氨基酸的制造方法
【專利摘要】通過(guò)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)如下棒狀細(xì)菌，使選自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鳥氨酸組成的組中的1種以上氨基酸在培養(yǎng)物中生成并累積，并從該培養(yǎng)物中收集該氨基酸，由此可以高效地制造該氨基酸，在所述棒狀細(xì)菌中，通過(guò)向親株的染色體DNA上存在的編碼具有L-精氨酸、L-瓜氨酸或L-鳥氨酸攝取活性的蛋白質(zhì)的1個(gè)以上基因中引入1個(gè)以上的核苷酸的缺失、取代或添加，由此與親株相比，選自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鳥氨酸組成的組中的1種以上氨基酸的攝取活性降低或喪失，并且所述棒狀細(xì)菌能夠生產(chǎn)該氨基酸。
【專利說(shuō)明】氨基酸的制造方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種使用具有生成并累積選自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鳥氨酸組 成的組中的1種以上氨基酸的能力的棒狀細(xì)菌（coryneformbacterium)進(jìn)行的該氨基酸 的制造方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 已知在氨基酸的發(fā)酵生產(chǎn)中，使氨基酸向細(xì)胞內(nèi)的攝取活性降低或喪失時(shí)，可以 防止排出到微生物的細(xì)胞外的氨基酸再次攝取到細(xì)胞內(nèi)并被代謝，因此其生產(chǎn)率提高。
[0003] 例如，關(guān)于L-谷氨酸，報(bào)道了一種使用使L-谷氨酸向細(xì)胞內(nèi)的攝取活性降低或喪 失的谷氨酸棒桿菌（Corynebacteriumglutamicum)的L-谷氨酸的制造方法（專利文獻(xiàn) 1)。另外，關(guān)于芳香族氨基酸，報(bào)道了一種使用使芳香族氨基酸向細(xì)胞內(nèi)的攝取活性降低或 喪失的谷氨酸棒桿菌的芳香族氨基酸的制造方法（專利文獻(xiàn)2)。
[0004] 作為具有氨基酸向細(xì)胞內(nèi)的攝取活性的蛋白質(zhì)，在大腸桿菌中，鑒定有3種L-精 氨酸向細(xì)胞內(nèi)的周質(zhì)結(jié)合蛋白依賴型攝取蛋白質(zhì)（非專利文獻(xiàn)1)。
[0005]在棒狀細(xì)菌中，報(bào)道了具有L-甲硫氨酸及L-丙氨酸（非專利文獻(xiàn)2)、L-谷氨酸 (非專利文獻(xiàn)3及非專利文獻(xiàn)4)、L-異亮氨酸（非專利文獻(xiàn)5)、芳香族氨基酸（非專利文 獻(xiàn)6)、L-賴氨酸（非專利文獻(xiàn)7)等氨基酸向細(xì)胞內(nèi)的攝取活性的蛋白質(zhì)。
[0006] 然而，關(guān)于谷氨酸棒桿菌的NCgll278、NCgll277及NCgll276,在非專利文獻(xiàn)8中 僅描述了，其分別被命名為BAB98725、BAB98724、BAB98723,并基于已知的氨基酸序列的同 源性被分類為ATP結(jié)合盒（ABC)超家族，而未報(bào)道這些蛋白質(zhì)具有氨基酸的攝取活性。另 夕卜，也沒(méi)有通過(guò)使這些蛋白質(zhì)的活性降低或喪失而使氨基酸的生產(chǎn)率提高這樣的報(bào)道。
[0007] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0008] 專利文獻(xiàn)
[0009] 專利文獻(xiàn)1 :日本特開(kāi)2000-270872號(hào)公報(bào)
[0010] 專利文獻(xiàn)2 :日本專利第3036819號(hào)公報(bào)
[0011] 非專利文獻(xiàn)
[0012] 非專利文獻(xiàn) 1:THEJOURNALOFMOLECULARBIOLOGY，2007 年，第 373 卷，P251 ? P267
[0013] 非專利文獻(xiàn) 2 :BI0CHEMISTRY，2008 年，第 47 卷，第 48 期，pl2698 ?pl2709
[0014] 非專利文獻(xiàn) 3:APPLLIEDMICROBIOLOGYANDBIOTECHNOLOGY，2003 年，第 60 卷，第 6 期，p738 ?p742
[0015] 非專利文獻(xiàn)4:THEJOURNALOFBACTERIOLOGY，1995年，第177卷，第5期，pll52? P1158
[0016] 非專利文獻(xiàn) 5ARCHIVESOFMICROBIOLOGY，1998 年，第 169 卷，第 4 期，p303 ? p312
[0017] 非專利文獻(xiàn) 6:THEJOURNALOFBACTERIOLOGY，1995 年，第 177 卷，第 20 期， p5991 ?p5993
[0018] 非專利文獻(xiàn) 7 :M0LECULARMICROBIOLOGY，1991 年，第 5 卷，第 12 期，p2995 ?p3005
[0019] 非專利文獻(xiàn) 8 :HANDB00KOFCORYNEBACTERIUMGLUTAMICUM，2005 年，pl65,由 L.EGGELING和M.B0IT編輯，CRCPRESS


【發(fā)明內(nèi)容】

[0020] 發(fā)明所要解決的課題
[0021] 本發(fā)明的課題在于，通過(guò)使棒狀細(xì)菌的選自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鳥氨酸 組成的組中的1種以上氨基酸的攝取活性降低或喪失而使該氨基酸的生產(chǎn)效率提高。
[0022] 用于解決課題的手段
[0023] 本發(fā)明涉及以下的（1)?（4)。
[0024] (1) -種選自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鳥氨酸組成的組中的1種以上氨基酸 的制造方法，其特征在于，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)如下棒狀細(xì)菌，使選自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及 L-鳥氨酸組成的組中的1種以上氨基酸在培養(yǎng)物中生成并累積，并從該培養(yǎng)物中收集該氨 基酸，在所述棒狀細(xì)菌中，通過(guò)向親株的染色體DNA上存在的編碼選自由以下[1]?[6]組 成的組中的蛋白質(zhì)的1個(gè)以上基因中引入1個(gè)以上的核苷酸的缺失、取代或添加，由此與親 株相比，選自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鳥氨酸組成的組中的1種以上氨基酸的攝取活 性降低或喪失，并且所述棒狀細(xì)菌能夠生產(chǎn)該氨基酸，
[0025] [1]具有序列號(hào)2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)
[0026] [2]具有序列號(hào)3所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)
[0027] [3]具有序列號(hào)4所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)
[0028] [4]由與序列號(hào)2所示的氨基酸序列具有80%以上一致性的氨基酸序列構(gòu)成，且 具有該氨基酸的攝取活性的蛋白質(zhì)
[0029] [5]由與序列號(hào)3所示的氨基酸序列具有80%以上一致性的氨基酸序列構(gòu)成，且 具有該氨基酸的攝取活性的蛋白質(zhì)
[0030] [6]由與序列號(hào)4所示的氨基酸序列具有80%以上一致性的氨基酸序列構(gòu)成，且 具有該氨基酸的攝取活性的蛋白質(zhì)。
[0031] (2)如上述（1)所述的制造方法，其特征在于，通過(guò)向親株的染色體DNA上存在的 編碼選自由上述（1)的[1]?[6]組成的組中的蛋白質(zhì)的1個(gè)以上基因中引入1個(gè)以上的 核苷酸的缺失、取代或添加，由此與親株相比，選自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鳥氨酸組 成的組中的1種以上氨基酸的攝取活性降低或喪失，且能夠生產(chǎn)該氨基酸的棒狀細(xì)菌為向 親株的染色體DNA上存在的選自由以下[7]?[9]組成的組中的DNA中引入了 1個(gè)以上的 核苷酸的缺失、取代或添加的棒狀細(xì)菌，
[0032] [7]具有序列號(hào)1所示的核苷酸序列的DNA
[0033] [8]與由與序列號(hào)1所示的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列構(gòu)成的DNA在嚴(yán)格條件 下雜交，且編碼具有該氨基酸的攝取活性的蛋白質(zhì)的DNA
[0034] [9]由與序列號(hào)1所示的核苷酸序列具有80%以上一致性的核苷酸序列構(gòu)成，且 編碼具有該氨基酸的攝取活性的蛋白質(zhì)的DNA。
[0035] (3)如上述⑴或⑵所述的制造方法，其中，棒狀細(xì)菌為谷氨酸棒桿菌。
[0036] (4)如上述（1)?⑶中任一項(xiàng)所述的制造方法，其中，氨基酸為L(zhǎng)-精氨酸或L-瓜 氨酸。
[0037] 發(fā)明效果
[0038] 根據(jù)本發(fā)明，提供一種使用如下棒狀細(xì)菌進(jìn)行的選自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及 L-鳥氨酸組成的組中的1種以上氨基酸的制造方法，所述棒狀細(xì)菌與親株相比選自由L-精 氨酸、L-瓜氨酸及L-鳥氨酸組成的組中的1種以上氨基酸的攝取活性降低或喪失，由此使 該氣基酸的生廣率提商。

【具體實(shí)施方式】
[0039] 1.本發(fā)明中所使用的棒狀細(xì)菌
[0040] 本發(fā)明中所使用的棒狀細(xì)菌為向親株的染色體DNA上存在的編碼選自由以下 [1]?[6]組成的組中的蛋白質(zhì)的1個(gè)以上基因中引入1個(gè)以上的核苷酸的缺失、取代或添 力口，由此與親株相比，選自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鳥氨酸組成的組中的1種以上氨基 酸的攝取活性降低或喪失，且能夠生產(chǎn)該氨基酸的棒狀細(xì)菌，
[0041] [1]具有序列號(hào)2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)
[0042] [2]具有序列號(hào)3所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)
[0043] [3]具有序列號(hào)4所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)
[0044] [4]由與序列號(hào)2所示的氨基酸序列具有80%以上、優(yōu)選90%以上、更優(yōu)選95% 以上、進(jìn)一步優(yōu)選98%以上、特別優(yōu)選99%以上一致性的氨基酸序列構(gòu)成，且具有該氨基 酸的攝取活性的蛋白質(zhì)
[0045] [5]由與序列號(hào)3所示的氨基酸序列具有80%以上、優(yōu)選90%以上、更優(yōu)選95% 以上、進(jìn)一步優(yōu)選98%以上、特別優(yōu)選99%以上一致性的氨基酸序列構(gòu)成，且具有該氨基 酸的攝取活性的蛋白質(zhì)
[0046] [6]由與序列號(hào)4所示的氨基酸序列具有80%以上、優(yōu)選90%以上、更優(yōu)選95% 以上、進(jìn)一步優(yōu)選98%以上、特別優(yōu)選99%以上一致性的氨基酸序列構(gòu)成，且具有該氨基 酸的攝取活性的蛋白質(zhì)。
[0047] 另外，作為本發(fā)明中所使用的棒狀細(xì)菌，可以舉出向親株的染色體DNA上存在的 選自由以下[7]?[9]組成的組中的DNA中引入1個(gè)以上的核苷酸的缺失、取代或添加，由 此與親株相比，該氨基酸的攝取活性降低或喪失，且能夠生產(chǎn)該氨基酸的棒狀細(xì)菌，
[0048] [7]具有序列號(hào)1所示的核苷酸序列的DNA
[0049] [8]與由與序列號(hào)1所示的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列構(gòu)成的DNA在嚴(yán)格條件 下雜交，且編碼具有該氨基酸的攝取活性的蛋白質(zhì)的DNA
[0050] [9]由與序列號(hào)1所示的核苷酸序列具有80%以上、優(yōu)選90%以上、更優(yōu)選95% 以上、進(jìn)一步優(yōu)選98%以上、特別優(yōu)選99%以上一致性的核苷酸序列構(gòu)成，且編碼具有該 氨基酸的攝取活性的蛋白質(zhì)的DNA。
[0051] 由序列號(hào)2、3和4所示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)分別由由序列號(hào)1的301? 1164、1312?2157和2173?2925所示的核苷酸序列構(gòu)成的DNA編碼。
[0052] 在本說(shuō)明書中，基因是指除蛋白質(zhì)的編碼區(qū)以外可以含有轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)及啟動(dòng)子區(qū) 等的DNA。
[0053] 作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，可以舉出自染色體DNA上的編碼區(qū)的5'末端起由上游側(cè)100個(gè) 核苷酸、優(yōu)選50個(gè)核苷酸構(gòu)成的DNA，作為啟動(dòng)子區(qū)，可以舉出對(duì)應(yīng)于-10及-35區(qū)的區(qū)域。
[0054] 與親株相比，選自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鳥氨酸組成的組中的1種以上氨基 酸的攝取活性降低或喪失，且能夠生產(chǎn)該氨基酸的棒狀細(xì)菌可以舉出：通過(guò)向親株的染色 體DNA上存在的編碼選自由上述[1]?[6]組成的組中的蛋白質(zhì)的1個(gè)以上基因中或選自 由上述[7]?[9]組成的組中的DNA中引入1個(gè)以上的核苷酸的缺失、取代或添加而得到 的（a)與親株相比，由該基因或該DNA編碼的蛋白質(zhì)的比活性降低到80%以下、優(yōu)選50% 以下、更優(yōu)選30%以下、進(jìn)一步優(yōu)選20%以下、特別優(yōu)選10%以下、最優(yōu)選0%的棒狀細(xì)菌， 及（b)與親株相比，該基因或該DNA的轉(zhuǎn)錄量、或者由該基因或該DNA編碼的蛋白質(zhì)的生產(chǎn) 量降低到80 %以下、優(yōu)選50 %以下、更優(yōu)選30 %以下、進(jìn)一步優(yōu)選20 %以下、特別優(yōu)選10 % 以下、最優(yōu)選〇%的棒狀細(xì)菌。更優(yōu)選可以舉出該基因或該DNA的一部分或全部缺失的棒狀 細(xì)菌。
[0055] 向親株的染色體DNA上存在的編碼選自由上述[1]?[6]組成的組中的蛋白質(zhì)的 1個(gè)以上基因或選自由上述[7]?[9]組成的組中的DNA中引入的1個(gè)以上的核苷酸的缺 失、取代或添加，只要是與親株相比使由該基因或該DNA編碼的蛋白質(zhì)的攝取活性降低或 喪失的1個(gè)以上的核苷酸的缺失、取代或添加，則核苷酸的種類及數(shù)量就沒(méi)有限制，但是作 為核苷酸的缺失，可以舉出啟動(dòng)子及轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)中1個(gè)以上核苷酸、優(yōu)選10個(gè)以上核苷酸、 更優(yōu)選20個(gè)以上核苷酸、進(jìn)一步優(yōu)選全部區(qū)域的缺失，編碼區(qū)中1個(gè)以上核苷酸、優(yōu)選10 個(gè)以上核苷酸、更優(yōu)選20個(gè)以上核苷酸、進(jìn)一步優(yōu)選100個(gè)以上核苷酸、特別優(yōu)選200個(gè)以 上核苷酸、最優(yōu)選編碼區(qū)全部的缺失。
[0056] 作為1個(gè)以上的核苷酸的取代，可以舉出取代自編碼區(qū)的5'末端起第150個(gè)以內(nèi) 的核苷酸、優(yōu)選第100個(gè)以內(nèi)的核苷酸、更優(yōu)選第50個(gè)以內(nèi)的核苷酸、特別優(yōu)選第30個(gè)以 內(nèi)的核苷酸、最優(yōu)選第20個(gè)以內(nèi)的核苷酸從而引入無(wú)義密碼子的取代。
[0057] 作為1個(gè)以上的核苷酸的添加，可以舉出緊接在自編碼區(qū)的5'末端起第150個(gè)以 內(nèi)的核苷酸、優(yōu)選第100個(gè)以內(nèi)的核苷酸、更優(yōu)選第50個(gè)以內(nèi)的核苷酸、特別優(yōu)選第30個(gè) 以內(nèi)的核苷酸、最優(yōu)選第20個(gè)以內(nèi)的核苷酸之后添加1個(gè)以上核苷酸、優(yōu)選50個(gè)以上核苷 酸、更優(yōu)選100個(gè)以上核苷酸、進(jìn)一步優(yōu)選200個(gè)以上核苷酸、特別優(yōu)選500個(gè)以上核苷酸、 最優(yōu)選lkb以上的DNA片段，最優(yōu)選可以舉出氯霉素抗性基因及卡那霉素抗性基因等的插 入。
[0058] 在本說(shuō)明書中，選自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鳥氨酸組成的組中的1種以上 氨基酸的攝取活性是指將選自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鳥氨酸組成的組中的1種以上 氨基酸、優(yōu)選L-精氨酸或L-瓜氨酸、更優(yōu)選L-精氨酸從棒狀細(xì)菌的細(xì)胞外攝取到細(xì)胞內(nèi) 的活性。
[0059] 與親株相比該氨基酸的攝取活性降低可以通過(guò)如下來(lái)確認(rèn)：利用Northern印跡 分析或者RT-PCR對(duì)編碼選自由上述[1]?[6]組成的組中的蛋白質(zhì)的1個(gè)以上基因或選 自由上述[7]?[9]組成的組中的DNA的轉(zhuǎn)錄物量進(jìn)行定量，并與親株進(jìn)行比較，或者利用 SDS-PAGE或使用抗體的測(cè)定法對(duì)由該基因或該DNA編碼的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)量進(jìn)行定量，并與 親株進(jìn)行比較，等等。
[0060] 另外，在以該氨基酸為單一碳源在瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，根據(jù)一定時(shí)間后的菌落 的直徑與親株相比小、或沒(méi)有生長(zhǎng)，可以確認(rèn)與親株相比該氨基酸的攝取活性降低或喪失。
[0061] 氨基酸序列或核苷酸序列的一致性可以使用Karlin和Altschul的算法 BLAST[PROCEEDINGSOFTHENATIONALACADEMYOFSCIENCES，1993 年，第 90 卷，第 12 期， p5873 ?p5877]或FASTA[METH0DSINENZYM0L0GY，1990 年，第 183 卷，p63 ?p98]確定。 基于該算法BLAST，開(kāi)發(fā)了稱為BLASTN和BLASTX的程序[JOURNALOFMOLECULARBIOLOGY， 1990年，第215卷，p403?p410]。在基于BLAST利用BLASTN分析核苷酸序列的情況下，參 數(shù)設(shè)為例如Score= 100、wordlength= 12。另外，在基于BLAST利用BLASTX分析氨基酸 序列的情況下，參數(shù)設(shè)為例如score= 50、wordlength= 3。在使用BLAST和GappedBLAST 程序的情況下，使用各程序的默認(rèn)參數(shù)。這些分析方法的具體方法是眾所周知的。
[0062] 上述所謂的"雜交"是指在特定的條件下DNA與具有特定核苷酸序列的DNA或該 DNA的一部分雜交。因此，該具有特定核苷酸序列的DNA或該DNA的一部分的核苷酸序列 作為Northern印跡分析或Southern印記分析的探針是有用的，或者可以為具有能夠用作 PCR分析的寡核苷酸引物的長(zhǎng)度的DNA。作為用作探針的DNA，可以舉出至少100個(gè)以上核 苷酸、優(yōu)選200個(gè)以上核苷酸、更優(yōu)選500個(gè)以上核苷酸的DNA，但是可以為至少10個(gè)以上 核苷酸、優(yōu)選15個(gè)以上核苷酸的DNA。
[0063] DNA的雜交實(shí)驗(yàn)的方法是眾所周知的，可以按照例如分子克隆第2版、第3版 (2001 年），METHODSFORGENERALANDMOLECULARBACTERI0LGY，ASMPRESS(1994 年），或 IMMUNOLOGYMETHODSMANUAL，ACADEMICPRESS(MOLECULAR)中的記載，以及大量其它的標(biāo) 準(zhǔn)教科書確定雜交的條件而進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
[0064] 另外，也可以通過(guò)按照市售的雜交試劑盒附帶的說(shuō)明書獲得在嚴(yán)格條件下雜交的 DNA。作為市售的雜交試劑盒，可以舉出例如利用隨機(jī)引物法制作探針，并在嚴(yán)格條件下進(jìn) 行雜交的隨機(jī)引物DNA標(biāo)記試劑盒（RocheDiagnostics公司制）等。
[0065] 上述的嚴(yán)格條件可以舉出例如將固定有DNA的過(guò)濾器和探針DNA在42°C下在含有 50%甲酰胺、5XSSC(750mM的氯化鈉、75mM的檸檬酸鈉）、50mM的磷酸鈉（pH7. 6)、5X鄧哈 特（Denhardt)溶液、10%的硫酸右旋糖苷、及20iig/L的改性鮭魚精子DNA的溶液中培養(yǎng) 一晚，然后在例如約65°C的0. 2XSSC溶液中清洗該過(guò)濾器的條件。
[0066] 上述的各種條件也可以通過(guò)添加或改變用于抑制雜交實(shí)驗(yàn)的背景的阻斷試劑來(lái) 設(shè)定。為了使條件適合，上述阻斷試劑的添加可以伴隨雜交條件的改變。
[0067] 作為能夠在上述嚴(yán)格條件下雜交的DNA，可以舉出例如在使用上述BLAST及FASTA 等程序基于上述參數(shù)計(jì)算時(shí)，由與序列號(hào)1所示的核苷酸序列具有至少80%以上、優(yōu)選 90%以上、更優(yōu)選95%以上、進(jìn)一步優(yōu)選98%以上、特別優(yōu)選99%以上一致性的核苷酸序 列構(gòu)成的DNA。
[0068] 在本說(shuō)明書中，親株是指作為基因改造及轉(zhuǎn)化等的對(duì)象的原株。作為通過(guò)基因引 入進(jìn)行轉(zhuǎn)化的對(duì)象的原株也稱為宿主株。
[0069] 能夠生產(chǎn)該氨基酸是指在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明中所使用的棒狀細(xì)菌時(shí)，具有達(dá)到 能夠從細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收該氨基酸的程度的生產(chǎn)該氨基酸能力。
[0070] 作為能夠生產(chǎn)該氨基酸的棒狀細(xì)菌，在親株原本具有該性質(zhì)的情況下，可以舉出 強(qiáng)化了該性質(zhì)的棒狀細(xì)菌；在親株不具有該性質(zhì)的情況下，可以舉出人工賦予了該性質(zhì)的 棒狀細(xì)菌。
[0071] 作為本發(fā)明中所使用的棒狀細(xì)菌，可以舉出屬于棒桿菌（Corynebacterium)屬、 短桿菌（Brevibacterium)屬或微桿菌（Microbacterium)屬的棒狀細(xì)菌。
[0072] 作為屬于棒桿菌屬的微生物，可以舉出：谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum)、嗜乙醜乙酸棒桿菌（Corynebacteriumacetoacidophilum)、醋谷氨酸棒桿 菌（Corynebacteriumacetoglutamicum)、帚石南棒桿菌（Corynebacteriumcallunae)、 力士棒桿菌（Corynebacteriumherculis)、百合棒桿菌（Corynebacteriumlilium)、 棲糖蜜棒桿菌（Corynebacteriummelassecola)、嗜熱產(chǎn)氨棒桿菌（Corynebacterium thermoaminogenes)等，具體而言，可以舉出：谷氨酸棒桿菌ATCC13032、谷氨酸棒桿菌 ATCC13060、谷氨酸棒桿菌ATCC13826(舊屬種黃色短桿菌（Brevibacteriumflavum))、谷 氨酸棒桿菌ATCC14020(舊屬種叉開(kāi)短桿菌（Brevibacteriumdivaricatum))、谷氨酸棒 桿菌ATCC13869(舊屬種乳糖發(fā)酵短桿菌（Brevibacteriumlactofermentum))、嗜乙醜乙 酸棒桿菌ATCC13870、醋谷氨酸棒桿菌ATCC15806、帚石南棒桿菌ATCC15991、力士棒桿菌 ATCC13868、百合棒桿菌ATCC15990、棲糖蜜棒桿菌ATCC17965、嗜熱產(chǎn)氨棒桿菌ATCC9244 等。
[0073] 作為屬于短桿菌屬的微生物，可以舉出：解糖短桿菌（Brevibacterium saccharolyticum)、未成熟短桿菌（Brevibacteriumimmariophilum)、玫瑰色短桿菌 (Brevibacteriumroseum)、生硫短桿菌（Brevibacteriumthiogenitalis)等，具體而言， 可以舉出：解糖短桿菌ATCC14066、未成熟短桿菌ATCC14068、玫瑰色短桿菌ATCC13825、生 硫短桿菌ATCC19240等。
[0074] 作為屬于微桿菌屬的微生物，可以舉出嗜氨微桿菌（Microbacterium ammoniaphilum)等，具體而言，可以舉出嗜氨微桿菌ATCC15354等。
[0075] 2.本發(fā)明中所使用的棒狀細(xì)菌的制造方法
[0076] 本發(fā)明中所使用的棒狀細(xì)菌可以通過(guò)向親株的染色體DNA上存在的編碼選自由 上述[1]?[6]組成的組中的蛋白質(zhì)的1個(gè)以上基因中或選自由上述[7]?[9]組成的組 中的DNA中引入1個(gè)以上的核苷酸的缺失、取代或添加，并選擇出由此選自由L-精氨酸、 L-瓜氨酸及L-鳥氨酸組成的組中的1種以上氨基酸的生產(chǎn)量與親株相比提高了的棒狀細(xì) 菌來(lái)制造。
[0077] 向親株的染色體DNA上存在的基因中引入1個(gè)以上的核苷酸的缺失、取代或添加 只要是通常的突變處理法、利用重組DNA技術(shù)等的基因置換法、細(xì)胞融合法或者轉(zhuǎn)導(dǎo)法等 可以向棒狀細(xì)菌的染色體DNA中引入突變的方法就沒(méi)有限定。
[0078] 親株只要是具有生產(chǎn)該氨基酸的能力、且具有該氨基酸的攝取活性的棒狀細(xì)菌， 則可以是野生株，也可以是由該野生株通過(guò)人工育種而得到的育種株。
[0079] 作為人工賦予棒狀細(xì)菌生成該氨基酸的能力的方法，可以舉出：
[0080] (a)緩解或消除控制該氨基酸的生物合成的至少一種機(jī)制的方法、
[0081] (b)強(qiáng)化表達(dá)參與該氨基酸的生物合成的至少一種酶的方法、
[0082] (c)增加參與該氨基酸的生物合成的至少一種酶基因的拷貝數(shù)的方法、
[0083] (d)弱化或阻斷由該氨基酸的生物合成路徑分支到該目標(biāo)物質(zhì)以外的代謝產(chǎn)物的 至少一個(gè)代謝路徑的方法、及
[0084](e)選擇與野生型株相比對(duì)該氨基酸的類似物的抗性度高的細(xì)胞株的方法，等；
[0085] 上述公知的方法可以單獨(dú)或組合使用。
[0086] 關(guān)于利用上述（a)?（e)中任一者或組合的方法制備具有生產(chǎn)該氨基酸的 能力的棒狀細(xì)菌的方法，在Biotechnology第二版，第6卷，ProductsofPrimary Metabolism(VCHVerlagsgesellschaftmbH,ffeinheim, 1996)section14a, 14b 或AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,79, 1-35 (2003), Agric.Biol.Chem.，51，2089-2094(1987)、氨基酸發(fā)酵、學(xué)會(huì)出版中心、相田 浩等（1986)中記載有大量的例子，另外，除上述以外，具體的制備具有生 產(chǎn)氨基酸的能力的棒狀細(xì)菌的方法在日本特開(kāi)2003-164297、Agric.Biol. Chem.，39, 153-160 (1975)、Agric.Biol.Chem.，39, 1149-1153 (1975)、日本特開(kāi)昭 58-13599、J.Gen.Appl.Microbiol.，4, 272-283 (1958)、日本特開(kāi)昭 63-94985、八81^。.81〇1. Chem.，37, 2013-2023 (1973)、W097/15673、日本特開(kāi)昭 56-18596、日本特開(kāi)昭 56-144092、 日本特表2003-511086及W02006/001380等中也有大量的報(bào)道，可以通過(guò)參照上述文獻(xiàn)等 制備具有生產(chǎn)該氨基酸的能力的棒狀細(xì)菌。
[0087] 作為可以通過(guò)上述方法制備的具有生產(chǎn)L-精氨酸的能力的棒狀細(xì)菌，可以舉 出例如：賦予了D-精氨酸抗性及精氨酸氧肟酸抗性的谷氨酸棒桿菌[AGRICULTURALAND BIOLOGICALCHEMISTRY，1972 年，第 36 卷，第 10 期，pl675 ?pl684]、引入了使argR基因 缺失的突變的谷氨酸棒桿菌[日本特開(kāi)2002-51790號(hào)]。
[0088] 作為具有生產(chǎn)L-鳥氨酸、L-瓜氨酸或L-精氨酸的能力的棒狀細(xì)菌，可以舉出例 如通過(guò)賦予引起arg操縱子的去抑制這樣的使argR基因缺失的突變和引起乙酰谷氨酸激 酶的脫敏這樣的argB基因突變，從而使L-鳥氨酸、L-瓜氨酸或L-精氨酸的生產(chǎn)率提高的 谷氨酸棒桿菌[W2006/035831 ;及APPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY，2009 年，第 75 卷，第 6 期，pl635 ?pl641]。
[0089] 作為可以用于制備上述具有生產(chǎn)氨基酸能力的棒狀細(xì)菌的棒狀細(xì)菌，只要是可以 應(yīng)用上述（a)?（e)的方法的棒狀細(xì)菌或具有上述遺傳性狀的棒狀細(xì)菌就可以為任一者， 可以優(yōu)選舉出上述的屬于棒桿菌（Corynebacterium)屬、短桿菌（Brevibacterium)屬或微 桿菌（Microbacterium)屬的棒狀細(xì)菌。
[0090] 作為突變處理法，可以舉出例如：使用N-甲基-N' -硝基-N-亞硝基胍（NTG)的 方法（微生物實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，1986年，131頁(yè)，講談社科技公司）、紫外線照射法等。
[0091] 作為利用重組DNA技術(shù)向編碼選自由上述[1]?[6]組成的組中的蛋白質(zhì)的1個(gè) 以上基因或選自由上述[7]?[9]組成的組中的DNA中引入1個(gè)以上的核苷酸的取代、缺 失或添加的基因置換法，可以舉出利用同源重組等將該基因整合到親株的染色體中，進(jìn)而 利用同源重組等置換染色體上本來(lái)存在的該基因的方法。
[0092] 作為向該基因中引入1個(gè)以上的核苷酸的取代、缺失或添加的方法，除此 以夕卜，還可以舉出根據(jù)Molecularcloning:alaboratorymanual,第三版，Cold SpringHarborLaboratoryPress(2001)[以下簡(jiǎn)稱為分子克隆第 3 版]，Current ProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley&Sons(1987_1997)(以下簡(jiǎn)稱為當(dāng)代分 子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南），NucleicAcidsResearch, 10, 6487 (1982),Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 79, 6409 (1982),Gene, 34, 315 (1985),NucleicAcidsResearch, 13, 4431 (1985), Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 82, 488 (1985)等中記載的位點(diǎn)特異性誘變法的方法。
[0093]利用重組DNA技術(shù)的基因置換可以按照J(rèn).Bacteriol.，182, 6884(2000)等中記載 的方法進(jìn)行。
[0094] 通過(guò)將引入了突變的基因插入至適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒載體等中來(lái)制作重組體質(zhì)粒。作為質(zhì) 粒載體，可以使用例如在親株中無(wú)法自主復(fù)制，且具有對(duì)抗生素的抗性標(biāo)記基因及枯草桿 菌的果聚糖鹿糖酶基因sacB[Mol.Microbiol.，6, 1195 (1992)]的質(zhì)粒。
[0095] 作為將該重組體質(zhì)粒引入親株的方法，只要是可以將DNA引入棒狀細(xì)菌的方法就 都可以使用，可以舉出例如：電穿孔法[Appl.Microbiol.Biotech.，52, 541 (1999)]、原生 質(zhì)體法[J.Bacteriol.，159, 306 (1984)]等。
[0096] 該重組體質(zhì)粒由于在親株中無(wú)法自主復(fù)制，因此，可以通過(guò)獲得對(duì)與該重組體質(zhì) 粒具有的抗生素抗性標(biāo)記對(duì)應(yīng)的抗生素顯示抗性的菌株，來(lái)獲得該重組體質(zhì)粒整合到染色 體中而得到的轉(zhuǎn)化株。
[0097] 另外，可以通過(guò)利用與引入了突變的基因一同整合到染色體上的枯草桿菌果聚糖 蔗糖酶生產(chǎn)自殺底物的選擇法[J.Bacteriol.，174, 5462 (1992)]，來(lái)獲得親株的染色體上 的該基因被引入了突變的基因置換的菌株。
[0098] 可以通過(guò)以上的方法進(jìn)行親株的染色體上的基因置換，但不限于上述的方法，只 要是能夠置換棒狀細(xì)菌的染色體上的基因的方法就也可以使用其它的基因置換法。
[0099] 作為向親株的染色體上的基因中引入取代、缺失或添加的方法，除此以外還可以 舉出細(xì)胞融合法、轉(zhuǎn)導(dǎo)法，可以舉出例如相田浩等人編"氨基酸發(fā)酵"，1986年，學(xué)會(huì)出版中 心中記載的方法等。
[0100] 引入突變的核苷酸的數(shù)量及位點(diǎn)如上述1中所記載。
[0101] 通過(guò)向親株的染色體上的基因中引入1個(gè)以上的核苷酸的缺失、取代或添加可 以以高概率使該基因編碼的蛋白質(zhì)的活性降低或喪失[AnIntroductiontoGenetic Analysis，第 7 版，GriffithsAJF、MillerJH、SuzukiDT等人.NewYork:W.H.Freeman; 2000]。
[0102] 編碼上述[1]?[6]的蛋白質(zhì)的基因可以通過(guò)例如將由屬于棒狀細(xì)菌的微生物按 照齊藤等人的方法[BIOCHIMICAETBI0PHYSICAACTA，1963 年，第 72 卷，p619 ?p629]制 備的染色體DNA用作模板，將基于序列號(hào)1的2173?2925、序列號(hào)1的1312?2157或序 列號(hào)1的301?1164所示的核苷酸序列設(shè)計(jì)、合成的寡DNA用作引物并利用PCR而獲得。
[0103] 作為可獲得的具體的基因，可以舉出：具有序列號(hào)1的2173?2925所示的核苷酸 序列的NCgll276、具有序列號(hào)1的1312?2157所示的核苷酸序列的NCgll277及具有序列 號(hào)1的301?1164所示的核苷酸序列的NCgll278等。
[0104] 需要說(shuō)明的是，在2個(gè)以上基因在染色體上相鄰或包含在操縱子DNA中的情況下， 該2個(gè)以上基因也可以通過(guò)例如將基于序列號(hào)1所示的核苷酸序列設(shè)計(jì)、合成的寡DNA用 作引物并利用PCR以1個(gè)DNA的形式獲得。
[0105] 另外，通過(guò)以上述的DNA的一部分或全部為探針的雜交法、或利用公知的方法化 學(xué)合成具有該核苷酸序列的DNA的方法等也可以獲得。
[0106] 另外，對(duì)各種基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)檢索與編碼序列號(hào)2、序列號(hào)3或序列號(hào)4所示的氨 基酸序列的DNA的核苷酸序列具有85 %以上、優(yōu)選90 %以上、更優(yōu)選95 %以上、進(jìn)一步優(yōu)選 98%以上、特別優(yōu)選99%以上同源性或一致性的序列，并基于通過(guò)該檢索所得到的核苷酸 序列由具有該核苷酸序列的生物的染色體DNA、cDNA文庫(kù)等通過(guò)上述的方法也可以獲得。
[0107] DNA的核苷酸序列可以通過(guò)使用通常所使用的核苷酸序列的分析方法，例如雙脫 氧法[PROCEEDINGSOFTHENATIONALACADEMYOFSCIENCES，1977 年，第 74 卷，第 12 期， p5463?p5467]、373ADNA序列分析儀（Perkinelmer公司制）等核苷酸序列分析裝置進(jìn)行 分析來(lái)確定。
[0108] 在確定核苷酸序列的結(jié)果是所獲得的DNA為部分長(zhǎng)度DNA的情況下，可以通過(guò)將 該部分長(zhǎng)度DNA用作探針的針對(duì)染色體DNA文庫(kù)的Southern雜交法等獲得全長(zhǎng)DNA。
[0109] 氨基酸向細(xì)胞內(nèi)的攝取活性的測(cè)定可以根據(jù)THEJOURNALOFBIOLOGICAL CHEMISTRY，1971年，第246卷，第11期，p3653?p3662中所記載的方法進(jìn)行。
[0110] 利用以上的方法可以制備本發(fā)明的制造方法中所使用的棒狀細(xì)菌。
[0111] 3.本發(fā)明的L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鳥氨酸的制造方法
[0112] 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)可以通過(guò)上述的方法制備的棒狀細(xì)菌，使選自由L-精氨酸、L-瓜 氨酸及L-鳥氨酸組成的組中的1種以上氨基酸在培養(yǎng)物中生成、累積，并從該培養(yǎng)物中收 集該氨基酸，由此可以制造該氨基酸。
[0113] 本發(fā)明的制造方法中所使用的培養(yǎng)基只要含有碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽等本發(fā)明的微 生物的增值、以及選自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鳥氨酸組成的組中的氨基酸的生物合 成所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，則可以為合成培養(yǎng)基、天然培養(yǎng)基中的任一者。
[0114] 作為碳源，只要是使用的微生物能夠同化的碳源就可以為任意一種，可以舉出例 如：葡萄糖、糖蜜、果糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉水解物等糖類；乙醇、甘油等醇類；醋酸、乳酸、 琥珀酸等有機(jī)酸類等。
[0115] 作為氮源，可以使用氨、氯化銨、硫酸銨、碳酸銨、醋酸銨等各種無(wú)機(jī)及有機(jī)銨鹽 類；尿素、胺等氮化合物；以及肉提取物、酵母提取物、玉米漿、蛋白胨、大豆水解物等含氮 有機(jī)物。
[0116] 作為無(wú)機(jī)鹽，可以使用磷酸一氫鉀、磷酸二氫鉀、硫酸銨、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞 鐵、碳酸f丐等。
[0117] 此外，可以根據(jù)需要加入生物素、硫胺、煙酰胺、煙酸等微量營(yíng)養(yǎng)源。這些微量營(yíng)養(yǎng) 源也可以用肉提取物、玉米漿、酪蛋白氨基酸等培養(yǎng)基添加物替代。另外，可以根據(jù)需要添 加本發(fā)明的微生物生長(zhǎng)所需要的物質(zhì)（例如如果是氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型微生物則為所需要 的氨基酸）。
[0118]培養(yǎng)在震蕩培養(yǎng)、深部通氣攪拌培養(yǎng)等好氧條件下進(jìn)行。培養(yǎng)溫度為20?50°C， 優(yōu)選為20?42°C，更優(yōu)選為28?38°C。培養(yǎng)基的pH保持在5?11的范圍、優(yōu)選6?9的 中性附近的范圍進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)基的pH的調(diào)節(jié)使用無(wú)機(jī)或有機(jī)酸、堿溶液、尿素、碳酸鈣、 氨、pH緩沖液等進(jìn)行。
[0119] 培養(yǎng)時(shí)間為5小時(shí)?6天，優(yōu)選為16小時(shí)?3天。
[0120] 在培養(yǎng)物中累積的該氨基酸可以通過(guò)通常的純化方法來(lái)收集。例如L-精氨酸可 以通過(guò)在培養(yǎng)后，利用離心分離等除去菌體及固體物質(zhì)，然后組合使用活性炭處理、離子交 換樹脂處理、濃縮、結(jié)晶分離等公知的方法來(lái)收集。
[0121] 下面示出本申請(qǐng)發(fā)明的實(shí)施例，但本發(fā)明并不限定于這些實(shí)施例。
[0122] 實(shí)施例1
[0123] (1)基因破壞用質(zhì)粒的構(gòu)建
[0124] 將具有賦予對(duì)卡那霉素的抗性的基因的質(zhì)粒pHSG299[GENE，1987年，第61卷， p63?p74]用限制酶PstI消化，在切斷位點(diǎn)連接含有源自Bacillussubtilisl68株 的果聚糖蔗糖酶基因sacB的2.6千堿基（以下簡(jiǎn)稱為kb)的DNA片段[MOLE⑶LAR 100?081011?￥，1992 年，第6卷，第9期，？1195?口1202]，從而得到質(zhì)粒？￡3830。
[0125] 將pESB30用限制酶BamHI消化，萃取純化后，將該DNA片段的兩末端使用DNA平 端化試劑盒〇NA blunting kit、Takara Bio公司制）按照所附的方法進(jìn)行平滑化。使平 滑化的DNA片段在Taq聚合酶（Boehringer Mannheim公司制）及dTTP存在下在70°C反 應(yīng)2小時(shí)，在3'末端添加胸腺嘧啶1個(gè)堿基，從而制備可以用于PCR片段克隆的DAN片段 PESB30-T。
[0126] (2)argF基因破壞株生成用質(zhì)粒的構(gòu)建
[0127] 以谷氨酸棒桿菌ATCC13032株的染色體DNA為模板，以由序列號(hào)5所示的核苷酸 序列構(gòu)成的DNA和由序列號(hào)6所示的核苷酸序列構(gòu)成的DNA為引物組，使用PfuturboDNA 聚合酶（Stratagene公司制）及所附的緩沖劑進(jìn)行PCR。將通過(guò)PCR而得到的約1. 4kb的 DNA片段用BamHI消化，然后進(jìn)行萃取純化。
[0128] 將該DNA片段和預(yù)先利用BamHI消化的pUCl19(TakaraBio公司制）混合，使用 DNA連接反應(yīng)試劑盒（TakaraBio公司制），進(jìn)行DNA連接酶反應(yīng)。使用該反應(yīng)產(chǎn)物根據(jù)分 子克隆第3版中記載的方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a株（東洋紡公司制）。
[0129] 由該轉(zhuǎn)化體根據(jù)堿SDS法（分子克隆第3版中記載的方法）制備質(zhì)粒。將該質(zhì)粒 利用Ncol消化后，通過(guò)進(jìn)行DNA連接酶反應(yīng)使其自環(huán)化，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a株（東 洋紡公司制），與上述同樣地制備質(zhì)粒。
[0130] 對(duì)該質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)通過(guò)多種限制酶消化模式進(jìn)行研究，結(jié)果確認(rèn)，該質(zhì)粒在編碼 argF的DNA中含有缺失369堿基對(duì)的DNA片段。將該質(zhì)粒用作模板，將由序列號(hào)5所示的 核苷酸序列構(gòu)成的DNA及由序列號(hào)6所示的核苷酸序列構(gòu)成的DNA用作引物組，進(jìn)行PCR， 從而得到約l.Okb的DNA片段。使該DNA片段在TaqDNA聚合酶（BoehringerMannheim 公司制）及dATP存在下在72°C反應(yīng)10分鐘，在3'末端添加腺嘌呤1個(gè)堿基。
[0131] 將該DNA片段和前面生成的pESB30-T混合，進(jìn)行DNA連接酶反應(yīng)。使用該反應(yīng)產(chǎn) 物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci株（東洋紡公司制）從而由所得到的轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒。將該質(zhì)粒命 名為pEargF。
[0132] (3)argF基因破壞株的制備
[0133] 使用如上制備的質(zhì)粒pEargF，根據(jù)Rest等人的方法[APPLLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY，1999年，第52卷，第4期，p541?p545]利用電穿孔法轉(zhuǎn)化缺失轉(zhuǎn)座子的 谷氨酸棒桿菌ATCC13032株（以下稱為D0I-3株），并選擇卡那霉素抗性株。
[0134] 制備該卡那霉素抗性株的染色體DNA，利用Southern雜交（分子克隆第3版）進(jìn) 行研究，結(jié)果確認(rèn)，pEargF通過(guò)Campbell類型的同源重組而被整合。
[0135] 在這樣的菌株中，含有染色體上本來(lái)存在的argF基因的區(qū)域和具有其中pEargF 上缺失了argF基因的結(jié)構(gòu)的區(qū)域相鄰存在，在其之間容易發(fā)生第2次的同源重組。
[0136] 由于_基因編碼的果聚糖蔗糖酶使蔗糖成為自殺底物，因此，具有_基因的 微生物在含有蔗糖的培養(yǎng)基中無(wú)法生長(zhǎng)。但是，在含有染色體上本來(lái)存在的argF基因的區(qū) 域和具有其中pEargF上缺失了argF基因的結(jié)構(gòu)的區(qū)域之間發(fā)生了第2次同源重組的菌株 中，任一DNA區(qū)域均與一同脫落缺失，因此，該菌株在含有蔗糖的培養(yǎng)基中也可以生 長(zhǎng)。這樣可以得到具有缺失了染色體DNA上本來(lái)存在的argF基因的結(jié)構(gòu)的微生物。
[0137] 利用這個(gè)將上述轉(zhuǎn)化株涂布在蔗糖瓊脂培養(yǎng)基[在水1L中含有100g蔗糖、7g肉 提取物、l0g蛋白胨、3g氯化鈉、5g酵母提取物（Difco公司制）、及15g細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂 (Difco公司制）的調(diào)節(jié)為pH7. 2的培養(yǎng)基]上，在30°C下培養(yǎng)1天并選擇生長(zhǎng)的菌落。將 該菌株命名為D0I-3argF株。
[0138] ⑷argF基因破壞株的營(yíng)養(yǎng)缺陷型的確認(rèn)
[0139] D0I_3argF株在argF基因內(nèi)具有缺失，因此為L(zhǎng)-瓜氨酸及L-精氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型。 這根據(jù)D0I-3argF株在基本培養(yǎng)基中不生長(zhǎng)，但是在基本培養(yǎng)基中添加了 50mg/L的L-精 氨酸或50mg/L的L-瓜氨酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)得到確認(rèn)。
[0140] 實(shí)施例2
[0141] (l)NCgll278基因破壞株生成用質(zhì)粒的構(gòu)建
[0142] 以谷氨酸棒桿菌ATCC13032株的染色體DNA為模板，以由序列號(hào)7所示的核苷酸 序列構(gòu)成的DNA和由序列號(hào)8所示的核苷酸序列構(gòu)成的DNA為反應(yīng)1的引物組，以由序列 號(hào)9所不的核苷酸序列構(gòu)成的DNA和由序列號(hào)10所不的核苷酸序列構(gòu)成的DNA為反應(yīng)2 的引物組，獨(dú)立地進(jìn)行反應(yīng)1和反應(yīng)2的PCR。
[0143] 將通過(guò)PCR所得到的約1. Okb的DNA片段萃取、純化。以由反應(yīng)1所得到的DNA 片段和由反應(yīng)2所得到的DNA片段為模板DNA，以由序列號(hào)7所示的核苷酸序列構(gòu)成的DNA 和由序列號(hào)10所示的核苷酸序列構(gòu)成的DNA為反應(yīng)3的引物組，進(jìn)行PCR。將通過(guò)PCR所 得到的約1. 〇kb的DNA片段純化，用限制酶Fbal消化，并再次純化。
[0144] 將該DNA片段和預(yù)先利用限制酶BamHI消化并利用堿性磷酸酶（TakaraBio公司 制）脫磷酸化的PESB30混合，進(jìn)行DNA連接酶反應(yīng)。用該反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a株 (東洋紡公司制），并由該轉(zhuǎn)化株制備質(zhì)粒。將該質(zhì)粒命名為pdell278。
[0145] (2)argF及NCgl1278基因破壞株的制備
[0146] 使用制備的質(zhì)粒pdell278,與實(shí)施例1同樣地利用電穿孔法轉(zhuǎn)化D0I_3argF株， 從而得到卡那霉素抗性株。下面，使用與實(shí)施例1中所記載的方法同樣的方法制備其中 NCgll278的0RF缺失的菌株，將其命名為D0I-3argF_Dell278株。
[0147] (3)NCgll278基因產(chǎn)物的L-瓜氨酸及L-精氨酸攝取活性的確認(rèn)
[0148] 如表1所示，D0I-3argF_Dell278株在含有50mg/L的L-精氨酸的基本培養(yǎng)基瓊 脂板上或含有50mg/L的L-瓜氨酸的基本培養(yǎng)基瓊脂板上不生長(zhǎng)，在含有50mg/L的丙氨酰 精氨酸的基本培養(yǎng)基瓊脂板上生長(zhǎng)，因此結(jié)論是NCgl1278為編碼參與L-精氨酸及L-瓜氨 酸向細(xì)胞內(nèi)的攝取的蛋白質(zhì)的基因。
[0149] 在非專利文獻(xiàn)8中，描述了NCgll278與作為緊接在下游的2個(gè)基因的由序列號(hào)1 的1312?2157所示的核苷酸序列構(gòu)成的NCgl1277、由序列號(hào)1的2173?2925所示的核 苷酸序列構(gòu)成的NCgll276 -同分類為ATP結(jié)合盒（ABC)超家族。
[0150] 由此啟示，NCgl1276、NCgl1277及NCgl1278的基因產(chǎn)物構(gòu)成分類為ATP結(jié)合超家 族的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，并參與L-精氨酸及L-瓜氨酸向細(xì)胞內(nèi)的攝取活性。
[0151] [表 1]
[0152]

【權(quán)利要求】
1. 一種選自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鳥氨酸組成的組中的1種以上氨基酸的制造 方法，其特征在于，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)如下棒狀細(xì)菌，使選自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鳥氨 酸組成的組中的1種以上氨基酸在培養(yǎng)物中生成并累積，并從該培養(yǎng)物中收集該氨基酸， 在所述棒狀細(xì)菌中，通過(guò)向親株的染色體DNA上存在的編碼選自由以下[1]?[6]組成的 組中的蛋白質(zhì)的1個(gè)以上基因中引入1個(gè)以上的核苷酸的缺失、取代或添加，由此與親株相 t匕，選自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鳥氨酸組成的組中的1種以上氨基酸的攝取活性降 低或喪失，并且所述棒狀細(xì)菌能夠生產(chǎn)該氨基酸， [1] 具有序列號(hào)2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì) [2] 具有序列號(hào)3所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì) [3] 具有序列號(hào)4所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì) [4] 由與序列號(hào)2所示的氨基酸序列具有80%以上一致性的氨基酸序列構(gòu)成，且具有 該氨基酸的攝取活性的蛋白質(zhì) [5] 由與序列號(hào)3所示的氨基酸序列具有80%以上一致性的氨基酸序列構(gòu)成，且具有 該氨基酸的攝取活性的蛋白質(zhì) [6] 由與序列號(hào)4所示的氨基酸序列具有80%以上一致性的氨基酸序列構(gòu)成，且具有 該氨基酸的攝取活性的蛋白質(zhì)。
2. 如權(quán)利要求1所述的制造方法，其特征在于，通過(guò)向親株的染色體DNA上存在的編碼 選自由權(quán)利要求1的[1]?[6]組成的組中的蛋白質(zhì)的1個(gè)以上基因中引入1個(gè)以上的核 苷酸的缺失、取代或添加，由此與親株相比，選自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鳥氨酸組成 的組中的1種以上氨基酸的攝取活性降低或喪失，且能夠生產(chǎn)該氨基酸的棒狀細(xì)菌為向親 株的染色體DNA上存在的選自由以下[7]?[9]組成的組中的DNA中引入了 1個(gè)以上的核 苷酸的缺失、取代或添加的棒狀細(xì)菌， [7] 具有序列號(hào)1所示的核苷酸序列的DNA [8] 與由與序列號(hào)1所示的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列構(gòu)成的DNA在嚴(yán)格條件下雜 交，且編碼具有該氨基酸的攝取活性的蛋白質(zhì)的DNA [9] 由與序列號(hào)1所示的核苷酸序列具有80%以上一致性的核苷酸序列構(gòu)成，且編碼 具有該氨基酸的攝取活性的蛋白質(zhì)的DNA。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的制造方法，其中，棒狀細(xì)菌為谷氨酸棒桿菌。
4. 如權(quán)利要求1?3中任一項(xiàng)所述的制造方法，其中，氨基酸為L(zhǎng)-精氨酸或L-瓜氨 酸。
【文檔編號(hào)】C12N15/09GK104271754SQ201380019752
【公開(kāi)日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2013年4月12日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月13日
【發(fā)明者】三橋敏 申請(qǐng)人:協(xié)和發(fā)酵生化株式會(huì)社