流感病毒重配的制作方法
【專利摘要】提供用于生產(chǎn)重配甲型流感病毒的新型流感供體毒株。
【專利說(shuō)明】流感病毒重配
[0001]本專利申請(qǐng)要求2012年3月2日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)61/605，922和2012年3月23日提交的61/685，766的優(yōu)先權(quán)，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用納入本文。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及甲型流感病毒重配領(lǐng)域。此外，其涉及制造用于保護(hù)抵御甲型流感病
毒的疫苗。
【背景技術(shù)】
[0003]針對(duì)流感感染的最有效保護(hù)是抗流行株的疫苗接種，從而盡快生成用于疫苗生產(chǎn)的流感病毒是重要的。
[0004]野生型流感病毒通常在卵和細(xì)胞培養(yǎng)物內(nèi)生長(zhǎng)達(dá)到低效價(jià)。為了獲得生長(zhǎng)更好的毒株用于疫苗生產(chǎn)，目前常見(jiàn)的做法是用快速生長(zhǎng)的高產(chǎn)供體毒株重配流行疫苗株。這可以通過(guò)以下方法完成:用所述流行流感毒株(所述疫苗毒株)和所述高產(chǎn)供體毒株共同感染培養(yǎng)宿主，并選擇含有來(lái)自所述疫苗毒株的血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)區(qū)段和來(lái)自所述供體毒株的其它病毒區(qū)段(即，編碼NSdPNS2的那些)的重配病毒。另一個(gè)方法是通過(guò)反向遺傳學(xué)重配所述流感病毒(參見(jiàn)，例如參考文獻(xiàn)I和2)。
[0005]參考文獻(xiàn)3報(bào)道，含有來(lái)自A/Texas/1/77的PBl基因區(qū)段、來(lái)自A/NewCaledonia/20/99的HA和NA區(qū)段、源自A/Puerto Rico/8/34的經(jīng)修飾PA區(qū)段和來(lái)自A/Puerto Rico/8/34的剩余病毒區(qū)段的重配流感病毒顯示在細(xì)胞中的生長(zhǎng)增加。
[0006]目前，就重配流感病毒而言僅有有限數(shù)量的供體毒株用于疫苗生產(chǎn)，而最常用的毒株是A/Puerto Rico/8/34 (A/PR/8/34)毒株。然而，包含A/PR/8/34主鏈區(qū)段的重配流感病毒常常不能充分良好生長(zhǎng)以確保有效疫苗生產(chǎn)。因此，本領(lǐng)域需要提供進(jìn)一步和改善的供體毒株用于流感病毒重配。
[0007]優(yōu)選實(shí)施方式概述
[0008]本發(fā)明的發(fā)明人目前已驚奇地發(fā)現(xiàn)包含來(lái)自兩種或多種流感供體毒株的主鏈區(qū)段的流感病毒相較于包含來(lái)自相同供體毒株的全部主鏈區(qū)段的重配甲型流感病毒能在培養(yǎng)宿主內(nèi)更快生長(zhǎng)。具體而言，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)包含源自兩種高產(chǎn)供體毒株的主鏈區(qū)段的流感病毒能用靶標(biāo)疫苗相關(guān)HA/NA基因產(chǎn)出比用所述兩種原始供體毒株中任一種所制得重配株更高產(chǎn)的重配株。
[0009]原則上，可以特定重配緊密相關(guān)的所有甲型流感病毒區(qū)段以生產(chǎn)活病毒，但這些病毒中僅有一小部分成為高度生長(zhǎng)重配株，這歸因于所得病毒成分的低效活性。發(fā)明人提供了生產(chǎn)所述高產(chǎn)毒株的主鏈組合。包含來(lái)自兩種或多種流感供體毒株的主鏈區(qū)段的重配甲型流感病毒可包含來(lái)自相同供體毒株，特別是A/New Caledonia/20/1999樣毒株(本文中稱作105p30毒株)的PBl和PB2病毒區(qū)段。所述PBl和PB2病毒區(qū)段可與SEQ ID NO:
2和/或SEQ ID NO:3序列有至少95%相同性或100%相同性。
[0010]當(dāng)所述重配甲型流感病毒包含來(lái)自兩種或三種供體毒株的主鏈區(qū)段時(shí)，各供體毒株可提供多于一種的所述重配甲型流感病毒主鏈區(qū)段，但所述供體毒株中的一或兩種也可僅提供單一的主鏈區(qū)段。
[0011]當(dāng)所述重配甲型流感病毒包含來(lái)自二、三、四或五種供體毒株的主鏈區(qū)段時(shí)，所述供體毒株中的一種或兩種可提供多于一種的所述重配甲型流感病毒主鏈區(qū)段。一般而言，所述重配甲型流感病毒不能包含多于六種主鏈區(qū)段。因此，例如，若一種所述供體毒株提供五種所述病毒區(qū)段，則該重配甲型流感病毒僅能包含來(lái)自總共兩種不同供體毒株的主鏈區(qū)段。
[0012]當(dāng)重配甲型流感病毒包含來(lái)自A/Texas/1/77的PBl區(qū)段時(shí)，其優(yōu)選不包含來(lái)自A/Puerto Rico/8/34的PA、NP或M區(qū)段。當(dāng)重配甲型流感病毒包含來(lái)自A/Puerto Rico/8/34的PA、NP或M區(qū)段時(shí)，其優(yōu)選不包含來(lái)自A/Texas/1/77的PBl區(qū)段。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明不包括具有來(lái)自A/Texas/1/77的PBl區(qū)段和來(lái)自A/Puerto Rico/8/34的PA、NP和M區(qū)段的重配甲型流感病毒。所述來(lái)自A/Texas/1/77的PBl區(qū)段可具有SEQ ID NO:46的序列，而來(lái)自A/Puerto Rico/8/34的PA、NP或M區(qū)段可分別具有SEQ ID N047、48或49的序列。[0013]本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，已知供體毒株的變體相較于所述原供體毒株能生長(zhǎng)達(dá)到更高的病毒效價(jià)，因此能成為用于重配流感病毒的更好供體毒株。該毒株的例子是PR8-X和105p30o
[0014]本發(fā)明的甲型流感毒株相較于相同時(shí)間和相同生長(zhǎng)條件下的A/PuertoRico/8/34在MDCK細(xì)胞中能生長(zhǎng)達(dá)到更高病毒效價(jià)，和/或相較于包含來(lái)自相同流感供體毒株的全部主鏈區(qū)段的重配流感毒株而言具有更高的拯救效率。本發(fā)明還提供包含來(lái)自所述流感毒株的至少一種主鏈病毒區(qū)段的重配甲型流感病毒。
[0015]本發(fā)明還提供包含來(lái)自供體毒株的至少一種主鏈病毒區(qū)段的重配甲型流感病毒，其中，所述供體毒株選自105p30和PR8-X。當(dāng)所述至少一種主鏈病毒區(qū)段是PA區(qū)段時(shí)，其序列可與選自SEQ ID NO:9和17的序列有至少95%相同性或至少99%相同性。當(dāng)所述至少一種主鏈病毒區(qū)段是PBl區(qū)段時(shí)，其序列可與選自SEQ ID NO:10和18的序列有至少95%或至少99%相同性。當(dāng)所述至少一種主鏈病毒區(qū)段是PB2區(qū)段時(shí)，其序列可與選自SEQID NO:11和19的序列有至少95%或至少99%相同性。當(dāng)所述至少一種主鏈病毒區(qū)段是M區(qū)段時(shí)，其序列可與選自SEQ ID NO:13和21的序列有至少95%或至少99%相同性。當(dāng)所述至少一種主鏈病毒區(qū)段是NP區(qū)段時(shí)，其序列可與選自SEQ ID NO:12和20的序列有至少95%或至少99%相同性。當(dāng)所述至少一種主鏈病毒區(qū)段是NS區(qū)段時(shí)，其序列可與選自SEQ ID NO:14和22的序列有至少95%或至少99%相同性。
[0016]在所述重配甲型流感病毒包含來(lái)自至少兩種流感供體毒株的主鏈區(qū)段的實(shí)施方式中，至少一種主鏈區(qū)段可以源自選自105p30和PR8-X的供體毒株(如上文段落中討論)。優(yōu)選的重配甲型流感病毒包含來(lái)自105p30供體毒株的1、2、3或4種病毒區(qū)段，其中，所述PA區(qū)段可與SEQ ID NO: 17有至少95%相同性或100%相同性，所述NP區(qū)段可與SEQ IDNO:20有至少95%相同性或100%相同性，所述M區(qū)段可與SEQ ID NO:21有至少95%相同性或100%相同性，和/或所述NS區(qū)段可與SEQ ID NO:22有至少95%相同性或100%相同性。在一些實(shí)施方式中，所述甲型流感病毒還可包含來(lái)自PR8-X供體毒株的至少一種主鏈病毒區(qū)段。當(dāng)所述至少一種病毒區(qū)段是PA區(qū)段時(shí)，其可與SEQ ID NO:9有至少95%相同性或100%相同性。當(dāng)所述至少一種病毒區(qū)段是NP區(qū)段時(shí)，其可與SEQ ID NO:12有至少95%相同性或100%相同性。當(dāng)所述至少一種病毒區(qū)段是M區(qū)段時(shí)，其可與SEQ ID NO:
13有至少95%相同性或100%相同性。當(dāng)所述至少一種病毒區(qū)段是NS區(qū)段時(shí)，其可與SEQID NO:9有至少95%相同性或100%相同性。本發(fā)明人顯示，包含所述主鏈區(qū)段的重配甲型流感病毒在細(xì)胞培養(yǎng)物中生長(zhǎng)良好。一般而言，重配流感病毒僅會(huì)包含各主鏈區(qū)段中的一種。例如，當(dāng)所述流感病毒包含來(lái)自105p30的PA區(qū)段時(shí)，其同時(shí)不包含PR8-X的PA區(qū)段。
[0017]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述病毒包含的病毒區(qū)段與(a) SEQ ID NO:19的PB2區(qū)段、SEQ ID:N018 的 PBl 區(qū)段和 SEQ ID NO:22 的 NS 區(qū)段；或(b) SEQ ID NO:19 的 PB2 區(qū)段、SEQ ID NO:18 的 PBl 區(qū)段和 SEQ ID NO:21 的 M 區(qū)段；或(c) SEQ ID NO:19 的 PB2 區(qū)段、SEQ ID NO:18 的 PBl 區(qū)段和 SEQ ID NO:20 的 NP 區(qū)段；或(d) SEQ ID NO:19 的 PB2 區(qū)段、SEQ ID NO:18的PBl區(qū)段和SEQ ID N017的PA區(qū)段有至少95%相同性或100%相同性。優(yōu)選這些實(shí)施方式，因?yàn)楸景l(fā)明人發(fā)現(xiàn)這種重配甲型流感病毒在細(xì)胞培養(yǎng)物中生長(zhǎng)地特別好。
[0018]本發(fā)明提供一種制備本發(fā)明重配甲型流感病毒的方法。這些方法包括以下步驟(i)將一種或多種表達(dá)構(gòu)建體引入培養(yǎng)宿主，所述表達(dá)構(gòu)建體編碼產(chǎn)生甲型流感病毒所需的病毒區(qū)段，其中，主鏈病毒片段來(lái)自兩種或多種流感毒株；和(ii)培養(yǎng)所述培養(yǎng)宿主以產(chǎn)生重配病毒，和可選地(iii)純化步驟(ii)中獲得的病毒。
[0019]所述方法可包括以下步驟(i)將一種或多種表達(dá)構(gòu)建體引入培養(yǎng)宿主，所述表達(dá)構(gòu)建體編碼產(chǎn)生甲型流感病毒所需的病毒區(qū)段，其中，主鏈病毒片段來(lái)自兩種或多種流感毒株并且所述PBl和PB2區(qū)段來(lái)自相同供體毒株；和(ii)培養(yǎng)所述培養(yǎng)宿主以產(chǎn)生重配病毒，和可選地(iii)純化步驟(ii)中獲得的病毒。
[0020]還提供一種制備本發(fā)明重配甲型病毒的方法，所述方法包括以下步驟(i)將一種或多種表達(dá)構(gòu)建體引入培養(yǎng)宿主，所述表達(dá)構(gòu)建體編碼產(chǎn)生甲型流感病毒所需的病毒區(qū)段，其中，所述主鏈病毒區(qū)段來(lái)自兩種或多種流感毒株并且HA和PBl區(qū)段來(lái)自具有相同流感HA亞型的不同流感毒株；和(ii)培養(yǎng)所述培養(yǎng)宿主以產(chǎn)生重配病毒，和可選地(iii)純化步驟(ii)中獲得的病毒。
[0021]本發(fā)明還提供一種制備本發(fā)明重配甲型病毒的方法，所述方法包括以下步驟(i)將一種或多種表達(dá)構(gòu)建體引入培養(yǎng)宿主，所述表達(dá)構(gòu)建體編碼產(chǎn)生甲型流感病毒所需的病毒區(qū)段，其中一種或多種主鏈病毒區(qū)段來(lái)自105p30和/或PR8-X流感毒株并且其中至少一種病毒區(qū)段源自第二種流感毒株；和(ii)培養(yǎng)所述培養(yǎng)宿主以產(chǎn)生重配病毒，和可選地
(iii)純化步驟(ii)中獲得的病毒。
[0022]所述方法還可包括以下步驟:(iv)用步驟(ii)或步驟(iii)中獲得的病毒感染培養(yǎng)宿主；(V)培養(yǎng)來(lái)自步驟(iv)的培養(yǎng)宿主以生成其它病毒；和可選地(vi)純化步驟(V)中獲得的病毒。
[0023]本發(fā)明還提供一種用于產(chǎn)生流感病毒的方法，所述方法包括以下步驟(a)用本發(fā)明的重配病毒感染培養(yǎng)宿主；(b)培養(yǎng)來(lái)自步驟(a)的宿主以產(chǎn)生所述病毒；和可選地(C)純化步驟(b)中獲得的病毒。
[0024]本發(fā)明還提供一種制備疫苗的方法，所述方法包括以下步驟(d)通過(guò)上述實(shí)施方式中任何一種的方法制備病毒和(e)從所述病毒制備疫苗。
[0025]在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供流感毒株P(guān)R8-X和105p30。
[0026]本發(fā)明還包括變體HlNr流感毒株，其中，使用成對(duì)比對(duì)算法與SEQ ID NO: 33對(duì)齊時(shí)，M基因組區(qū)段在對(duì)應(yīng)SEQ ID NO:33中氨基酸95的位置處具有賴氨酸。在使用成對(duì)比對(duì)算法與SEQ ID NO:35對(duì)齊時(shí)，本發(fā)明所述的變體HlNl流感毒株還可在對(duì)應(yīng)SEQ ID NO:35中氨基酸225的位置處具有甘氨酸和/或在對(duì)應(yīng)SEQ ID NO:35中氨基酸231的位置處具有天冬酰胺。在使用成對(duì)比對(duì)算法與SEQ ID NO:31對(duì)齊時(shí)，所述變體HlNl流感毒株還可在對(duì)應(yīng)SEQ ID NO:31中氨基酸70的位置處具有組氨酸。
[0027]優(yōu)選的成對(duì)比對(duì)算法是Needleman-Wunsch全局比對(duì)算法[4],使用默認(rèn)參數(shù)(如缺口開(kāi)放罰分=10.0，缺口延伸罰分=0.5，使用EBL0SUM62評(píng)分矩陣)。用EMBOSS軟件包中的needle工具能方便地實(shí)施這種算法[5]。
[0028]本發(fā)明提供一種表達(dá)系統(tǒng)，所述表達(dá)系統(tǒng)包括一種或多種含有編碼甲型流感病毒區(qū)段的vRNA的表達(dá)構(gòu)建體，其中，所述表達(dá)構(gòu)建體編碼來(lái)自兩種或多種流感供體毒株的主鏈病毒區(qū)段。所述表達(dá)構(gòu)建體可編碼來(lái)自相同供體毒株的PBl和PB2區(qū)段。
[0029]本發(fā)明還提供一種表達(dá)系統(tǒng)，所述表達(dá)系統(tǒng)包括一種或多種含有編碼105p30或PR8-X毒株區(qū)段的vRNA的表達(dá)構(gòu)建體，其中，所述表達(dá)構(gòu)建體包含來(lái)自105p30或PR8-X或毒株的至少一種主鏈病毒區(qū)段。所述表達(dá)構(gòu)建體還可包含編碼來(lái)自PR8-X的PB2、NP、NS、M和PA區(qū)段的vRNA。
[0030]本發(fā)明還提供一種包含本發(fā)明表達(dá)系統(tǒng)的宿主細(xì)胞。這些宿主細(xì)胞能從所述表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)構(gòu)建體表達(dá)甲型流感病毒。
[0031]還提供可用于本發(fā)明表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)構(gòu)建體。例如，本發(fā)明提供一種表達(dá)構(gòu)建體，所述表達(dá)構(gòu)建體在同一構(gòu)建體上編碼本發(fā)明所述的重配流感毒株的主鏈區(qū)段。
[0032]供體毒株
[0033]流感供體毒株是通常提供重配流感病毒中主鏈區(qū)段的毒株，盡管其有時(shí)還可提供(但不同時(shí)提供)所述病毒的HA或NA區(qū)段。然而，重配流感病毒中的HA和NA區(qū)段通常來(lái)自疫苗毒株。
[0034]本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，包含來(lái)自兩種或多種流感供體毒株的主鏈區(qū)段的重配甲型流感病毒相較于包含來(lái)自相同供體毒株的全部主鏈區(qū)段的重配流感病毒能夠在細(xì)胞培養(yǎng)物中生長(zhǎng)到更高效價(jià)。本發(fā)明人顯示，該效應(yīng)歸因于存在來(lái)自兩種供體毒株的主鏈區(qū)段，而且并不需要存在具有特定突變的病毒區(qū)段。然而，使用甲型流感病毒獲得特別好的結(jié)果，其中與SEQ ID NO:33對(duì)齊時(shí)M基因組區(qū)段在對(duì)應(yīng)SEQ ID NO:33中氨基酸95的位置處具有賴氨酸。
[0035]包含來(lái)自相同流感毒株(例如105p30)PBl和PB2區(qū)段的重配甲型流感病毒也是有利的，因?yàn)槠湎噍^于PBl和PB2區(qū)段來(lái)自不同病毒的流感病毒顯示更好的拯救效率。105p30的PBl和PB2區(qū)段分別具有SEQ ID N018和19的序列。
[0036]本發(fā)明人還顯示，一些流感毒株在MDCK細(xì)胞中相較于A/Puerto Rico/8/34在相同時(shí)間于相同生長(zhǎng)條件下能生長(zhǎng)到更高病毒效價(jià)。
[0037]源自本發(fā)明供體毒株或其它已知供體毒株例如A/PR/8/34(野生型PR8)的流感供體毒株的變體也可作為供體毒株使用。這些供體毒株相較于其來(lái)源供體毒株(在相同時(shí)間于相同生長(zhǎng)條件下)能生長(zhǎng)到更高病毒效價(jià)。例如，本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞培養(yǎng)物中傳代A/PR/8/34流感毒株數(shù)次產(chǎn)生相較于原始A/PR8/34毒株生長(zhǎng)到高許多病毒效價(jià)的毒株(PR8-X)。同樣地，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞中傳代A/New Caledonia/20/1999毒株數(shù)次產(chǎn)生相較于未傳代A/New Caledonia/20/1999毒株在相同時(shí)間于相同生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)到甚至更高病毒效價(jià)的毒株(105p30)。本發(fā)明的供體毒株變體達(dá)到的病毒效價(jià)通常是所述變體來(lái)源的供體毒株在相同生長(zhǎng)條件下于相同時(shí)間(例如12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)或72小時(shí))所得病毒效價(jià)的至少10%、至少20%、至少50%、至少100%、至少200%、至少500%或至少1000%。
[0038] PR8-X 的區(qū)段具有 SEQ ID NO:11 (PB2)、SEQ ID NO:10 (PBl)、SEQ ID NO:9 (PA)、SEQ ID NO: 12 (NP)、SEQ ID NO: 13 (M), SEQ ID NO: 14 (NS)、SEQ ID NO: 15 (HA)或 SEQ IDNO: 16 (NA)的序列。
[0039]105p30 的區(qū)段具有 SEQ ID NO:19 (PB2)、SEQ ID NO:18 (PBl)、SEQ ID NO:17 (PA)、SEQ ID NO:20 (NP)、SEQ ID NO:21 (M)、SEQ ID NO:22 (NS)、SEQ ID NO:23 (HA)或 SEQ IDNO:24 (NA)的序列。
[0040]包含105p30或PR8-X毒株的1、2、3、4、5、6或7種區(qū)段的流感毒株也可作為供體
毒株使用。
[0041]本發(fā)明還可用具有與SEQ ID N011-14或18-22序列至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約99%相同的病毒區(qū)段的供體毒株實(shí)施。例如，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，有不同序列的若干核酸編碼相同多肽是可能的。因此，本發(fā)明可用編碼與序列SEQ ID N011-14或18-22相同多肽的病毒區(qū)段實(shí)施。例如，SEQID NO:3和28的核苷酸序列僅有73%相同性，盡管其編碼相同的病毒蛋白。
[0042]本發(fā)明還可以用編碼多妝與SEQ ID N011-14或18-22所編碼多妝序列有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%相同性的病毒區(qū)段實(shí)施。
[0043]病毒傳代過(guò)程中能出現(xiàn)的自發(fā)性突變也可產(chǎn)生DNA和氨基酸序列內(nèi)的變異。所述變體流感毒株也可用于本發(fā)明。
[0044]重配病毒
[0045]本發(fā)明提供包含來(lái)自兩種或多種流感供體毒株的主鏈區(qū)段的重配流感病毒。PBl和PB2區(qū)段可來(lái)自相同供體毒株。
[0046]本發(fā)明還提供包含來(lái)自流感毒株的至少一種主鏈病毒區(qū)段的重配流感病毒，所述流感毒株在MDCK細(xì)胞中相較A/Puerto Rico/8/34在相同時(shí)間于相同生長(zhǎng)條件下能生長(zhǎng)到更高病毒效價(jià)。
[0047]本發(fā)明提供包含來(lái)自本發(fā)明供體毒株(例如PR8-X或105p30毒株)的至少一種主鏈病毒區(qū)段的重配流感病毒。本發(fā)明的重配流感病毒可以是兩種、三種或更多不同流感病毒間的重配株，前提是至少一種病毒區(qū)段源自本發(fā)明的供體毒株。
[0048]流感病毒是分區(qū)段負(fù)鏈RNA病毒。甲型和乙型流感病毒具有八種區(qū)段(NP、M、NS、PA,PBUHA和NA)，而丙型流感病毒具有7種。本發(fā)明的重配病毒包含來(lái)自兩種或多種供體毒株的主鏈區(qū)段，或來(lái)自本發(fā)明供體毒株的至少一種(即，一種、兩種、三種、四種、五種或六種)主鏈病毒區(qū)段。所述主鏈病毒區(qū)段是不編碼HA或NA的那些。因此，主鏈區(qū)段通常編碼所述流感病毒的PBl、PB2、PA、NP、MpM2AS1和NS2多肽。所述重配病毒通常不包含編碼來(lái)自所述供體毒株的HA和NA的區(qū)段，盡管也考慮包含來(lái)自本發(fā)明供體毒株的HA或NA但不同時(shí)包含二者的重配病毒。
[0049]當(dāng)本發(fā)明的重配病毒是包含來(lái)自單一供體毒株的主鏈區(qū)段的重配株時(shí)，所述重配病毒包含的供體毒株與疫苗毒株的區(qū)段比通常是1: 7、2: 6、3: 5、4: 4、5: 3、6: 2或7: I。通常具有來(lái)自供體毒株的大部分區(qū)段，特別是6: 2的比率。當(dāng)所述重配病毒包含來(lái)自兩種供體毒株的主鏈區(qū)段時(shí)，所述重配病毒包含的來(lái)自第一種供體毒株、來(lái)自第二種供體毒株和來(lái)自疫苗毒株的區(qū)段比通常是1:1: 6、1: 2: 5、1: 3: 4、1: 4: 3、1: 5: 2、1: 6: 1、2:1: 5、2: 2: 4、2: 3: 3、2: 4: 2、2: 5: 1、3:1: 2、
3: 2: 1、4:1: 3、4: 2: 2、4: 3: 1、5:1: 2、5: 2:1 或 6:1:1。
[0050]優(yōu)選地，所述重配病毒不包含供體毒株的HA區(qū)段，因?yàn)镠A區(qū)段編碼所述流感病毒的主要疫苗抗原，從而應(yīng)該來(lái)自所述疫苗毒株。因此，本發(fā)明的重配病毒優(yōu)選至少具有來(lái)自所述疫苗毒株的HA區(qū)段，并且通常是來(lái)自所述疫苗毒株的HA和NA區(qū)段。
[0051]本發(fā)明還包括含有來(lái)自多于一種(例如兩種或三種不同的)供體毒株的病毒區(qū)段的重配病毒，其中，至少一種優(yōu)選不是HA的病毒區(qū)段源自PR8-X或105p30流感毒株。所述重配流感病毒通常包含來(lái)自疫苗毒株的HA和/或NA區(qū)段。當(dāng)所述重配株包含來(lái)自多于一種流感供體毒株的病毒區(qū)段時(shí)，其它供體毒株可以是包括本發(fā)明供體毒株在內(nèi)的任何供體毒株。例如,所述病毒區(qū)段中的一些可以源自A/PR/8/34或AA/6/60(A/Ann Arbor/6/60)流感毒株。包含來(lái)自AA/6/60毒株的病毒區(qū)段的重配株是有利的，例如，所述重配病毒可以活減毒疫苗形式使用。
[0052]本發(fā)明還包括包含來(lái)自多于一種疫苗毒株的病毒區(qū)段的重配株，前提是所述重配株包含本發(fā)明所述的主鏈。例如，所述重配流感病毒可包含來(lái)自一種供體毒株的HA區(qū)段和來(lái)自一種不同供體毒株的NA區(qū)段。
[0053]本發(fā)明的重配病毒相較于野生型疫苗毒株能生長(zhǎng)到更高效價(jià)，其中所述重配病毒的一些病毒區(qū)段在相同生長(zhǎng)條件和相同時(shí)間(例如12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)或72小時(shí))下獲得。所述病毒效價(jià)可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定。在相同時(shí)間框于相同條件下，本發(fā)明的重配病毒能達(dá)到的病毒效價(jià)比野生型疫苗毒株的病毒效價(jià)高出至少10 %、至少20%、至少50%、至少100%、至少200%、至少500%或至少1000%。
[0054]本發(fā)明適合重配流行性和大流行性(季節(jié)性)流感疫苗毒株。所述重配流感毒株可包括甲型流感病毒擬亞型111、112、113、114、冊(cè)、冊(cè)、117、118、119、1110、1111、1112、1113、1114、H15或H16。其可包括甲型流感病毒NA亞型N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9。當(dāng)用于本發(fā)明重配流感病毒中的疫苗毒株是季節(jié)性流感毒株時(shí)，所述疫苗毒株可具有Hl或H3亞型。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，所述疫苗毒株是HlNl或H3N2毒株。
[0055]本發(fā)明中所用的疫苗毒株還可以是流行性或潛在流行性毒株?？赡芤鸫罅餍斜l(fā)的流感毒株的特征是:(a)與目前流行人毒株中的血凝素相比，它含有新的血凝素，即十年來(lái)在人群中未見(jiàn)的血凝素(如H2)，或者從未在人群中發(fā)現(xiàn)的血凝素(如通常只出現(xiàn)在鳥(niǎo)群中的H5、H6或H9)，以至于人群未曾免疫接觸過(guò)該毒株的血凝素；(b)它能夠在人群中橫向傳播；和(c)它對(duì)人有致病性。優(yōu)選具有H5血凝素型的疫苗毒株，其中，所述重配病毒在用于針對(duì)流行性流感(例如H5N1毒株)免疫的疫苗中使用。其它可能的株系包括H5N3、H9N2、H2N2、H7N1和H7N7，以及任何其它可能出現(xiàn)的大流行株。本發(fā)明特別適于生產(chǎn)用于疫苗的重配病毒以保護(hù)抵御可能或已經(jīng)從非人動(dòng)物群體傳播到人類的潛在大流行毒株(如豬源HlNl流感株)。
[0056]本發(fā)明的重配毒株可包含來(lái)自A/California/4/09毒株的HA區(qū)段和/或NA區(qū)段。因此例如HA基因片段可編碼Hl血凝素，所述血凝素與SEQ ID NO:32的相關(guān)性比SEQID N0:25更緊密(即使用相同算法和參數(shù)，與SEQ ID NO:32相比的序列相同性比SEQ IDN0:25更高)。SEQ ID NO:32和25有80%相同性。相似地，所述NA基因可編碼NI神經(jīng)氨酸苷酶，其與SEQ ID NO:27的相關(guān)性比SEQ ID NO:26更緊密。SEQ ID NO:27和26具有82%相同性。
[0057]可用作疫苗毒株的毒株包括對(duì)抗病毒治療有抗性(例如對(duì)奧塞米韋[6]和/或扎那米韋有抗性)的毒株，包括抗性大流行毒株[7]。
[0058]本發(fā)明方法中所用供體毒株的選擇可取決于待重配的疫苗毒株。由于遠(yuǎn)進(jìn)化距離間的重配株在細(xì)胞培養(yǎng)中可能無(wú)法良好復(fù)制，因此所述供體毒株和疫苗毒株有可能具有相同HA和/或NA亞型。然而，在其它實(shí)施方式中，疫苗毒株和供體毒株可具有不同HA和/或NA亞型，而這種配置可有利于選擇包含來(lái)自所述疫苗毒株中HA和/或NA區(qū)段的重配毒株。因此，盡管105p30和PR8-X毒株包含Hl流感亞型，這些供體毒株仍可用于不包含Hl流感亞型的疫苗毒株。
[0059]也可使用其中HA和/或NA區(qū)段已變?yōu)槠渌鼇喰偷谋景l(fā)明供體毒株的重配株。105p30或PR8-X毒株的Hl流感亞型可以變化，例如，變?yōu)镠3或H5亞型。
[0060]因此，本發(fā)明包括的甲型流感病毒含有來(lái)自本發(fā)明105p30或PR8-X毒株的一種、兩種、三種、四種、五種、六種或七種病毒區(qū)段和非Hl亞型的HA區(qū)段。所述重配供體毒株還可包含非NI亞型的NA區(qū)段。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚用于重配供體毒株的合適技術(shù)。
[0061]本發(fā)明還包括的重配供體毒株包含來(lái)自本發(fā)明105p30或PR8-X毒株的至少一種，至少兩種，至少三種，至少四種，至少五種，至少六種或至少七種病毒區(qū)段和源自不同流感毒株的HlHA區(qū)段。
[0062]包含不編碼功能性NS蛋白的NS區(qū)段的重配病毒也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。參考文獻(xiàn)8描述了 NSl敲除突變。這些NSl突變病毒株尤其適于制備活減毒流感疫苗。
[0063]本發(fā)明方法中所用的“第二種流感毒株”不同于所用的供體毒株。
[0064]反向遺傳學(xué)
[0065]本發(fā)明特別適合于通過(guò)反向遺傳學(xué)技術(shù)生產(chǎn)重配流感病毒株。在這些技術(shù)中，所述病毒使用表達(dá)系統(tǒng)在培養(yǎng)宿主中產(chǎn)生。
[0066]一方面，所述表達(dá)系統(tǒng)可編碼來(lái)自相同供體毒株的PBl和PB2區(qū)段。在本發(fā)明的這一方面，所述系統(tǒng)可編碼來(lái)自其它流感供體毒株的NP、M、NS和/或PA區(qū)段中的至少一種(即，一種、兩種、三種或四種)。
[0067]在另一個(gè)方面，所述系統(tǒng)可編碼來(lái)自PR8-X毒株的I種或更多(例如，1、2、3、4、5或6種)基因組區(qū)段，但這些區(qū)段通常不包括PR8-X HA區(qū)段也通常不包括PR8-X NA區(qū)段。因此所述系統(tǒng)可編碼來(lái)自PR8-X的NP、M、NS、PA、PB1和/或PB2中的至少一個(gè)區(qū)段(可能全部六個(gè))。
[0068]所述系統(tǒng)可編碼來(lái)自105p30毒株的I種或更多(例如，1、2、3、4、5或6種)基因組區(qū)段， 但這些區(qū)段通常不包括105p30HA區(qū)段且通常不包括105p30NA區(qū)段。因此所述系統(tǒng)可編碼來(lái)自105p30的NP、M、NS、PA、PBl和/或PB2中至少一個(gè)區(qū)段(可能全部六個(gè))。
[0069]甲型和乙型流感病毒的反向遺傳學(xué)可用表達(dá)起始復(fù)制與轉(zhuǎn)錄所需4種蛋白(PB1、PB2、PA和核蛋白)的12種質(zhì)粒以及所有八種病毒基因組區(qū)段來(lái)實(shí)施。然而為減少構(gòu)建體數(shù)量，多個(gè)RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄盒(用于合成病毒RNA)可包含在單一質(zhì)粒(如編碼1、2、3、4、
5、6、7或所有8種流感vRNA片段的序列)上，并且多個(gè)蛋白編碼區(qū)與RNA聚合酶II啟動(dòng)子可包含在另一個(gè)質(zhì)粒(如編碼1、2、3、4、5、6、7或所有8種流感mRNA轉(zhuǎn)錄物的序列)上
[9]。也可將一種或多種流感vRNA區(qū)段納入pol I啟動(dòng)子的控制下并將一種或多種流感蛋白編碼區(qū)納入同一質(zhì)粒的另一啟動(dòng)子控制下，特別是pol II啟動(dòng)子。這優(yōu)選通過(guò)使用雙向質(zhì)粒完成。
[0070]參考文獻(xiàn)9方法的優(yōu)選方面包括:(a)在單一表達(dá)構(gòu)建體上的PB1、PB2和PAmRNA編碼區(qū)域；和(b)在單一表達(dá)構(gòu)建體上的所有8種vRNA編碼區(qū)段。特別優(yōu)選在一種表達(dá)構(gòu)建體上包括神經(jīng)氨酸酶(NA)和血凝素(HA)區(qū)段并在另一表達(dá)構(gòu)建體上包括六種其他病毒區(qū)段，因?yàn)樾鲁霈F(xiàn)的流感病毒株通常在所述NA和/或HA區(qū)段具有突變。因此，在獨(dú)立表達(dá)構(gòu)建體上具有HA和/或NA區(qū)段的優(yōu)勢(shì)是僅需替代包含HA和NA序列的載體。因此，在本發(fā)明的一個(gè)方面中，所述疫苗毒株的NA和/或HA區(qū)段可包含在一個(gè)表達(dá)構(gòu)建體上，而來(lái)自一種或多種本發(fā)明供體毒株的vRNA編碼區(qū)段(不包括HA和/或NA區(qū)段)包含在不同的表達(dá)構(gòu)建體上。因此，本發(fā)明提供包含編碼本發(fā)明供體毒株中主鏈病毒區(qū)段的一種、兩種、三種、四種、五種或六種vRNA的表達(dá)構(gòu)建體。所述表達(dá)構(gòu)建體可不包括生成功能性HA和/或NA蛋白的HA和/或NA病毒區(qū)段。
[0071]已知反向遺傳學(xué)系統(tǒng)包括從pol I啟動(dòng)子、細(xì)菌RNA聚合酶啟動(dòng)子、噬菌體聚合酶啟動(dòng)子等表達(dá)編碼所需病毒RNA(vRNA)分子的DNA分子。由于流感病毒需要病毒聚合酶存在以完成生命周期，系統(tǒng)還可提供這些蛋白，例如，所述系統(tǒng)還包括編碼病毒聚合酶蛋白的DNA分子從而表達(dá)兩種類型DNA引起完全感染性病毒的裝配。還可以蛋白形式提供所述病毒聚合酶。
[0072]反向遺傳學(xué)用于流感vRNA表達(dá)時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚所述序列元件彼此的精確間隔對(duì)于所述聚合酶啟動(dòng)復(fù)制是重要的。因此編碼所述病毒RNA的DNA分子正確位于所述pol I啟動(dòng)子和所述終止序列之間很重要，但該定位在反向遺傳學(xué)系統(tǒng)操作人員的能力范圍內(nèi)。
[0073]為了生產(chǎn)重組病毒，細(xì)胞必須表達(dá)組裝病毒粒子所需病毒基因組的所有區(qū)段，克隆到本發(fā)明表達(dá)構(gòu)建體內(nèi)的DNA優(yōu)選提供所有病毒RNA和蛋白，但也可使用輔助病毒以提供一些RNA和蛋白，盡管優(yōu)選不使用輔助病毒的系統(tǒng)。由于所述流感病毒是分區(qū)段病毒，所述病毒基因組通常使用本發(fā)明方法中多于一種表達(dá)構(gòu)建體來(lái)表達(dá)。然而，還考慮在單一表達(dá)構(gòu)建體上組合所述病毒基因組的一種或多種區(qū)段或甚至所有節(jié)段。
[0074]在一些實(shí)施方式中，也可包括引起所述宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)輔助蛋白的表達(dá)構(gòu)建體。例如，作為反向遺傳學(xué)系統(tǒng)一部分表達(dá)非病毒絲氨酸蛋白酶(如胰蛋白酶)可具有優(yōu)勢(shì)。
[0075]表達(dá)構(gòu)建體
[0076]用于本發(fā)明表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)構(gòu)建體可以是單向或雙向表達(dá)構(gòu)建體。所述方法中使用多于一種轉(zhuǎn)基因時(shí)(不論在相同或不同表達(dá)構(gòu)建體上)，可能使用單向和/或雙向表達(dá)。
[0077]由于流感病毒的傳染性需要蛋白質(zhì)，通常優(yōu)選使用雙向表達(dá)構(gòu)建體，因?yàn)檫@能減少所述宿主細(xì)胞需要的表達(dá)構(gòu)建體總數(shù)。因此，本發(fā)明方法可利用至少一種雙向表達(dá)構(gòu)建體，其中基因或cDNA位于上游pol II啟動(dòng)子和下游非內(nèi)源pol I啟動(dòng)子之間。從所述polII啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄所述基因或cDNA產(chǎn)生可翻譯為蛋白質(zhì)的加帽正義病毒mRNA，而從所述非內(nèi)源pol I啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生負(fù)義vRNA。所述雙向表達(dá)構(gòu)建體可為雙向表達(dá)載體。
[0078]雙向表達(dá)構(gòu)建體包含從同一構(gòu)建體中的不同方向(即5'到3'和3'到5')驅(qū)動(dòng)表達(dá)的至少兩種啟動(dòng)子。所述兩種啟動(dòng)子可操作連接同一雙鏈DNA的不同鏈。優(yōu)選所述啟動(dòng)子之一是pol I啟動(dòng)子且至少一種其他啟動(dòng)子為pol II啟動(dòng)子。這是有利的，因?yàn)樗鯬Ol I啟動(dòng)子可用于表達(dá)非加帽的VRNA而所述pol II啟動(dòng)子可用于轉(zhuǎn)錄隨后翻譯為蛋白質(zhì)的mRNA，因此能從同一構(gòu)建體同時(shí)表達(dá)RNA和蛋白質(zhì)。當(dāng)表達(dá)系統(tǒng)中使用多于一種表達(dá)構(gòu)建體時(shí)，所述啟動(dòng)子可以是內(nèi)源和非內(nèi)源啟動(dòng)子的混合物。
[0079]所述表達(dá)構(gòu)建體中使用的pol I和pol II啟動(dòng)子可以與宿主細(xì)胞來(lái)源具有相同分類學(xué)目的生物內(nèi)源?；蛘撸搯?dòng)子可源自與所述宿主細(xì)胞不同分類學(xué)目的生物體。術(shù)語(yǔ)“目”指常規(guī)分類學(xué)分級(jí)，目的示例為靈長(zhǎng)目、哨齒目、食肉目、有袋目、鯨目等。人和大猩猩在同一分類學(xué)目中(靈長(zhǎng)目)，但人和狗在不同的目中(靈長(zhǎng)目與食肉目)。例如，可以使用人pol I啟動(dòng)子在犬細(xì)胞(例如，MDCK細(xì)胞)中表達(dá)病毒區(qū)段。
[0080]所述表達(dá)構(gòu)建體通常包括RNA轉(zhuǎn)錄終止序列。所述終止序列可為內(nèi)源終止序列或?qū)λ鏊拗骷?xì)胞非內(nèi)源的終止序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚合適的終止序列且其包括但不限于RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄終止序列、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄終止序列、和核酶。此外，所述表達(dá)構(gòu)建體可包括用于mRNA的一種或多種聚腺苷酸化信號(hào)，尤其在表達(dá)受pol II啟動(dòng)子控制的基因的末端。
[0081 ] 表達(dá)系統(tǒng)可包括至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少11種或至少12種表達(dá)構(gòu)建體。
[0082]表達(dá)構(gòu)建體可為載體，如質(zhì)?；蚱渌坞x構(gòu)建體。此類載體通常包括至少一個(gè)細(xì)菌和/或真核的復(fù)制起點(diǎn)。此外，所述載體可包括能在原核和/或真核細(xì)胞中篩選的選擇標(biāo)記。此類選擇標(biāo)記的示例為賦予抗生素抗性的基因，如氨芐青霉素或卡那霉素。所述載體還可包括一個(gè)或多個(gè)多克隆位點(diǎn)以促進(jìn)DNA序列克隆。
[0083]或者，表達(dá)構(gòu)建體可為線性表達(dá)構(gòu)建體。該線性表達(dá)構(gòu)建體通常不含任何擴(kuò)增和/或選擇序列。但是，包含所述擴(kuò)增和/或選擇序列的線性構(gòu)建體也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。參考文獻(xiàn)10描述線性表達(dá)構(gòu)建體，其描述各病毒區(qū)段的獨(dú)立線性表達(dá)構(gòu)建體。也可能在相同線性表達(dá)構(gòu)建體上包含多于一種，例如兩種、三種、四種、五種或六種病毒區(qū)段。例如，參考文獻(xiàn)11中描述了所述系統(tǒng)。
[0084]表達(dá)構(gòu)建體可用本領(lǐng)域已知方法產(chǎn)生。例如,參考文獻(xiàn)12中描述了此類方法。所述表達(dá)構(gòu)建體為線性表達(dá)構(gòu)建體時(shí)，可在引入所述宿主細(xì)胞前利用單個(gè)限制性酶位點(diǎn)使之線性化。或者，可用至少兩種限制性酶位點(diǎn)從載體中切下所述表達(dá)構(gòu)建體。此外，也可通過(guò)用核酸擴(kuò)增技術(shù)(如用PCR)擴(kuò)增獲得線性表達(dá)構(gòu)建體。
[0085]本發(fā)明系統(tǒng)中使用的表達(dá)構(gòu)建體可以是非細(xì)菌表達(dá)構(gòu)建體。這表示所述構(gòu)建體可在真核細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)其內(nèi)所編碼病毒RNA區(qū)段的表達(dá)，但其不包括用于所述構(gòu)建體在細(xì)菌中增殖所需的組分。因此所述構(gòu)建體不含細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori)，且通常不含細(xì)菌選擇標(biāo)記(如抗生素抗性標(biāo)記)。通過(guò)引用納入本文的參考文獻(xiàn)13描述了該表達(dá)構(gòu)建體。[0086]所述表達(dá)構(gòu)建體可通過(guò)化學(xué)合成制備。所述表達(dá)構(gòu)建體可完全或部分通過(guò)化學(xué)合成制備。通過(guò)引用納入本文的參考文獻(xiàn)13中描述了用于通過(guò)化學(xué)合成制備表達(dá)構(gòu)建體的合適方法。
[0087]可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)將本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體引入宿主細(xì)胞。例如，可通過(guò)使用電穿孔、DEAE-右旋糖苷、磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)體、微注射、微粒轟擊將本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體引入宿主細(xì)胞。
[0088]細(xì)胞
[0089]本發(fā)明所用的培養(yǎng)宿主可以是能產(chǎn)生感興趣病毒的任何真核細(xì)胞。本發(fā)明通常使用細(xì)胞系，盡管例如原代細(xì)胞可用作替代細(xì)胞。所述細(xì)胞通常為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。合適的哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括但不限于倉(cāng)鼠、牛、靈長(zhǎng)類(包括人和猴)，以及犬細(xì)胞?？墒褂酶鞣N細(xì)胞類型，例如腎細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞、肺細(xì)胞等。合適倉(cāng)鼠細(xì)胞的例子是名為BHK21或HKCC的細(xì)胞系。合適的猴細(xì)胞例如，非洲綠猴細(xì)胞，如Veix)細(xì)胞系中的腎細(xì)胞[14-16]。合適的犬細(xì)胞為例如腎細(xì)胞，如CLDK和MDCK細(xì)胞系。
[0090]其它合適的細(xì)胞包括但不限于:CH0、293T、BHK、MRC5、PER.C6[17]、FRhL2、W1-38等。合適的細(xì)胞可由各種來(lái)源獲得，例如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC) [18]、Coriell細(xì)胞庫(kù)[19]或歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)。例如，ATCC提供各種不同Vero細(xì)胞，目錄號(hào)為 CCL81、CCL81.2、CRL1586 和 CRL-1587，并提供目錄號(hào)為 CCL34 的 MDCK 細(xì)胞。PER.C6可獲自ECACC，保藏號(hào)為96022940。
[0091]本發(fā)明使用的優(yōu)選細(xì)胞是源自馬達(dá)二氏(Madin Darby)犬腎的MDCK細(xì)胞[20-22]。原始MDCK細(xì)胞可 以CCL34獲自ATCC。優(yōu)選使用MDCK細(xì)胞的衍生細(xì)胞。該衍生物如參考文獻(xiàn)20所述，其公開(kāi)了適合懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞('MDCK33016'或‘33016-PF’，保藏號(hào)DSM ACC2219，也可參見(jiàn)參考文獻(xiàn)20)。此外，參考文獻(xiàn)23公開(kāi)了在無(wú)血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)的MDCK衍生細(xì)胞('B-702/，保藏號(hào)FERM BP-7449)。在一些實(shí)施方式中，所用MDCK細(xì)胞系可為致瘤性的。也考慮使用非致瘤性MDCK細(xì)胞。例如，參考文獻(xiàn)24公開(kāi)了非致瘤性 MDCK 細(xì)胞，包括'MDCK-S' (ATCC PTA-6500)、' MDCK-SF101 ' (ATCCPTA-6501)、' MDCK-SF102' (ATCC PTA-6502)和'MDCK-SF103' (PTA-6503)。參考文獻(xiàn)25公開(kāi)了對(duì)感染有高度易感性的MDCK細(xì)胞，包括‘MDCK.5F1’細(xì)胞(ATCC CRL12042)。
[0092]可使用多于一種細(xì)胞類型的混合物以實(shí)施本發(fā)明的方法。但本發(fā)明的方法優(yōu)選用單一細(xì)胞類型如用單克隆細(xì)胞實(shí)施。本發(fā)明方法所用細(xì)胞優(yōu)選來(lái)自單一細(xì)胞系。此外，同一細(xì)胞系可用于重配所述病毒和所述病毒的任何后續(xù)增殖。
[0093]所述細(xì)胞優(yōu)選在無(wú)血清情況下培養(yǎng)以避免常見(jiàn)污染源。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知用于真核細(xì)胞培養(yǎng)的各種無(wú)血清培養(yǎng)基(如伊可夫氏(Iscove' S)培養(yǎng)基、超CHO培養(yǎng)基(BW公司(BioWhittaker))、EX-CELL (JRH 生物科學(xué)公司(JRH Biosciences)))。此外，可用無(wú)蛋白培養(yǎng)基(如PF-CHO(JRH生物科學(xué)公司))。另外，用于復(fù)制的細(xì)胞也可在常規(guī)含血清培養(yǎng)基中(如含0.5% -10%胎牛血清的MEM或DMEM培養(yǎng)基)培養(yǎng)。
[0094]所述細(xì)胞可貼壁培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)。
[0095]常規(guī)重配
[0096]傳統(tǒng)上，通過(guò)用供體毒株和疫苗毒株共同感染培養(yǎng)宿主(通常是卵)來(lái)重配流感病毒。通過(guò)添加對(duì)所述供體毒株HA和/或NA蛋白特異的抗體來(lái)選擇重配病毒，從而選擇包含所述疫苗毒株的HA和/或NA蛋白的重配病毒。經(jīng)過(guò)該處理的數(shù)次傳代，可以選擇包含所述疫苗毒株HA和/或NA區(qū)段的快速生長(zhǎng)重配病毒。[0097]本發(fā)明適于這些方法中的應(yīng)用。相較于供體毒株，可以更簡(jiǎn)易地使用具有不同HA和/或NA亞型的疫苗毒株，因?yàn)檫@有利于重配病毒的選擇。然而，也可能使用具有相同HA和/或NA亞型的疫苗毒株作為供體毒株，而這在本發(fā)明的一些方面中優(yōu)選。在這種情況下，對(duì)所述供體毒株的HA和/或NA蛋白具有優(yōu)先特異性的抗體應(yīng)該是可獲得的。
[0098]病毒制備
[0099]在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種用于產(chǎn)生流感病毒的方法，所述方法包括以下步驟(a)用本發(fā)明的重配病毒感染培養(yǎng)宿主；(b)培養(yǎng)來(lái)自步驟(a)的宿主以產(chǎn)生所述病毒；和可選地(C)純化步驟(b)中獲得的病毒。
[0100]所述培養(yǎng)宿主可以是細(xì)胞或含胚雞蛋。本發(fā)明此方面中用細(xì)胞作為培養(yǎng)宿主時(shí)，已知細(xì)胞培養(yǎng)條件(如溫度、細(xì)胞密度、pH值等)根據(jù)所用細(xì)胞系和病毒在廣泛范圍內(nèi)變化且可根據(jù)應(yīng)用需求調(diào)整。因此下述信息僅代表指南。
[0101]如上所述，細(xì)胞優(yōu)選在無(wú)血清或無(wú)蛋白的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
[0102]所述細(xì)胞的繁殖可按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行。例如，所述細(xì)胞可在使用常規(guī)支持方法如離心或過(guò)濾的灌注系統(tǒng)中培養(yǎng)。而且，所述細(xì)胞可按照本發(fā)明于感染前在分批進(jìn)料系統(tǒng)中繁殖。在本發(fā)明的內(nèi)容中，培養(yǎng)系統(tǒng)指分批進(jìn)料系統(tǒng)，其中所述細(xì)胞初始培養(yǎng)于分批系統(tǒng)中且通過(guò)控制濃縮營(yíng)養(yǎng)的進(jìn)料來(lái)補(bǔ)償培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物(或部分營(yíng)養(yǎng)物)的消耗。在感染前的細(xì)胞繁殖期間將培養(yǎng)基的pH值值調(diào)節(jié)為pH6.6-pH7.8，特別是pH7.2-pH7.3是有利的。細(xì)胞培養(yǎng)優(yōu)選在30-40°C的溫度進(jìn)行。在培養(yǎng)受感染細(xì)胞(步驟ii)時(shí)，所述細(xì)胞優(yōu)選在30°C -36°C或32°C -34°C或33°C的溫度培養(yǎng)。這是特別優(yōu)選的，因?yàn)橐扬@示在該溫度范圍內(nèi)孵育受感染細(xì)胞能生產(chǎn)配入疫苗時(shí)功效改善的病毒[26]。
[0103]感染前培養(yǎng)中的氧分壓優(yōu)選調(diào)節(jié)為25% -95%且特別為35% -60%的值。本
【發(fā)明內(nèi)容】
中的氧分壓值基于空氣飽和度。在分批系統(tǒng)中細(xì)胞濃度優(yōu)選約8-25xl05細(xì)胞/mL時(shí)或在灌注系統(tǒng)中優(yōu)選約5-20xl06細(xì)胞/mL時(shí)進(jìn)行細(xì)胞感染。所述細(xì)胞可用10_8_10，優(yōu)選0.0001-0.5的病毒劑量(M0I值，“感染復(fù)數(shù)”，對(duì)應(yīng)于感染時(shí)每細(xì)胞的病毒單位數(shù)量)感染。
[0104]可以在貼壁或懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞中培養(yǎng)病毒。可米用微載體培養(yǎng)。在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞可能適合懸浮培養(yǎng)。
[0105]本發(fā)明所述方法還包括收獲和分離病毒或其產(chǎn)生的蛋白。分離病毒或蛋白期間，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法如分離、過(guò)濾或超濾從所述培養(yǎng)基中分離所述細(xì)胞。之后按照本領(lǐng)域技術(shù)人員充分已知的方法如梯度離心、過(guò)濾、沉淀、色譜等濃縮所述病毒或所述蛋白，然后純化。按照本發(fā)明優(yōu)選在純化期間和之后滅活所述病毒?？稍谒黾兓^(guò)程中任何點(diǎn)用例如(6-丙內(nèi)酯或甲醛進(jìn)行病毒滅活。
[0106]所述培養(yǎng)宿主可以是卵。目前疫苗用流感病毒的標(biāo)準(zhǔn)方法采用含胚的SPF雞蛋，由雞蛋內(nèi)容物(尿囊液)純化病毒。也可用蛋傳代病毒并隨后在細(xì)胞培養(yǎng)物中繁殖，反之亦然。
[0107]疫苗
[0108]本發(fā)明使用根據(jù)生產(chǎn)疫苗的方法產(chǎn)生的病毒。
[0109]疫苗(特別是流感病毒)通?；诨畈《净驕缁畈《尽缁钜呙缈苫谌《绢w粒、‘裂解’病毒顆?；蚧诩兓谋砻婵乖??？乖部梢圆《倔w形式存在?？墒褂帽景l(fā)明制造任意這些類型的疫苗。
[0110]采用滅活病毒時(shí)，所述疫苗可包含全病毒顆粒、裂解病毒顆?；蚣兓谋砻婵乖?對(duì)于流感，包括血凝素，通常也包括神經(jīng)氨酸酶)。滅活病毒的化學(xué)方法包括用有效量的以下一種或多種試劑處理:去污劑、甲醛、(6-丙內(nèi)酯、亞甲基藍(lán)、亞甲藍(lán)、補(bǔ)骨脂素、羧基富勒烯(C60)、二元乙胺、乙?；蚁﹣啺坊蚱浣M合。本領(lǐng)域已知病毒滅活的非化學(xué)方法，例如UV射線或Y射線輻射。
[0111]可通過(guò)各種方法由含病毒液體如尿囊液或細(xì)胞培養(yǎng)物上清收獲病毒顆粒。例如，純化方法可包括用含有去污劑以破壞病毒顆粒的線性蔗糖梯度溶液進(jìn)行區(qū)帶離心。任選稀釋后，可通過(guò)滲濾純化抗原。
[0112]用去污劑(如乙醚、聚山梨醇酯80、脫氧膽酸鹽、三正丁基磷酸鹽、曲通(Triton)X100、曲通N101、溴化十六烷基三甲銨、特吉托NP9等)處理純化的病毒顆粒以獲得裂解病毒顆粒，從而產(chǎn)生亞病毒顆粒制品，包括‘吐溫-醚’裂解方法。裂解流感病毒的方法為本領(lǐng)域熟知，例如參見(jiàn)參考文獻(xiàn)27-32等。一般使用破壞濃度的裂解劑破壞或片段化全病毒來(lái)裂解所述病毒，無(wú)論該病毒有無(wú)感染性。這種破壞導(dǎo)致病毒蛋白的完全或部分溶解，改變病毒的完整性。優(yōu)選的裂解劑是非離子型和離子型(例如陽(yáng)離子)表面活性劑，如烷基糖苷、烷基硫苷、?；恰⒒腔鸩藟A、甜菜堿、聚氧乙烯烷基醚、N，N- 二烷基-葡糖酰胺、6-0- (N-庚甲酰)-甲基-a -D-葡萄糖苷(Hecameg)、烷基苯氧基-聚乙氧基乙醇、NP9、季銨化合物、肌氨酰、CTAB(溴化十六烷基三甲銨)、三正丁基磷酸酯、塞弗倫(Cetavlon)、十四烷基三甲銨鹽、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(Iipofectamine)和D0T-MA、辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(如曲通表面活性劑，如曲通XlOO或曲通NlO I)、聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(吐溫表面活性劑)、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯酯等。一種有用的裂解方法利用脫氧膽酸鈉和甲醛的連續(xù)作用，并且裂解可在病毒顆粒初始純化期間(例如在蔗糖密度梯度溶液中)進(jìn)行。因此，裂解過(guò)程可包括:澄清含病毒顆粒的材料(以去除非病毒顆粒物質(zhì))，濃縮收獲的病毒顆粒(例如使用吸附方法，如CaHPO4吸附)，分離全病毒顆粒與非病毒顆粒材料，用裂解劑在密度梯度離心步驟中裂解病毒顆粒(例如，用含有裂解劑如脫氧膽酸鈉的蔗糖梯度)，然后過(guò)濾(例如超濾)以去除不需要的物質(zhì)?？蓪⒘呀獠《绢w粒重懸于磷酸鈉緩沖的等滲氯化鈉溶液中。裂解流感疫苗的示例有BEGRIVACTM、FLUARIXTM、FLUZONE?和FLUSHIELD?產(chǎn)品。
[0113]純化的流感病毒表面抗原疫苗包含表面抗原血凝素，一般還包含神經(jīng)氨酸酶。制備這些蛋白質(zhì)純化形式的方法是本領(lǐng)域熟知的。fluvirin?、AgrippAlts^p influvac?產(chǎn)品是流感亞基疫苗。另一種形式的滅活抗原是病毒體[33](不含核酸的病毒樣脂質(zhì)體顆粒)。病毒體可通過(guò)用去污劑溶解病毒，然后去除核衣殼和重建含病毒糖蛋白的膜來(lái)制備。另一種制備病毒體的方法包括將病毒膜糖蛋白加入過(guò)量磷脂中，得到膜中具有病毒蛋白質(zhì)的脂質(zhì)體。
[0114]本發(fā)明的方法也可用于生產(chǎn)活疫苗。此類疫苗通常通過(guò)從含病毒顆粒的液體中純化病毒顆粒來(lái)制備。例如，所述液體可通過(guò)離心澄清并用緩沖液(例如含蔗糖、磷酸鉀和谷氨酸單鈉)穩(wěn)定。目前可以獲得各種形式的流感病毒疫苗(例如參見(jiàn)參考文獻(xiàn)34的第17和18章)?；畈《疽呙绨ㄡt(yī)學(xué)免疫公司(MedImmune)的FLUMIST?產(chǎn)品(三價(jià)活病毒疫苗)。
[0115]所述病毒可減毒。所述病毒可為溫度敏感型。所述病毒可為冷適應(yīng)性病毒。使用活病毒作為抗原時(shí)這三種特征特別有用。
[0116]HA是現(xiàn)有滅活流感疫苗中的主要免疫原，且參照一般由SRID測(cè)定的HA水平來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化疫苗劑量?，F(xiàn)有的疫苗一般含有約15 ygHA/毒株，但也可使用更低的劑量，例如兒童或大流行情況下，或者是使用佐劑時(shí)。分?jǐn)?shù)劑量如％ (即7.5i!gHA/毒株)、i/4和V8已有應(yīng)用，更高劑量也有應(yīng)用(如3x或9x劑量[35，36])。因此，疫苗可包含0.1-150 y gHA/流感毒株，優(yōu)選 0.l_50iig，例如 0.l-20iig、0.l-15iig、0.l-10iig、0.1-7.5u g,0.5_5iig 等。具體劑量包括例如，約45、約30、約15、約10、約7.5、約5、約3.8、約3.75、約1.9、約1.5等/株。
[0117]對(duì)于活疫苗，利用組織培養(yǎng)感染劑量中值(TCID5tl)而非HA含量來(lái)衡量劑量，且TCID50—般為 IO6-1O8 (優(yōu)選為 IO6 5-1O7'5)/株。
[0118]本發(fā)明所用的流感株可以具有野生型病毒中的天然HA，或具有修飾HA。例如，已知修飾HA以去除使病毒在禽類物種中具有高致病性的決定簇(如HA1/HA2切割位點(diǎn)周圍的超堿性區(qū)域(hyper-basic region))。采用反向遺傳學(xué)促進(jìn)這類修飾。
[0119]除了適于針對(duì)大流行間期株系的免疫，本發(fā)明組合物特別用于免疫抵御大流行或潛在大流行株系。本發(fā) 明適于給人類以及非人動(dòng)物接種疫苗。
[0120]其抗原可有用地包含在所述組合物中的其它株系是對(duì)抗病毒治療有抗性(例如對(duì)奧塞米韋[37]和/或扎那米韋有抗性)的毒株，包括抗性大流行株系[38]。
[0121]本發(fā)明的組合物可包含來(lái)自一種或多種(如1、2、3、4或更多)流感病毒株的抗原，包括甲型流感病毒和/或乙型流感病毒，前題是至少一種流感病毒是本發(fā)明的重配流感病毒。也考慮其中至少兩種、至少三種或所有抗原來(lái)自本發(fā)明重配流感病毒的組合物。疫苗包含一種以上流感毒株時(shí)，一般單獨(dú)培養(yǎng)不同毒株，并在收獲病毒和制備抗原后將它們混合在一起。因此，本發(fā)明方法可包括混合一種以上流感毒株的抗原的步驟。三價(jià)疫苗是典型的，其包含來(lái)自兩種甲型流感病毒株和一種乙型流感病毒株的抗原。也可用四價(jià)疫苗[39]，其包含來(lái)自2種甲型流感病毒毒株和2種乙型流感病毒毒株、或者3種甲型流感病毒毒株和I種乙型流感病毒毒株的抗原。
[0122]藥物組合物
[0123]如本發(fā)明所述制備的疫苗組合物是藥學(xué)上可接受的。它們通常還包含抗原外的其它組分，例如它們一般包含一種或多種藥物載體和/或賦形劑。如下所述，也可包含佐劑。對(duì)這類組分的充分討論參見(jiàn)參考文獻(xiàn)40。
[0124]疫苗組合物通常是水性形式。然而，一些疫苗可為干燥形式，如可注射固體或貼片上的干燥或聚合制品的形式。
[0125]疫苗組合物可含有防腐劑，如硫柳汞或2-苯氧乙醇。然而，疫苗優(yōu)選應(yīng)基本不含(即小于5i!g/ml)含汞物質(zhì)，如不含硫柳汞[31，41]。更優(yōu)選無(wú)汞的疫苗。可包含a-生育酚琥珀酸酯以替代含汞化合物[31]。特別優(yōu)選不含防腐劑的疫苗。
[0126]為了控制張度，優(yōu)選包含生理鹽如鈉鹽。優(yōu)選氯化鈉(NaCl)，其可以l_20mg/ml存在?？纱嬖诘钠渌}包括氯化鉀、磷酸二氫鉀、無(wú)水磷酸氫二鈉、氯化鎂、氯化鈣等。
[0127]疫苗組合物的滲透壓通常為200m0sm/kg-400m0sm/kg,優(yōu)選240-360m0sm/kg,更優(yōu)選290-310m0sm/kg范圍。雖然以前報(bào)道過(guò)滲透壓對(duì)疫苗接種引起的疼痛無(wú)影響[42]，但仍優(yōu)選將滲透壓保持在此范圍內(nèi)。
[0128]疫苗組合物可含有一種或多種緩沖劑。典型的緩沖劑包括:磷酸鹽緩沖液；Tris緩沖劑；硼酸鹽緩沖劑；琥珀酸鹽緩沖劑；組氨酸緩沖劑(具體是有氫氧化鋁佐劑)；或檸檬酸鹽緩沖劑。包含的緩沖液一般是5-20mM。
[0129]疫苗組合物的pH通常為5.0-8.1，更典型為6.0-8.0，例如6.5-7.5，或者
7.0-7.8。因此，本發(fā)明方法可包括在包裝前調(diào)整散裝疫苗pH的步驟。
[0130]所述疫苗組合物優(yōu)選無(wú)菌。所述疫苗組合物優(yōu)選無(wú)熱原，如每劑量含有< 1EU(內(nèi)毒素單位，標(biāo)準(zhǔn)量度)，優(yōu)選每劑量< 0.1EU0所述疫苗組合物優(yōu)選不含谷蛋白。
[0131]本發(fā)明疫苗組合物可包含去污劑，如聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性劑(稱為‘吐溫’)、辛苯聚醇(如辛苯聚醇_9(曲通X100)或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)、溴化十六烷基三甲銨(‘CTAB’ )或脫氧膽酸鈉，特別是用于裂解疫苗或表面抗原疫苗。去污劑可僅以痕量存在。因此，疫苗可包含各小于lmg/ml的辛苯聚醇-10和聚山梨醇酯80。其它痕量殘留組分可以是抗生素(如新霉素、卡那霉素、多粘菌素B)。
[0132]疫苗組合物可含有一次免疫的物質(zhì)，或者可含有多次免疫的物質(zhì)(即‘多劑量’藥盒)。多劑量配置優(yōu)選含有防腐劑。作為多劑量組合物中包含防腐劑的替代方案(或補(bǔ)充方案)，所述組合物可包含在裝有無(wú)菌接頭以取出物質(zhì)的容器中。
[0133]流感疫苗的給藥劑量體積一般為約0.5ml，但可將一半劑量(即約0.25ml)給予兒里。
[0134]組合物和藥盒優(yōu)選儲(chǔ)存于2°C -8°C。其不應(yīng)冷凍。理想上應(yīng)避直射光保存。
[0135]宿主細(xì)胞DNA
[0136]由細(xì)胞系分離和/或培養(yǎng)病毒時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)實(shí)踐是使最終疫苗中殘留的細(xì)胞系DNA含量最小化，以盡可能減少該DNA的潛在致癌活性。
[0137]因此，按照本發(fā)明制備的疫苗組合物優(yōu)選含有每劑量低于IOng(優(yōu)選低于lng，更優(yōu)選低于IOOpg)的殘留宿主細(xì)胞DNA，但可能存在痕量宿主細(xì)胞DNA。
[0138]任何殘留宿主細(xì)胞DNA的平均長(zhǎng)度優(yōu)選小于500bp，例如小于400bp、小于300bp、小于200bp、小于IOObp等。
[0139]在疫苗制備過(guò)程中可采用標(biāo)準(zhǔn)純化方法，如色譜法等去除污染的DNA。可通過(guò)核酸酶處理，例如DNA酶處理來(lái)提高對(duì)殘留宿主細(xì)胞DNA的移除。參考文獻(xiàn)43和44公開(kāi)了一種減少宿主細(xì)胞DNA污染的便捷方法，該方法包括兩步處理，先使用DNA酶(如Benzonase (核酸酶))處理，這可以在病毒生長(zhǎng)過(guò)程中使用，然后使用陽(yáng)離子去污劑(如CTAB)處理，這可以在病毒顆粒破壞過(guò)程中使用。也可利用烷化劑如(6-丙內(nèi)酯處理來(lái)去除宿主細(xì)胞DNA，其也宜用于滅活病毒顆粒[45]。
[0140]佐劑
[0141]本發(fā)明組合物宜包含佐劑，其作用是增強(qiáng)在接受組合物的患者中引起的免疫應(yīng)答(體液免疫和/或細(xì)胞免疫)。優(yōu)選的佐劑包含水包油乳液。已知各種這類乳液，其通常包含至少一種油和至少一種表面活性劑，所述油和表面活性劑是生物可降解(可代謝)和生物相容的。乳劑中的油滴直徑通常小于5 u m,理想情況下具有亞微米直徑，通過(guò)微流化床實(shí)現(xiàn)這種小尺寸以提供穩(wěn)定乳劑。優(yōu)選尺寸小于220nm的液滴，因?yàn)槠淇蛇M(jìn)行過(guò)濾滅菌。[0142]所述乳液可以包含如動(dòng)物(如魚)或植物來(lái)源的油。植物油的來(lái)源包括堅(jiān)果、種籽和谷物。最常見(jiàn)的花生油、大豆油、椰子油和橄欖油是堅(jiān)果油的示例。可以使用例如獲自霍霍巴豆的霍霍巴油。種籽油包括紅花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物油中，最常見(jiàn)的是玉米油，但也可以使用其它谷類的油，如小麥、燕麥、黑麥、稻、畫眉草、黑小麥等。甘油和1，2_丙二醇的6-10碳脂肪酸酯雖然不是天然存在于種籽油中，但可從堅(jiān)果和種籽油開(kāi)始，通過(guò)水解、分離和酯化合適物質(zhì)制備。來(lái)自哺乳動(dòng)物乳汁的脂肪和油類是可代謝的，因此可以用于實(shí)施本發(fā)明。獲得動(dòng)物來(lái)源純油所必需的分離、純化、皂化和其它方法的過(guò)程為本領(lǐng)域熟知。大多數(shù)魚類含有容易回收的可代謝油。例如，鱈魚肝油、鯊魚肝油和諸如鯨蠟的鯨油是本文可使用的幾種魚油的示例。通過(guò)生化途徑用5-碳異戊二烯單位合成許多支鏈油，其總稱為萜類。鯊魚肝油含有稱為角鯊烯的支鏈不飽和萜類化合物，2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22- 二十四碳六烯，其為本文特別優(yōu)選。角鯊烯的飽和類似物角鯊?fù)橐彩莾?yōu)選的油。包括鯊烯和鯊?fù)樵趦?nèi)的魚油易于從市售來(lái)源獲得，或可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法獲得。其他優(yōu)選的油為a-生育酚(如下)。
[0143]可以使用油的混合物。
[0144]表面活性劑可以按其‘HLB’ (親水/親脂平衡)分類。本發(fā)明優(yōu)選的表面活性劑的HLB為至少10，優(yōu)選至少15，更優(yōu)選至少16。可以與本發(fā)明一起使用的表面活性劑包括但不限于:聚氧乙烯脫水 山梨糖醇酯表面活性劑(通常稱為吐溫)，特別是聚山梨酯20和聚山梨酯80 ;以商品名D0WFAX?出售的環(huán)氧乙烷(EO)、環(huán)氧丙烷(PO)和/或環(huán)氧丁烷(BO)的共聚物，如直鏈EP/P0嵌段共聚物；重復(fù)的乙氧基(氧-1，2-乙二基)數(shù)量不同的辛苯聚醇，特別感興趣的是辛苯聚醇9 (曲通(Triton) X-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40);磷脂，如磷脂酰膽堿(卵磷脂)；壬酚乙醇酯，如Tergitol? NP系列；衍生自月桂醇、鯨蠟醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(稱為芐澤(Brij)表面活性劑)，如三甘醇單月桂基醚(芐澤30);以及脫水山梨糖醇酯(通常稱為司盤(SPAN))，如脫水山梨糖醇三油酸酯(司盤85)和脫水山梨糖醇單月桂酸酯。優(yōu)選非離子型表面活性劑。乳液中包含的表面活性劑優(yōu)選吐溫80 (聚氧乙烯去水山梨糖醇單油酸酯)、司盤85 (去水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X-100。
[0145]可使用表面活性劑的混合物，如吐溫80/司盤85混合物。聚氧乙烯去水山梨糖醇酯如聚氧乙烯去水山梨糖醇單油酸酯(吐溫80)和辛苯聚醇如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(曲通X-100)的組合也適合。另一種有用的組合包含月桂醇聚醚-9加聚氧乙烯去水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。
[0146]優(yōu)選的表面活性劑含量(重量％ )為:聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(如吐溫80) 0.01-1%,特別是約0.1 %;辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(如曲通X-100或曲通系列的其它去污劑)0.001-0.1%，特別是0.005-0.02%;聚氧乙烯醚(如月桂醇聚醚9)0.1-20%,優(yōu)選0.1-10%，特別是0.1-1%或約0.5%。
[0147]所述疫苗含裂解病毒時(shí)，優(yōu)選在水相中含有游離的表面活性劑。這是有利的，因?yàn)橛坞x表面活性劑可在所述抗原上產(chǎn)生‘裂解效果’，因此破壞否則可能存在的任何未裂解病毒顆粒和/或病毒顆粒聚集體。這可改善裂解病毒疫苗的安全性[46]。
[0148]乳液優(yōu)選平均液滴大小為< I ii m,例如< 750nm、^ 500nm> ^ 400nm> ^ 300nm、(250nm、；^ 220nm>^ 200nm或更小。可通過(guò)某些技術(shù)如微流化等方便地獲得這些液滴尺寸。
[0149] 本發(fā)明所用的具體水包油乳液佐劑包括但不限于:
[0150]?藍(lán)烯、吐溫80 (Tween80)和司盤(Span)85的亞微米乳液。所述乳液的體積組成可以是約5%鯊烯、約0.5%聚山梨酯80和約0.5%司盤85。以重量計(jì)，這些比例為4.3%鯊烯、0.5%聚山梨酯80和0.48%司盤85。這種佐劑稱為‘MF59’ [47-49]，參考文獻(xiàn)50的第10章和參考文獻(xiàn)51的第12章有更詳細(xì)的描述。所述MF59乳液宜包含檸檬酸根離子，例如IOmM檸檬酸鈉緩沖液。
[0151]?包含鯊烯、a -生育酚和聚山梨酯80的乳液。所述乳液可包含磷酸鹽緩沖鹽水。這些乳液體積上可含有2-10%鯊烯、2-10%生育酚和0.3-3%聚山梨酯80，鯊烯:生育酚的重量比優(yōu)選< I (例如0.90)，因?yàn)檫@能提供更穩(wěn)定的乳液。鯊烯和聚山梨酯80存在的體積比可以約為5: 2，或者重量比約為11: 5。因此這三種組分(鯊烯、生育酚、聚山梨酯80)可以1068: 1186: 485或約55: 61: 25的重量比存在?？赏ㄟ^(guò)以下方法制備一種這樣的乳液(‘AS03’):將吐溫80溶解于PBS產(chǎn)生2%溶液，然后將90ml該溶液與5gDL-a-生育酚和5ml角鯊烯的混合物混合，然后使該混合物微流體化。得到的乳液可含有如平均直徑為100-250nm，優(yōu)選約180nm的亞微米油滴。該乳液也可含有3-脫-0-?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)A(3d-MPL)。此種類型的另一有用乳液可包含(每人劑量)0.5-10mg鯊烯、0.5-1 Img生育酚和0.l-4mg聚山梨酯80 [52]，例如，采用上述比例。
[0152]?鯊烯、生育酚和曲通去污劑(如曲通X-100)的乳液。該乳液也可包含3d_MPL (見(jiàn)下)。所述乳液可包含磷酸鹽緩沖液。
[0153]?含有聚山梨酯(如聚山梨酯80)、曲通去污劑(如曲通X-100)和生育酚(如琥珀酸a-生育酚)的乳液。該乳液可包含這三種組分，其質(zhì)量比約為75: 11: 10 750 Ug/ml聚山梨酯80、I IOii g/ml曲通X-100和100 y g/ml琥珀酸a -生育酚)，且這些濃度應(yīng)包括抗原中這些組分的任何貢獻(xiàn)。所述乳液還可包含鯊烯。該乳液也可包含3d-MPL(見(jiàn)下)。所述水相可包含磷酸鹽緩沖液。
[0154]?鯊?fù)?、聚山梨?0和泊洛沙姆401(“普流羅尼克?L121”(" PluronicTML121"))的乳液。所述乳液可用PH7.4的磷酸鹽緩沖鹽水配制。該乳液是一種有用的胞壁酰二肽遞送載體，已與含蘇氨酰基-MDP的“SAF-1”佐劑[53] (0.05_1 % Thr_MDP、5%鯊烯、2.5%普流羅尼克(Pluronic)L121和0.2%聚山梨酸酯80) —起使用。也可不與Thr-MDP—起使用，例如用“AF”佐劑(5%鯊烯、1.25%普流羅尼克L121和0.2%聚山梨酸酯80) [54]。優(yōu)選微流體化。
[0155]?含有鯊烯、水性溶劑、聚氧乙烯烷基醚親水性非離子型表面活性劑(如聚氧乙烯
(12)十六十八醚)和疏水性非離子型表面活性劑(如去水山梨糖醇酯或二縮甘露醇酯，如去水山梨糖醇單油酸酯或‘司盤80’)的乳液。該乳劑優(yōu)選為熱可逆的和/或其中至少90%油滴(以體積計(jì))尺寸小于200nm[55]。該乳液也可含有一種或多種以下物質(zhì):糖醇；低溫保護(hù)劑(例如，糖，如十二烷基麥芽苷和/或蔗糖)；和/或烷基糖苷。該乳液可包含TLR4激動(dòng)劑[56]。這類乳液可凍干。
[0156]?角鯊烯、泊洛沙姆-105和Abil-Care的乳液[57]。含佐劑疫苗中這些組分的終濃度(重量)是5%鯊烯、4%泊洛沙姆-105(普流羅尼多元醇)和2%Abil-Care85(雙-PEG/PPG-16/16PEG/PPG-16/16 二甲硅油；辛酸/癸酸甘油三酯)。[0157]?含有0.5-50%油、0.1-10%磷脂和0.05-5%非離子型表面活性劑的乳液。如參考文獻(xiàn)58所述，優(yōu)選的磷脂組分是磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。優(yōu)選亞微米液滴尺寸。
[0158]?不可代謝油(如輕質(zhì)礦物油)和至少一種表面活性劑(如卵磷脂、吐溫80或司盤80)的亞微米水包油乳液。可包含添加劑，例如QuilA皂苷、膽固醇、皂苷-親脂體偶聯(lián)物(如通過(guò)葡糖醛酸的羧基將脂族胺加到脫?；碥丈隙a(chǎn)生的GP1-0100，如參考文獻(xiàn)59所述)、二甲基二-十八烷基溴化銨和/或N，N-二-十八烷基-N，N-雙(2-羥乙基)丙二胺。
[0159]?皂苷(如QuilA或QS21)和固醇(如膽固醇)結(jié)合成螺旋膠束的乳液[60]。
[0160]?包含礦物油、非離子親脂性乙氧基化脂肪醇和非離子親水性表面活性劑(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[61]。
[0161]?包含礦物油、非離子親脂水性乙氧基化脂肪醇和非離子親脂性表面活性劑(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[61]。
[0162]在一些實(shí)施方式中，可在遞送時(shí)臨時(shí)將乳液與抗原混合，因此所述佐劑和抗原可單獨(dú)地保存在包裝或分銷的疫苗中，以便在使用時(shí)配制成最終制劑。在其它實(shí)施方式中，在生產(chǎn)過(guò)程中將乳液與抗原混合，因此所述組合物以液體含佐劑形式包裝。所述抗原通常是水性形式,從而最終通過(guò)混合兩種液體制備疫苗。所述兩種液體的混合體積比可變(例如5:1-1: 5)，但通常約為1:1。組分濃度在上述具體乳液說(shuō)明中給出時(shí)，這些濃度通常用于非稀釋組合物，因此所述濃度在混合抗原溶液后會(huì)降低。
[0163]包裝疫苗組合物
[0164]適用于本發(fā)明組合物(或藥盒組分)的容器包括藥瓶、注射器(如一次性注射器)、鼻噴霧等。這些容器應(yīng)無(wú)菌。
[0165]組合物/組分裝在藥瓶中時(shí)，藥瓶?jī)?yōu)選由玻璃或塑料材料制成。在將組合物加入藥瓶之前，優(yōu)選對(duì)其進(jìn)行滅菌。為了避免膠乳過(guò)敏患者的問(wèn)題，藥瓶?jī)?yōu)選用無(wú)膠乳塞子密封，且優(yōu)選所有包裝材料均不含膠乳。所述藥瓶可包含單一劑量的疫苗，或者可以包含一個(gè)以上劑量(‘多劑量’藥瓶)，如10個(gè)劑量。藥瓶?jī)?yōu)選由無(wú)色玻璃制成。
[0166]藥瓶可以有適合的帽(如魯爾(Luer)鎖)，從而預(yù)填裝注射器可插入該帽，可以將注射器的內(nèi)容物推入藥瓶(如在其中復(fù)溶凍干物質(zhì))，并可以將藥瓶的內(nèi)容物移回注射器中。從藥瓶中移出注射器后，可連上針頭，將該組合物給予患者。該帽優(yōu)選位于封口或蓋子內(nèi)側(cè)，以便在封口或蓋子移除后才能接觸到該帽。藥瓶，特別是多劑量藥瓶可裝有允許無(wú)菌取出其內(nèi)含物的瓶帽。
[0167]將某一組分包裝到注射器中時(shí)，該注射器可連有針頭。如果未連接針頭，可隨注射器提供單獨(dú)的針頭以便組裝和使用。這種針頭可裝在護(hù)罩中。優(yōu)選安全性針頭。一般是1-英寸23號(hào)、1-英寸25號(hào)和5/8-英寸25號(hào)針頭?？商峁┯袆冸x標(biāo)簽的注射器，該標(biāo)簽上可打印上內(nèi)含物的批號(hào)、流感季節(jié)和過(guò)期日期，以幫助記錄保存。注射器的活塞優(yōu)選帶有防脫裝置，以防止活塞在吸出時(shí)偶然脫出。注射器可以有膠乳橡膠帽和/或活塞。一次性注射器含有單一劑量的疫苗。注射器通常帶有頂帽，以在連接針頭前密封頂端，所述頂帽優(yōu)選由丁基橡膠制成。如果注射器和針頭分開(kāi)包裝，則針頭優(yōu)選裝有丁基橡膠護(hù)罩。優(yōu)選的注射器是以商品名“Tip-Lok”?銷售的注射器。[0168]容器可標(biāo)注顯示半劑量體積，例如以利于遞送給兒童。例如，含有0.5ml劑量的注射器可有顯示0.25ml體積的標(biāo)記。
[0169]采用玻璃容器(如注射器或藥瓶)時(shí)，優(yōu)選采用由硼硅酸鹽玻璃，而非鈉鈣玻璃制成的容器。
[0170]可將藥盒或組合物與宣傳頁(yè)包裝在一起(在同一個(gè)盒子中)，所述宣傳頁(yè)包括疫苗的詳細(xì)情況如給藥說(shuō)明書、疫苗內(nèi)所含抗原的詳情等。說(shuō)明書也可包含警告，例如準(zhǔn)備好腎上腺素溶液以防疫苗接種后發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)等。
[0171]治療方法和所述疫苗給予
[0172]本發(fā)明提供按本發(fā)明制備的疫苗。這些疫苗組合物適合給予人類或非人動(dòng)物對(duì)象如豬或鳥(niǎo)類，且本發(fā)明提供了引起對(duì)象免疫應(yīng)答的方法，該方法包括將本發(fā)明組合物給予所述對(duì)象的步驟。本發(fā)明還提供用作藥物的本發(fā)明組合物，并提供本發(fā)明組合物在生產(chǎn)引起對(duì)象免疫應(yīng)答的藥物中的應(yīng)用。
[0173]這些方法和應(yīng)用引起的免疫應(yīng)答通常包括抗體應(yīng)答，優(yōu)選保護(hù)性抗體應(yīng)答。評(píng)價(jià)接種流感病毒疫苗后抗體應(yīng)答、中和能力和保護(hù)水平的方法為本領(lǐng)域熟知。人類研究表明，對(duì)人流感病毒血凝素的抗體效價(jià)與保護(hù)作用相關(guān)聯(lián)(約30-40的血清樣品血凝反應(yīng)-抑制效價(jià)產(chǎn)生對(duì)同源病毒感染約50%的保護(hù)作用)[62]。一般通過(guò)血凝反應(yīng)抑制、微量中和、單徑向免疫擴(kuò)散(SRID)和/或單徑向溶血(SRH)來(lái)測(cè)定抗體應(yīng)答。本領(lǐng)域熟知這些測(cè)定技術(shù)。
[0174]可以各種方式給予本發(fā)明組合物。最優(yōu)選的免疫途徑是肌肉內(nèi)注射(如注入上肢或下肢)，但其它可用的途徑包括皮下注射、鼻內(nèi)[63-65]、口服[66]皮內(nèi)[67，68]、經(jīng)皮、透皮[69]等。
[0175]可用根據(jù)本發(fā)明制備的疫苗治療兒童和成年人。目前，推薦將流感疫苗用于年齡大于6個(gè)月的兒童和成年人免疫。因此，人類對(duì)象可以小于I歲、1-5歲、5-15歲、15-55歲或至少55歲。接受該疫苗的優(yōu)選對(duì)象是老年人(例如> 50歲、> 60歲，優(yōu)選> 65歲)、年輕人(如<5歲)、住院對(duì)象、健康護(hù)理工作人員、軍隊(duì)服務(wù)人員和軍人、妊娠婦女、慢性疾病對(duì)象、免疫缺陷對(duì)象、在接受該疫苗前7天接受過(guò)抗病毒化合物(如奧塞米韋或扎那米韋化合物；見(jiàn)下)的對(duì)象、對(duì)雞蛋過(guò)敏的人和出國(guó)旅行者。然而所述疫苗不僅適用于這些人群，還可用于更廣泛的群體。對(duì)于大流行毒株，優(yōu)選給予所有年齡組。
[0176]本發(fā)明優(yōu)選組合物滿足1、2或3個(gè)CPMP功效標(biāo)準(zhǔn)。在成年人(18-60歲)中，這些標(biāo)準(zhǔn)是:⑴≥70%血清保護(hù)；⑵≥40%血清轉(zhuǎn)化；和/或(3) GMT增加≥2.5倍。在老年人(>60歲)中，這些標(biāo)準(zhǔn)是:(1)≥60%血清保護(hù)；(2)≥30%血清轉(zhuǎn)化；和/或(3)GMT增加≥2倍。這些標(biāo)準(zhǔn)基于至少50位患者的開(kāi)放標(biāo)記研究。
[0177]可通過(guò)單劑量方案或多劑量方案進(jìn)行治療。多劑量可以用于初次免疫方案和/或加強(qiáng)免疫方案。在多劑量方案中，可通過(guò)相同或不同的途徑如胃腸道外初次、粘膜加強(qiáng)，粘膜初次、胃腸道外加強(qiáng)等給予多個(gè)劑量。給予一個(gè)以上劑量(一般是兩個(gè)劑量)特別用于免疫未曾免疫接觸的患者，例如從未接受過(guò)流感疫苗的人，或者用于免疫接種抵御新的HA亞型(如大流行爆發(fā)中的亞型)。一般以至少I周(例如約2周、約3周、約4周、約6周、約8周、約10周、約12周、 約16周等)的間隔給予多個(gè)劑量。
[0178]可將本發(fā)明產(chǎn)生的疫苗與其它疫苗基本上同時(shí)(在健康護(hù)理專業(yè)人員或疫苗接種中心的同一用藥咨詢或就診期間)給予患者，例如與麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、風(fēng)疹疫苗、MMR疫苗、水痘疫苗、MMRV疫苗、白喉疫苗、破傷風(fēng)疫苗、百日咳疫苗、DTP疫苗、偶聯(lián)的B型流感嗜血桿菌(H.1nfluenzae)疫苗、脊髓灰質(zhì)炎病毒滅活疫苗、乙型肝炎病毒疫苗、腦膜炎球菌偶聯(lián)疫苗(如四價(jià)A-C-W135-Y疫苗)、呼吸道合胞病毒疫苗、肺炎球菌偶聯(lián)疫苗等基本同時(shí)給藥。在老年患者中特別有用的是與肺炎球菌疫苗和/或腦膜炎球菌疫苗基本同時(shí)給藥。
[0179]相似地，可將本發(fā)明疫苗與抗病毒化合物，具體是對(duì)流感病毒有活性的抗病毒化合物(如奧塞米韋和/或扎那米韋)基本上同時(shí)給予患者(在對(duì)健康護(hù)理專業(yè)人員進(jìn)行的同一用藥咨詢或就診期間)。這些抗病毒化合物包括神經(jīng)氨酸酶抑制劑，如(3R，4R，5S)-4-乙?；被?5-氨基-3(1-乙基丙氧基)-1_環(huán)己烯-1-羧酸或5-(乙?；被?-4_[(氨基亞氨基甲基)_氨基]-2，6-脫水-3，4，5-三脫氧-D-甘油-D-半乳糖壬-2-烯酮酸，包括其酯(如乙酯)和其鹽(如磷酸鹽)。優(yōu)選的抗病毒物是(3R，4R，5S)-4-乙?；被?5-氨基-3(1-乙基丙氧基)-1_環(huán)己烯-1-羧酸，乙酯和磷酸鹽(I: I)，也稱為磷酸奧塞米韋(達(dá)菲(TAMIFLU) ?)。
[0180]概述
[0181]術(shù)語(yǔ)“包含”涵蓋“包括”以及“由…組成”，例如，“包含”X的組合物可以僅由X組成或可以包括其它物質(zhì)，例如X+Y。
[0182]術(shù)語(yǔ)“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的組合物可能完全不含Y。如有需要，“基本上” 一詞可以從本發(fā)明的定義中省略。
[0183]與數(shù)值X相關(guān)的術(shù)語(yǔ)“約”是任選的并表示例如x± 10%。
[0184]除非另有明確說(shuō)明，包括混合兩種或多種組分的步驟的工藝不要求任何特定的混合順序。因此，組分可以任何`順序混合。在有三種組分時(shí)，可將兩種組分相互合并，然后可將所述組合與第三種組分混合等。
[0185]本方法的各步驟可在相同或不同時(shí)間、相同或不同地理位置如國(guó)家以及由相同或不同人或?qū)嶓w進(jìn)行。
[0186]將動(dòng)物(且特別是牛)材料用于培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，其應(yīng)獲自未患傳染性海綿狀腦病(TSE)，特別是未患牛海綿狀腦病(BSE)的來(lái)源?？傊?，優(yōu)選在完全不含動(dòng)物來(lái)源物質(zhì)的條件下培養(yǎng)細(xì)胞。
[0187]將化合物作為組合物的一部分給予機(jī)體時(shí)，該化合物可另外由合適的前藥替代。
[0188]兩個(gè)氨基酸序列間的序列相同性百分?jǐn)?shù)表示進(jìn)行比對(duì)時(shí)所比較的兩條序列中相同氨基酸的百分?jǐn)?shù)。利用本領(lǐng)域所知軟件程序，例如參考文獻(xiàn)70的7.7.18部分所描述的軟件程序，可進(jìn)行比對(duì)并確定同源性百分?jǐn)?shù)或序列相同性百分?jǐn)?shù)。優(yōu)選的比對(duì)通過(guò)史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)同源性搜索算法使用仿射缺口搜索確定,其中缺口開(kāi)放罰12分，缺口延伸罰2分，BLOSUM矩陣計(jì)62分。參考文獻(xiàn)71中公開(kāi)了史密斯-沃特曼同源性搜索算法。
[0189]兩個(gè)核酸序列間的序列相同性百分?jǐn)?shù)表示進(jìn)行比對(duì)時(shí)所比較的兩條序列中相同堿基的百分?jǐn)?shù)。利用本領(lǐng)域所知軟件程序，例如參考文獻(xiàn)70的7.7.18部分所描述的軟件程序，可進(jìn)行比對(duì)并確定同源性百分?jǐn)?shù)或序列相同性百分?jǐn)?shù)。優(yōu)選的比對(duì)程序是GCG Gap(威斯康星州的遺傳計(jì)算機(jī)組(Genetics Computer Group),套件版本10.1),優(yōu)選使用以下默認(rèn)參數(shù):開(kāi)放缺口 = 3 ;延伸缺口 = 1。
[0190]附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明
[0191]圖1顯示MDCK細(xì)胞中生長(zhǎng)的野生型PR8和PR8-X病毒在感染后不同時(shí)間的病毒效價(jià)(通過(guò)病灶形成實(shí)驗(yàn)(FFA);圖1A)和HA效價(jià)(通過(guò)血紅細(xì)胞血凝素實(shí)驗(yàn)；圖1B)。圖1A中的實(shí)線和圖1B中的陰影柱代表野生型PR8的結(jié)果。圖1A中的虛線和圖1B中的空白柱代表野生型PR8-X的結(jié)果。X軸表示感染后的時(shí)間(小時(shí))而圖1A和IB中的y軸分別表示病毒效價(jià)(IU/mL)和HA效價(jià)。
[0192]圖2顯示MDCK細(xì)胞中生長(zhǎng)的反向遺傳所得PR8和PR8-X病毒在感染后不同時(shí)間的病毒效價(jià)(通過(guò)FFA ；圖2A)和HA效價(jià)(通過(guò)血紅細(xì)胞血凝素實(shí)驗(yàn)；圖2B)。圖2A中的實(shí)線和圖2B中的陰影柱代表PR8的結(jié)果。圖2A中的虛線和圖2B中的空白柱代表RG所得PR8-X的結(jié)果。X軸表示感染后的時(shí)間(小時(shí))而圖2A和2B中的y軸分別表示病毒效價(jià)(IU/mL)和 HA 效價(jià)。
[0193]圖3是對(duì)MDCK細(xì)胞中用PR8或PR8-X主鏈區(qū)段生成的反向遺傳源性6: 2重配病毒感染后不同時(shí)間的病毒效價(jià)(通過(guò)FFA;圖3A)和HA效價(jià)(通過(guò)血紅細(xì)胞血凝素實(shí)驗(yàn)；圖3B)的比較，其中PR8或PR8-X的主鏈區(qū)段包括來(lái)自PR8-X的HA和NA區(qū)段。圖3A中的實(shí)線和圖3B中的陰影柱代表PR8主鏈的結(jié)果。圖3A中的虛線和圖3B中的空心柱代表PR8-X主鏈的結(jié)果。X軸表示感染后的時(shí)間(小時(shí))而圖3A和3B中的y軸分別表示病毒效價(jià)(IU/mL)和HA效價(jià)。
[0194]圖4是MDCK細(xì)胞中用野生型PR8或PR8-X主鏈區(qū)段生成的反向遺傳源性6: 2重配病毒在感染后不同時(shí)間的病毒效價(jià)(通過(guò)FFA ;圖4A)和HA效價(jià)(通過(guò)血紅細(xì)胞血凝素實(shí)驗(yàn)；圖4B)的比較，其中，野生型PR8或PR8-X主鏈區(qū)段包含來(lái)自流行性Hl毒株(毒株I)的HA和NA區(qū)段。圖4A中的實(shí)線和圖4B中的陰影柱代表野生型PR8主鏈的結(jié)果。圖4A中的虛線和圖4B中的空心柱代表PR8-X主鏈的結(jié)果。X軸表示感染后的時(shí)間(小時(shí))而圖4A和4B中的y軸分別表示病毒效價(jià)(IU/mL)和HA效價(jià)。
[0195]圖5是MDCK細(xì)胞中用PR8或PR8-X主鏈區(qū)段生成的反向遺傳源性6: 2重配病毒在感染后不同時(shí)間的病毒效價(jià)(通過(guò)病灶形成實(shí)驗(yàn)(FFA);圖5A)和HA效價(jià)(圖5B)的比較，其中，PR8或PR8-X主鏈區(qū)段包含來(lái)自105p30的HA和NA區(qū)段。圖5A中的實(shí)線和圖5B中的陰影柱代表野生型PR8主鏈的結(jié)果。圖5A中的虛線和圖5B中的空心柱代表PR8-X主鏈的結(jié)果。X軸表示感染后的時(shí)間(小時(shí))而y軸表示病毒滴度(IU/mL)。
[0196]圖6顯示MDCK細(xì)胞中生長(zhǎng)的野生型PR8-X和105p30病毒(圖6A)或反向遺傳源性PR8-X和105p30病毒(圖6B)在感染后不同時(shí)間的病毒滴度(通過(guò)病灶形成實(shí)驗(yàn)(FFA))。圖6A和6B中，實(shí)線代表105p30的結(jié)果。虛線代表PR8-X的結(jié)果。x軸表示感染后的時(shí)間(小時(shí))而圖6A和6B中的y軸分別表示病毒效價(jià)(IU/mL)和HA效價(jià)。
[0197]圖7顯示包含野生型PR8毒株(帶三角形的線)或105p30毒株(帶方形的線)的主鏈區(qū)段和流行性Hl流感毒株(毒株2)的HA和NA區(qū)段的重配病毒生長(zhǎng)特點(diǎn)。圖7A和7B中的X軸表示感染后的時(shí)間(小時(shí))。圖7A中的y軸表示以每mL FFU計(jì)的效價(jià)LoglO。圖7B中的y軸表示每mL病毒顆粒中的效價(jià)1glO。
[0198]圖8是MDCK細(xì)胞中用105p30或PR8-X主鏈區(qū)段生成的反向遺傳源性6: 2重配病毒在感染后不同時(shí)間 的病毒效價(jià)(通過(guò)病灶形成實(shí)驗(yàn)(FFA))的比較，其中，105p30或PR8-X主鏈區(qū)段包含來(lái)自(A)Hl毒株(毒株I)或⑶流行性Hl毒株(毒株2)的HA和NA區(qū)段。實(shí)線代表105p30主鏈的結(jié)果。虛線代表PR8-X主鏈的結(jié)果。X軸表示感染后的時(shí)間(小時(shí))而y軸表示病毒效價(jià)(IU/mL)。
[0199]圖9是MDCK細(xì)胞中用#17、#19或PR9-X主鏈聯(lián)合來(lái)自(A)流行性Hl毒株(毒株3)或(B)H3(毒株I)的HA和NA區(qū)段生成的反向遺傳源性6: 2重配病毒在感染后不同時(shí)間的病毒效價(jià)(通過(guò)病灶形成實(shí)驗(yàn)(FFA))。在圖9A和9B中，帶有圓形標(biāo)記的虛線代表#17主鏈的結(jié)果。帶有菱形標(biāo)記的實(shí)線代表#19主鏈的結(jié)果。帶有方形標(biāo)記的虛線代表PR8-X主鏈的結(jié)果。X軸表示感染后的時(shí)間(小時(shí))而y軸表示病毒效價(jià)(IU/mL)。
[0200]圖10是MDCK細(xì)胞中一組用嵌合#19或PR8-X主鏈+HA和NA區(qū)段生成的不同反向遺傳源性6: 2重配病毒在感染后不同時(shí)間的病毒效價(jià)(通過(guò)病灶形成實(shí)驗(yàn)(FFA))的比較，所述HA和NA區(qū)段來(lái) 自以下毒株:(A)流行性Hl毒株(毒株2)、⑶流行性Hl毒株(毒株4)、(C)Hl毒株(毒株2)、(D)Hl毒株(毒株3)或(E) H3毒株(毒株2)。圖10A-E中，帶有三角形標(biāo)記的實(shí)線代表#19主鏈的結(jié)果。帶有方形標(biāo)記的虛線代表PR8-X主鏈的結(jié)果。X軸表示感染后的時(shí)間(小時(shí))而y軸表示病毒效價(jià)(IU/mL)。
[0201]圖11是MDCK細(xì)胞中用嵌合#19 (空白柱)或PR8-X主鏈(實(shí)心柱)+HA和NA區(qū)段生成的不同6: 2重配病毒感染后60小時(shí)的HA產(chǎn)量(通過(guò)凝集素捕獲ELISA)的比較，其中，所述HA和NA區(qū)段來(lái)自以下毒株:(A)流行性Hl毒株(毒株2)、⑶流行性Hl毒株(毒株4)、(C) H3毒株(毒株I)或(D) H3毒株(毒株2)。用野生型PR8主鏈經(jīng)典重配(“經(jīng)典”)制備的對(duì)應(yīng)6: 2重配病毒也作為對(duì)照(陰影柱)包括在內(nèi)。y軸表示HA含量(yg/mL) o
[0202]圖12顯示包含主鏈17、18、19和20 (如表1所示；分別是帶有菱形、方形、三角形和叉形的線)的重配流感病毒和包含與來(lái)自H3流感毒株(毒株I)相同的HA和NA區(qū)段但來(lái)自PR8-X的全部主鏈區(qū)段的對(duì)照(帶有圈形的線)和等同野生型毒株(帶有加號(hào)的線)的生長(zhǎng)曲線。X軸表示感染后的時(shí)間(小時(shí))(hpi)而y軸表示IU/mL。
[0203]圖13顯示包含主鏈17和19 (分別是帶有菱形和三角形的線)和來(lái)自H3流感毒株(毒株3)的HA區(qū)段的重配流感病毒、包含相同HA和NA區(qū)段但來(lái)自PR8-X的全部主鏈區(qū)段的對(duì)照(帶有加號(hào)的線)和等同野生型毒株(帶有圓形的線)的生長(zhǎng)曲線。
[0204]圖14顯示使用包含主鏈19 (空心盒)、PR8-X主鏈(陰影盒)的重配流感病毒和野生型流感病毒(虛線盒)的FFA(14 (A)和14(C))和HA-ELISA(14 (B)和14(D))實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖14⑷和14⑶顯示采用Hl流感毒株(毒株2)的結(jié)果，圖14(C)和⑶顯示采用H3流感病毒株的結(jié)果。圖14⑷和(C)中的y軸表示病毒效價(jià)(IU/mL)而圖14⑶和
14(D)中的 y 軸表示 HA ( u g/mL) ?
[0205]圖 15 是 A/New Caledonia/20/99 (SEQ ID NO:33)和 105p30 (SEQ ID NO:45)的Ml病毒區(qū)段的排列。
【具體實(shí)施方式】
[0206]新型供體毒株的開(kāi)發(fā)
[0207]為提供高度生長(zhǎng)供體毒株，供體毒株A/Puerto Rico/8/34在MDCK33016細(xì)胞中傳代五次。使用該方法，發(fā)明人能夠獲得顯示生長(zhǎng)特性相較原始毒株改善的毒株P(guān)R8-X。[0208]所述105p30流感供體毒株通過(guò)從MDCK33016細(xì)胞中的臨床分離物分離A/NewCaledonia/20/1999流感病毒并傳代該病毒30次而獲得。所得毒株的M區(qū)段與SEQ ID NO:33對(duì)齊時(shí)在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:33中氨基酸95的位置處具有賴氨酸。
[0209]野生型PR8和PR8-X病毒的生長(zhǎng)特性
[0210]為了比較PR8-X和野生型PR8供體毒株的生長(zhǎng)特性，通過(guò)病灶形成實(shí)驗(yàn)和血凝素實(shí)驗(yàn)檢測(cè)這些病毒株在MDCK細(xì)胞中的病毒效價(jià)。
[0211]病灶形成試驗(yàn)(FFA)
[0212]對(duì)于FFA實(shí)驗(yàn)，將未感染的MDCK細(xì)胞以1.8X IO4細(xì)胞/孔的密度加入96孔板的IOOuL DMEM(含10% FCS)中。第二天，吸出培養(yǎng)基，然后用50 體積中的病毒(病毒稀釋在DMEM+1% FCS中)感染細(xì)胞。細(xì)胞在37°C孵育到第二天。
[0213]在感染后若干時(shí)間點(diǎn)，吸出培養(yǎng)基并用PBS清洗所述細(xì)胞一次。向每孔加入50 ill冰冷的50% /50%丙酮-甲醇然后在-20°C孵育30分鐘。吸出丙酮混合物并用PBST(PBS+0.1%吐溫)清洗所述細(xì)胞一次。每孔加入50 ill溶于PBS的2% BSA然后室溫(RT)孵育30分鐘。將50 iill: 6000稀釋的抗NP加入封閉緩沖液然后室溫孵育I小時(shí)。吸出抗體溶液并用PBST清洗所述細(xì)胞三次。二抗(山羊抗小鼠)以1: 2000稀釋度在50 u I封閉緩沖液中添加，并將所述板RT孵育I小時(shí)。吸出抗體溶液并用PBST清洗所述細(xì)胞三次。每孔加入50iU KPL True Blue并孵育10分鐘。通過(guò)吸出True-Blue終止反應(yīng)并用dH20清洗一次。吸出水并晾干所述細(xì)胞。
[0214]結(jié)果(圖1) 顯示PR8-X毒株相較于其來(lái)源野生PR8毒株在相同時(shí)間框內(nèi)能生長(zhǎng)到更高效價(jià)。
[0215]包含PR8-X或野生型PR8主鏈的重配病毒的生長(zhǎng)特性
[0216]為了測(cè)試PR8-X毒株作為供體毒株用于病毒重配的合適性，通過(guò)反向遺傳學(xué)產(chǎn)生包含來(lái)自流行性Hl毒株的HA和NA蛋白和來(lái)自PR8-X或PR8的其它病毒區(qū)段的重配病毒。這些重配病毒的病毒效價(jià)通過(guò)上述FFA和HA實(shí)驗(yàn)測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)圖4。
[0217]該結(jié)果指示，包含來(lái)自PR-8的病毒區(qū)段的重配病毒相較于包含來(lái)自PR8/34毒株的病毒區(qū)段的重配病毒在MDCK細(xì)胞中生長(zhǎng)更快。
[0218]105p30毒株相較PR8-X的生長(zhǎng)特性
[0219]用105p30和PR8-X以10_3的moi感染MDCK細(xì)胞，并在感染后的若干時(shí)間點(diǎn)采樣。效價(jià)通過(guò)FFA實(shí)驗(yàn)測(cè)定。結(jié)果顯示105p30相較于PR8-X在MDCK細(xì)胞中生長(zhǎng)甚至更快(圖6)。
[0220]包含105p30或野生型PR8主鏈的重配病毒的生長(zhǎng)特性
[0221]為了測(cè)試105p30毒株作為供體毒株用于病毒重配的合適性，使用反向遺傳學(xué)產(chǎn)生包含來(lái)自流行性Hl流感毒株的HA和NA區(qū)段和來(lái)自105p30或野生型PR8毒株的主鏈區(qū)段的重配病毒。用重配病毒以10_3的moi感染MDCK細(xì)胞，并在感染后I小時(shí)、12小時(shí)、36小時(shí)和60小時(shí)采樣。效價(jià)通過(guò)病灶形成實(shí)驗(yàn)或通過(guò)實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR測(cè)定病毒顆粒來(lái)測(cè)定。包含來(lái)自105p30毒株的主鏈區(qū)段的重配病毒比用野生型PR8毒株的主鏈區(qū)段重配的病毒生長(zhǎng)更快。這顯示105p30毒株是用于產(chǎn)生快速生長(zhǎng)重配病毒的良好供體毒株(圖7)。
[0222]使用來(lái)自兩種供體毒株的主鏈區(qū)段的流感病毒的拯救
[0223]在MDCK細(xì)胞中測(cè)試包含來(lái)自H3流感病毒的HA和NA區(qū)段和來(lái)自105p30及PR8-X供體毒株的主鏈區(qū)段的重配流感病毒的拯救效率。所述重配流感病毒包含105p30和PR8-X供體毒株的主鏈區(qū)段，如下表所示:
[0224]表1
【權(quán)利要求】
1.一種包含來(lái)自兩種或多種供體毒株的主鏈區(qū)段的重配甲型流感病毒，其中，所述PBl和PB2區(qū)段來(lái)自相同供體毒株。
2.一種包含來(lái)自兩種、三種或四種供體毒株的主鏈區(qū)段的重配甲型流感病毒，其中各供體毒株提供多于一種主鏈區(qū)段。
3.一種包含來(lái)自兩種或多種供體毒株的主鏈區(qū)段的重配甲型流感病毒，其中，所述PBl區(qū)段不來(lái)自A/Texas/1/77流感毒株。
4.一種包含來(lái)自兩種或多種供體毒株的主鏈區(qū)段的甲型流感病毒，其中，至少PA、NP或 M 區(qū)段不來(lái)自 A/Puerto Rico/8/34。
5.如權(quán)利要求2-4中任一項(xiàng)所述的重配甲型流感病毒，其特征在于，所述PBl和PB2區(qū)段來(lái)自相同供體毒株。
6.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的甲型流感病毒，其特征在于，所述甲型流感病毒包含M基因組區(qū)段，所述區(qū)段在使用成對(duì)比對(duì)算法與SEQ ID NO: 33對(duì)齊時(shí)在對(duì)應(yīng)SEQ IDNO: 33中氨基酸95的位置處具有賴氨酸。
7.—種流感供體毒株，其中所述供體毒株是105p30。
8.一種甲型流感毒株，其中M基因組區(qū)段在使用成對(duì)比對(duì)算法與SEQ ID N0:33對(duì)齊時(shí)在對(duì)應(yīng)SEQ ID NO: 33中氨基酸95的位置處具有賴氨酸。
9.如權(quán)利要求8所述的甲型流感毒株，其特征在于，所述甲型流感毒株是HlNl毒株。
10.一種包含來(lái)自供體毒株的至少一種主鏈病毒區(qū)段的重配甲型流感病毒，其中所述供體毒株選自105 p30和PR8-X。
11.如權(quán)利要求9所述的病毒，其特征在于，所述至少一種主鏈病毒區(qū)段的序列與選自SEQ IDN011-14 或 SEQ ID N018-22 的序列至少 95% 相同。
12.如權(quán)利要求9所述的病毒，其特征在于，所述至少一種主鏈病毒區(qū)段具有序列SEQID NO: 17 或 SEQ ID NO:20 序列。
13.如權(quán)利要求9-12中任一項(xiàng)所述的病毒，其特征在于，所述病毒包含來(lái)自兩種或更多供體毒株的主鏈區(qū)段。
14.如權(quán)利要求13所述的病毒，其特征在于，所述PBl和PB2病毒區(qū)段來(lái)自相同供體毒株。
15.如權(quán)利要求11所述的病毒，其特征在于，所述PBl和PB2病毒區(qū)段與SEQID NO: 18和19的序列至少95%相同。
16.如權(quán)利要求15所述的病毒，其特征在于，所述病毒還包含與選自SEQID N017-22的序列至少95%相同的病毒區(qū)段。
17.一種制備重配甲型流感病毒的方法，所述方法包括以下步驟: (i)向培養(yǎng)宿主引入編碼產(chǎn)生甲型流感病毒所需病毒區(qū)段的一種或多種表達(dá)構(gòu)建體，其中，所述主鏈病毒區(qū)段來(lái)自兩種或多種流感毒株而所述PBl和PB2區(qū)段來(lái)自所述相同供體毒株；和 (ii)培養(yǎng)所述培養(yǎng)宿主來(lái)產(chǎn)生重配病毒。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述一種或多種表達(dá)構(gòu)建體編碼兩種或多種流感供體毒株的主鏈區(qū)段。
19.一種制備重配甲型流感病毒的方法，所述方法包括以下步驟:(i)向培養(yǎng)宿主引入編碼產(chǎn)生甲型流感病毒所需病毒區(qū)段的一種或多種表達(dá)構(gòu)建體，其中，所述主鏈病毒區(qū)段來(lái)自兩種或多種流感毒株；和 (ii)培養(yǎng)所述培養(yǎng)宿主來(lái)產(chǎn)生重配病毒； 其中，所述一種或多種表達(dá)構(gòu)建體不編碼來(lái)自A/Texas/1/77流感毒株的PBl區(qū)段。
20.一種制備重配流感病毒的方法，所述方法包括以下步驟: (i)向培養(yǎng)宿主引入編碼產(chǎn)生流感病毒所需病毒區(qū)段的一種或多種表達(dá)構(gòu)建體，其中，一種或多種主鏈病毒區(qū)段來(lái)自105p30和/或PR8-X流感毒株，以及其中，至少一種病毒區(qū)段源自第二種流感毒株；和 (ii)培養(yǎng)所述培養(yǎng)宿主來(lái)產(chǎn)生重配病毒。
21.如權(quán)利要求17-20中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述至少一種表達(dá)構(gòu)建體包含的序列與選自SEQ ID N011-14和18-22的序列至少90%相同。
22.如權(quán)利要求17-21中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法還包括純化步驟(ii)所得重配病毒的步驟(iii)。
23.如權(quán)利要求20-22中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述來(lái)自第二種流感毒株的至少一種病毒區(qū)段是所述HA區(qū)段。
24.一種用于產(chǎn)生流感病毒的方法，所述方法包括以下步驟(a)用如權(quán)利要求1-16所述的重配流感病毒感染培養(yǎng)宿主；(b)培養(yǎng)來(lái)自步驟(a)的宿主以產(chǎn)生所述病毒；和可選地(c)純化步驟(b)中獲得的病毒。`
25.一種制備疫苗的方法，所述方法包括步驟(a)通過(guò)權(quán)利要求24所述的方法制備病毒和(b)從所述病毒制備疫苗。
26.如權(quán)利要求24或25所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)宿主是含胚雞蛋。
27.如權(quán)利要求24或25所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)宿主是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是MDCK、Vero或PerC6細(xì)胞。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。
30.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述MDCK細(xì)胞是細(xì)胞系MDCK33016(DSMACC2219)。
32.如權(quán)利要求25-31中的一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟(b)包括滅活所述病毒。
33.如權(quán)利要求25-32中一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述疫苗是全病毒顆粒疫苗。
34.如權(quán)利要求25-32中一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述疫苗是裂解病毒顆粒疫苗。
35.如權(quán)利要求25-32中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述疫苗是表面抗原疫苗。
36.如權(quán)利要求25-32中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述疫苗是病毒體疫苗。
37.如權(quán)利要求25-36中任一項(xiàng)所述的方法,其特征在于,所述疫苗包含每劑量少于IOng的殘留宿主細(xì)胞DNA。
38.如任何前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述流感毒株中至少一種是 H1、H2、H5、H7 或 H9 亞型。
39.一種不包含所述流感HA Hl亞型的105p30供體毒株。
40.一種表達(dá)系統(tǒng)，所述表達(dá)系統(tǒng)包括含有編碼105p30或PR8-X毒株區(qū)段的vRNA的一種或多種表達(dá)構(gòu)建體， 其中所述表達(dá)構(gòu)建體包含來(lái)自所述105p30或PR8-X毒株的至少一種主鏈病毒區(qū)段。
【文檔編號(hào)】C12N7/04GK103608453SQ201380000396
【公開(kāi)日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2013年3月2日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月2日
【發(fā)明者】P·蘇帕菲帕特, P·梅森, B·基納, P·R·道米策, H·特魯賽姆 申請(qǐng)人:諾華股份有限公司