并不局限于下面的實(shí)施例，對本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發(fā)明保護(hù)范圍。

在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所有的設(shè)備和原料等均可從市場購得或是本行業(yè)常用的。下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。

實(shí)施例1

一種結(jié)直腸癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集和分析方法，包括以下步驟：

A、外周血單個(gè)核細(xì)胞收集

1.使用EDTA抗凝管采集病人血液樣本約10mL。

2.使用移液槍，量取8mL血液樣本到做有相同標(biāo)記的的BD Vacutainer CPT管中。

3. 1700g室溫離心25min。

4.離心之后，位于血漿層下的白色層為單核細(xì)胞和血小板，小心吸出約一半血漿，將剩余血漿與細(xì)胞層(約2mL)轉(zhuǎn)移到無菌的15mL離心管中。

5.在上述離心管中加入RPMI 1640培養(yǎng)基，使總體積為10mL。擰緊離心管蓋子，上下顛倒離心管5次使細(xì)胞混勻。

6. 300g離心15min，移除上清。

7.在上述離心管中加入1mL PBS，重懸細(xì)胞，置于冰上。

B、磁珠負(fù)向富集

1.準(zhǔn)備磁珠：

(1)渦旋大于30s或傾斜旋轉(zhuǎn)5min在小瓶中重懸磁珠，取適當(dāng)體積的磁珠(250μL/樣本)到新的離心管中；

(2)加入相同體積的Buffer1，重懸磁珠；

(3)離心管放置磁體1min，吸除上清；

(4)將離心管移出磁體，用與(2)相同體積的Buffer1重懸磁珠，備用。

2.準(zhǔn)備離心管：

取50mL離心管，加入10mL Buffer 2，預(yù)包被處理5min；

3.陰性分離

(1)在預(yù)包被的管中加入250μL漂洗并重懸的磁珠；

(2)在上述管中加入1mL(第一部分步驟7，PBS重懸的細(xì)胞)，輕柔 旋轉(zhuǎn)混勻8℃孵育30min；

(3)從混合器上移除離心管，使用Buffer1稀釋定容至50mL，輕柔混合；

(4)將上述離心管放置磁體5min；

(5)將上清轉(zhuǎn)移到新的預(yù)包被離心管中，供下游分析；

注意：操作需要在冰上進(jìn)行。

C、磁珠正向富集

試劑盒：Dynabeads Epithelial Enrich，公司：Invitrogen，貨號：161.02

1.準(zhǔn)備上皮富集磁珠(EpCAM)：

(1)渦旋大于30s或傾斜旋轉(zhuǎn)5min在小瓶中重懸磁珠，取適當(dāng)體積的磁珠(25μL)到新的離心管中；

(2)加入相同體積的Buffer1，重懸磁珠；

(3)離心管放置磁體1min，吸除上清；

(4)將離心管移出磁體，用與(2)相同體積的Buffer1重懸磁珠，備用。

2.陽性分離

(1)在上述10mL細(xì)胞樣本中加入約25μL被洗過的上皮富集磁珠，在混合器上8℃旋轉(zhuǎn)20min；

(2)8℃條件下，將上述離心管放置磁體上5min，為了收集離心管蓋子上遺留的磁珠，1min后輕輕地將磁體和離心管顛倒；

(3)用移液槍小心地將上清移除；

(4)在管中加入800μL預(yù)冷的Buffer1，將管從磁體上取下，小心重懸磁體細(xì)胞，將懸浮液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的管中；

(5)將上述離心管放置磁體上3min，用移液槍小心地將上清移除；

(6)重復(fù)(4)和(5)四次；即一共清洗5次；

(7)將磁珠懸浮液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新管中，放在冰上，并立即進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

D、從循環(huán)腫瘤細(xì)胞中分離mRNA

試劑盒：Dynabeads mRNA DIRECT Micro Kit，公司：Invitrogen，貨號：61021

1.準(zhǔn)備Oligo(dT)25磁珠

(1)渦旋大于30s或旋轉(zhuǎn)混合5min，重懸混勻Dynabeads Oligo(dT)25；

(2)轉(zhuǎn)移適當(dāng)體積的Dynabeads Oligo(dT)25(以25μL/RNA分離樣本計(jì))到新的RNase-free管中；

(3)加入等體積Lysis/Binding Buffer(以25μL/RNA分離樣本計(jì))；

(4)將該管放置在磁體上1min，移除上清；

(5)從磁體上取下管，用與步驟(2)相同體積的Lysis/Binding buffer(以25μL/RNA分離樣本計(jì))，每個(gè)樣本管分裝25μL懸浮液。

2.腫瘤細(xì)胞裂解

(1)經(jīng)過Dynabeads Epithelial Enrich試劑盒分離的腫瘤細(xì)胞，最后一次漂洗后，立即將磁珠-細(xì)胞混合樣放在冰上，等待mRNA分離和PCR：

(2)在mRNA分離前，將樣本管放置在磁體上3min，移除上清；

(3)使用100μL Lysis/Binding Buffer重懸磁珠-細(xì)胞混合體系；

(4)上下吹吸2次，注意不要起沫。

3.mRNA分離

(1)將包含裂解細(xì)胞的樣本管放置在磁體上3min；

(2)將上清轉(zhuǎn)移到包含有25μL預(yù)漂洗的Dynabeads Oligo(dT)25懸浮液(步驟第四部分-1-(5))；

(3)吹吸數(shù)次混合均勻，注意不要起沫；

(4)將樣本管固定在樣本混合器或旋轉(zhuǎn)儀上，室溫下混合至少5min，保證mRNA充分與磁珠結(jié)合；

(5)將樣本管放置在磁體上，移除上清。從磁體上取下樣本管，加入100μL washing buffer A用槍頭小心重懸磁珠-mRNA混合體系；

(6)將樣本管放置在磁體上，移除上清；

(7)重復(fù)步驟5-6；

(8)用100μL washing buffer B重懸磁珠-mRNA混合體系；

(9)將懸浮液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的管中；

(10)將上述新的樣本管放置在磁體上，移除上清；

(11)用100μL washing buffer B重懸磁珠-mRNA混合體系；

(12)將樣本管放置在磁體上，移除上清；

(13)從磁體上取下樣本管，用13.5μL在冰上預(yù)冷的10mM Tris-HCl重懸；

(14)65℃孵育樣本管2min，將管放置在磁體上立刻轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，該體系可直接用于反轉(zhuǎn)錄或在-80℃保存。

E、將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA

試劑盒：QuantiNova SYBR Green PCR Kit，公司：Qiagen，貨號：208054

所述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序?yàn)椋?7℃保持60min；然后再93℃保持5min，再置于4℃下保存。

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為：總體積為20μL，10×Buffer RT 2.0μL，dNTPs 2.0μL，Oligo dT primer 2.0μL，Sensicript Reverse Transcriptase 1.0μL，40U/μL的RNase Inhibitor 0.25μL，mRNA-Tris-HCl重懸液12μL，余量為水。

F、RT-qPCR檢測

PCR反應(yīng)體系為：總體積為20μL，2x QuantiNova SYBR Green PCR Master Mix 2.0μL，Rox 0.1μL，10μM的Forward Primer 1.4μL，10μM的Reverse Primer 1.4μL，cDNA 1.0μL，RNase-Free water 6.1μL，余量為水。

使用的PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋涸?5℃溫度下預(yù)變性2min；然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)依次包括以下步驟：在95℃溫度下保存5s，在60℃溫度下保存30s；完成40個(gè)循環(huán)之后，即完成PCR擴(kuò)增程序。

實(shí)施例2

一種結(jié)直腸癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集和分析方法，包括以下步驟：

A、外周血單個(gè)核細(xì)胞收集

1.使用EDTA抗凝管采集病人血液樣本約10mL。

2.使用移液槍，量取8mL血液樣本到做有相同標(biāo)記的的BD Vacutainer CPT管中。

3. 1700g室溫離心25min。

4.離心之后，位于血漿層下的白色層為單核細(xì)胞和血小板，小心吸出約一 半血漿，將剩余血漿與細(xì)胞層(約3mL)轉(zhuǎn)移到無菌的15mL離心管中。

5.在上述離心管中加入RPMI 1640培養(yǎng)基，使總體積為10mL。擰緊離心管蓋子，上下顛倒離心管5次使細(xì)胞混勻。

6. 300g離心15min，移除上清。

7.在上述離心管中加入1mL PBS，重懸細(xì)胞，置于冰上。

B、磁珠負(fù)向富集

1.準(zhǔn)備磁珠：

(1)渦旋大于30s或傾斜旋轉(zhuǎn)5min在小瓶中重懸磁珠，取適當(dāng)體積的磁珠(250μL/樣本)到新的離心管中；

(2)加入相同體積的Buffer1，重懸磁珠；

(3)離心管放置磁體1min，吸除上清；

(4)將離心管移出磁體，用與(2)相同體積的Buffer1重懸磁珠，備用。

2.準(zhǔn)備離心管：

取50mL離心管，加入10mL Buffer 2，預(yù)包被處理5min；

3.陰性分離

(1)在預(yù)包被的管中加入250μL漂洗并重懸的磁珠；

(2)在上述管中加入1mL(第一部分步驟7，PBS重懸的細(xì)胞)，輕柔旋轉(zhuǎn)混勻2℃孵育40min；

(3)從混合器上移除離心管，使用Buffer1稀釋定容至50mL，輕柔混合；

(4)將上述離心管放置磁體15min；

(5)將上清轉(zhuǎn)移到新的預(yù)包被離心管中，供下游分析；

注意：操作需要在冰上進(jìn)行。

C、磁珠正向富集

試劑盒：Dynabeads Epithelial Enrich，公司：Invitrogen，貨號：161.02

1.準(zhǔn)備上皮富集磁珠(EpCAM)：

(1)渦旋大于30s或傾斜旋轉(zhuǎn)5min在小瓶中重懸磁珠，取適當(dāng)體積的磁珠(25μL)到新的離心管中；

(2)加入相同體積的Buffer1，重懸磁珠；

(3)離心管放置磁體1min，吸除上清；

(4)將離心管移出磁體，用與(2)相同體積的Buffer1重懸磁珠，備用。

2.陽性分離

(1)在上述10mL細(xì)胞樣本中加入約25μL被洗過的上皮富集磁珠，在混合器上2℃旋轉(zhuǎn)40min；

(2)2℃條件下，將上述離心管放置磁體上1min，為了收集離心管蓋子上遺留的磁珠，1min后輕輕地將磁體和離心管顛倒；

(3)用移液槍小心地將上清移除；

(4)在管中加入800μL預(yù)冷的Buffer1，將管從磁體上取下，小心重懸磁體細(xì)胞，將懸浮液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的管中；

(5)將上述離心管放置磁體上3min，用移液槍小心地將上清移除；

(6)重復(fù)(4)和(5)四次；即一共清洗5次；

(7)將磁珠懸浮液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新管中，放在冰上，并立即進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

D、從循環(huán)腫瘤細(xì)胞中分離mRNA

試劑盒：Dynabeads mRNA DIRECT Micro Kit，公司：Invitrogen，貨號：61021

1.準(zhǔn)備Oligo(dT)25磁珠

(1)渦旋大于30s或旋轉(zhuǎn)混合5min，重懸混勻Dynabeads Oligo(dT)25；

(2)轉(zhuǎn)移適當(dāng)體積的Dynabeads Oligo(dT)25(以25μL/RNA分離樣本計(jì))到新的RNase-free管中；

(3)加入等體積Lysis/Binding Buffer(以25μL/RNA分離樣本計(jì))；

(4)將該管放置在磁體上1min，移除上清；

(5)從磁體上取下管，用與步驟(2)相同體積的Lysis/Binding buffer(以25μL/RNA分離樣本計(jì))，每個(gè)樣本管分裝25μL懸浮液。

2.腫瘤細(xì)胞裂解

(1)經(jīng)過Dynabeads Epithelial Enrich試劑盒分離的腫瘤細(xì)胞，最后一次漂洗后，立即將磁珠-細(xì)胞混合樣放在冰上，等待mRNA分離和PCR；

(2)在mRNA分離前，將樣本管放置在磁體上2min，移除上清；

(3)使用100μL Lysis/Binding Buffer重懸磁珠-細(xì)胞混合體系；

(4)上下吹吸3次，注意不要起沫。

3.mRNA分離

(1)將包含裂解細(xì)胞的樣本管放置在磁體上3min；

(2)將上清轉(zhuǎn)移到包含有25μL預(yù)漂洗的Dynabeads Oligo(dT)25懸浮液(步驟第四部分-1-(5))；

(3)吹吸數(shù)次混合均勻，注意不要起沫；

(4)將樣本管固定在樣本混合器或旋轉(zhuǎn)儀上，室溫下混合至少5min，保證mRNA充分與磁珠結(jié)合；

(5)將樣本管放置在磁體上，移除上清。從磁體上取下樣本管，加入100μL washing buffer A用槍頭小心重懸磁珠-mRNA混合體系；

(6)將樣本管放置在磁體上，移除上清；

(7)重復(fù)步驟5-6；

(8)用100μL washing buffer B重懸磁珠-mRNA混合體系；

(9)將懸浮液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的管中；

(10)將上述新的樣本管放置在磁體上，移除上清；

(11)用100μL washing buffer B重懸磁珠-mRNA混合體系；

(12)將樣本管放置在磁體上，移除上清；

(13)從磁體上取下樣本管，用13.5μL在冰上預(yù)冷的10mM Tris-HCl重懸；

(14)80℃孵育樣本管2min，將管放置在磁體上立刻轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，該體系可直接用于反轉(zhuǎn)錄或在-80℃保存。

E、將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA

試劑盒：QuantiNova SYBR Green PCR Kit，公司：Qiagen，貨號：208054

所述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序?yàn)椋?7℃保持60min；然后再93℃保持5min，再置于4℃下保存。

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為：總體積為20μL，10×Buffer RT 2.0μL，dNTPs 2.0μL，Oligo dT primer 2.0μL，Sensicript Reverse Transcriptase 1.0μL，40U/μL的RNase Inhibitor 0.25μL，mRNA-Tris-HCl重懸液12μL，余量為水。

F、RT-qPCR檢測

PCR反應(yīng)體系為：總體積為20μL，2x QuantiNova SYBR Green PCR Master Mix 2.0μL，Rox 0.1μL，10μM的Forward Primer 1.4μL，10μM的Reverse Primer 1.4μL，cDNA 1.0μL，RNase-Free water 6.1μL，余量為水。

使用的PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋涸?5℃溫度下預(yù)變性2min；然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)依次包括以下步驟：在95℃溫度下保存5s，在60℃溫度下保存30s；完成40個(gè)循環(huán)之后，即完成PCR擴(kuò)增程序。

實(shí)施例3

一種結(jié)直腸癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集和分析方法，包括以下步驟：

A、外周血單個(gè)核細(xì)胞收集

1.使用EDTA抗凝管采集病人血液樣本約10mL。

2.使用移液槍，量取8mL血液樣本到做有相同標(biāo)記的的BD Vacutainer CPT管中。

3. 1700g室溫離心25min。

4.離心之后，位于血漿層下的白色層為單核細(xì)胞和血小板，小心吸出約一半血漿，將剩余血漿與細(xì)胞層(約2mL)轉(zhuǎn)移到無菌的15mL離心管中。

5.在上述離心管中加入RPMI 1640培養(yǎng)基，使總體積為10mL。擰緊離心管蓋子，上下顛倒離心管5次使細(xì)胞混勻。

6. 300g離心15min，移除上清。

7.在上述離心管中加入1mL PBS，重懸細(xì)胞，置于冰上。

B、磁珠負(fù)向富集

1.準(zhǔn)備磁珠：

(1)渦旋大于30s或傾斜旋轉(zhuǎn)5min在小瓶中重懸磁珠，取適當(dāng)體積的磁珠(250μL/樣本)到新的離心管中；

(2)加入相同體積的Buffer1，重懸磁珠；

(3)離心管放置磁體1min，吸除上清；

(4)將離心管移出磁體，用與(2)相同體積的Buffer1重懸磁珠，備用。

2.準(zhǔn)備離心管：

取50mL離心管，加入10mL Buffer 2，預(yù)包被處理5min；

3.陰性分離

(1)在預(yù)包被的管中加入250μL漂洗并重懸的磁珠；

(2)在上述管中加入1mL(第一部分步驟7，PBS重懸的細(xì)胞)，輕柔旋轉(zhuǎn)混勻5℃孵育40min；

(3)從混合器上移除離心管，使用Buffer1稀釋定容至50mL，輕柔混合；

(4)將上述離心管放置磁體10min；

(5)將上清轉(zhuǎn)移到新的預(yù)包被離心管中，供下游分析；

注意：操作需要在冰上進(jìn)行。

C、磁珠正向富集

試劑盒：Dynabeads Epithelial Enrich，公司：Invitrogen，貨號：161.02

1.準(zhǔn)備上皮富集磁珠(EpCAM)：

(1)渦旋大于30s或傾斜旋轉(zhuǎn)5min在小瓶中重懸磁珠，取適當(dāng)體積的磁珠(25μL)到新的離心管中；

(2)加入相同體積的Buffer1，重懸磁珠；

(3)離心管放置磁體1min，吸除上清；

(4)將離心管移出磁體，用與(2)相同體積的Buffer1重懸磁珠，備用。

2.陽性分離

(1)在上述10mL細(xì)胞樣本中加入約25μL被洗過的上皮富集磁珠，在混合器上5℃旋轉(zhuǎn)30min；

(2)5℃條件下，將上述離心管放置磁體上3min，為了收集離心管蓋子上遺留的磁珠，1min后輕輕地將磁體和離心管顛倒；

(3)用移液槍小心地將上清移除；

(4)在管中加入800μL預(yù)冷的Buffer1，將管從磁體上取下，小心重懸磁體細(xì)胞，將懸浮液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的管中；

(5)將上述離心管放置磁體上3min，用移液槍小心地將上清移除；

(6)重復(fù)(4)和(5)四次；即一共清洗5次；

(7)將磁珠懸浮液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新管中，放在冰上，并立即進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

D、從循環(huán)腫瘤細(xì)胞中分離mRNA

試劑盒：Dynabeads mRNA DIRECT Micro Kit，公司：Invitrogen，貨號：61021

1.準(zhǔn)備Oligo(dT)25磁珠

(1)渦旋大于30s或旋轉(zhuǎn)混合5min，重懸混勻Dynabeads Oligo(dT)25；

(2)轉(zhuǎn)移適當(dāng)體積的Dynabeads Oligo(dT)25(以25μL/RNA分離樣本計(jì))到新的RNase-free管中；

(3)加入等體積Lysis/Binding Buffer(以25μL/RNA分離樣本計(jì))；

(4)將該管放置在磁體上1min，移除上清；

(5)從磁體上取下管，用與步驟(2)相同體積的Lysis/Binding buffer(以25μL/RNA分離樣本計(jì))，每個(gè)樣本管分裝25μL懸浮液。

2.腫瘤細(xì)胞裂解

(1)經(jīng)過Dynabeads Epithelial Enrich試劑盒分離的腫瘤細(xì)胞，最后一次漂洗后，立即將磁珠-細(xì)胞混合樣放在冰上，等待mRNA分離和PCR；

(2)在mRNA分離前，將樣本管放置在磁體上2min，移除上清；

(3)使用100μL Lysis/Binding Buffer重懸磁珠-細(xì)胞混合體系；

(4)上下吹吸3次，注意不要起沫。

3.mRNA分離

(1)將包含裂解細(xì)胞的樣本管放置在磁體上3min；

(2)將上清轉(zhuǎn)移到包含有25μL預(yù)漂洗的Dynabeads Oligo(dT)25懸浮液(步驟第四部分-1-(5))；

(3)吹吸數(shù)次混合均勻，注意不要起沫；

(4)將樣本管固定在樣本混合器或旋轉(zhuǎn)儀上，室溫下混合至少5min，保證mRNA充分與磁珠結(jié)合；

(5)將樣本管放置在磁體上，移除上清。從磁體上取下樣本管，加入100μL washing buffer A用槍頭小心重懸磁珠-mRNA混合體系；

(6)將樣本管放置在磁體上，移除上清；

(7)重復(fù)步驟5-6；

(8)用100μL washing buffer B重懸磁珠-mRNA混合體系；

(9)將懸浮液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的管中；

(10)將上述新的樣本管放置在磁體上，移除上清；

(11)用100μL washing buffer B重懸磁珠-mRNA混合體系；

(12)將樣本管放置在磁體上，移除上清；

(13)從磁體上取下樣本管，用13.5μL在冰上預(yù)冷的10mM Tris-HCl重懸；

(14)72℃孵育樣本管2min，將管放置在磁體上立刻轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，該體系可直接用于反轉(zhuǎn)錄或在-80℃保存。

E、將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA

試劑盒：QuantiNova SYBR Green PCR Kit，公司：Qiagen，貨號：208054

所述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序?yàn)椋?7℃保持60min；然后再93℃保持5min，再置于4℃下保存。

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為：總體積為20μL，10×Buffer RT 2.0μL，dNTPs 2.0μL，Oligo dT primer 2.0μL，Sensicript Reverse Transcriptase 1.0μL，40U/μL的RNase Inhibitor 0.25μL，mRNA-Tris-HCl重懸液12μL，余量為水。

F、RT-qPCR檢測

PCR反應(yīng)體系為：總體積為20μL，2x QuantiNova SYBR Green PCR Master Mix 2.0μL，Rox 0.1μL，10μM的Forward Primer 1.4μL，10μM的Reverse Primer 1.4μL，cDNA 1.0μL，RNase-Free water 6.1μL，余量為水。

使用的PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋涸?5℃溫度下預(yù)變性2min；然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)依次包括以下步驟：在95℃溫度下保存5s，在60℃溫度下保存30s；完成40個(gè)循環(huán)之后，即完成PCR擴(kuò)增程序。

最后所應(yīng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，所應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式而已，并不用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡在本發(fā)明的 精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。