轉(zhuǎn)移因子溶液及其制劑中游離氨基酸含量的高效液相色譜檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥分析領(lǐng)域，涉及一種利用高效液相色譜檢測(cè)轉(zhuǎn)移因子溶液及其制 劑中游離氨基酸含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 轉(zhuǎn)移因子（transterfactor，簡(jiǎn)稱TF)又稱傳輸因子，由具有細(xì)胞性免疫功能的 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，作為一種特定的細(xì)胞因子參與機(jī)體的免疫反應(yīng)，能提高動(dòng)物機(jī)體細(xì)胞免疫 功能，促進(jìn)機(jī)體抗感染和防御能力。轉(zhuǎn)移因子屬于多肽類物質(zhì)，是由多核苷酸、多肽及其他 成分組成的復(fù)合分子。其中小分子肽類物質(zhì)是轉(zhuǎn)移因子的功能標(biāo)示物，并作為其主要功效 成分。而氨基酸是組成多肽的基本單元，是轉(zhuǎn)移因子的關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)。因此，準(zhǔn)確測(cè)定轉(zhuǎn)移 因子中的游離氨基酸含量對(duì)于優(yōu)化轉(zhuǎn)移因子生產(chǎn)工藝及控制產(chǎn)品質(zhì)量具有重要的意義。
[0003] 迄今為止，已有較多關(guān)于采用高效液相色譜法對(duì)轉(zhuǎn)移因子中游離氨基酸進(jìn)行檢測(cè) 的報(bào)道，但由于轉(zhuǎn)移因子組分復(fù)雜，報(bào)道的檢測(cè)方法測(cè)定色譜圖中，存在相鄰組分峰間有較 大程度重疊的情況，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)較大偏差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種轉(zhuǎn)移因子溶液及其制劑中游離氨基酸含量的高效液 相色譜檢測(cè)方法，其能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)移因子中游離氨基酸進(jìn)行準(zhǔn)確定量，顯著改善相鄰組分 峰間的重疊程度。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：
[0006] 1)制備供試品溶液；
[0007] 2)供試品溶液的衍生
[0008] 精密量取所述供試品溶液2.OmL，并置于10mL具塞試管中；然后向所述具塞試管 中加入0.lmol/L異硫氰酸苯酯乙腈溶液0. 8~1.OmL以及l(fā)mol/L三乙胺乙腈溶液0. 4~ 0. 6mL并搖勻，然后于室溫下反應(yīng)1~2小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后用正己烷萃取，取萃取得到的下層 溶液用濾膜過濾，收集濾液，得衍生后的供試品溶液；
[0009] 3)測(cè)定
[0010] 精密量取衍生后的供試品溶液，并注入高效液相色譜儀，以〇. 05~0.lmol/L醋 酸鈉緩沖溶液為流動(dòng)相A，以甲醇、乙腈和水的混合液為流動(dòng)相B，利用流動(dòng)相A與流動(dòng)相B進(jìn)行梯度洗脫，記錄色譜圖，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程求出供試品中游離氨基酸含量，所述梯 度洗脫中流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為：0min時(shí)為97:3,15min時(shí)為88:12,20min時(shí)為 85:15, 50min時(shí)為 50:50, 50.lmin時(shí)為 0:100, 55min時(shí)為 0:100, 56min時(shí)為 97:3, 70min時(shí) 為 97:3。
[0011] 所述供試品溶液的制備方法為：精密量取固體轉(zhuǎn)移因子制劑的水溶液、液體轉(zhuǎn)移 因子制劑或轉(zhuǎn)移因子溶液并置于量瓶中，加水稀釋至刻度后搖勻，得供試品溶液。
[0012] 所述供試品溶液中多肽的質(zhì)量濃度為0. 4~0. 6mg/mL。
[0013] 所述高效液相色譜儀的色譜柱填充劑采用十八烷基硅烷鍵合硅膠；所述十八烷基 硅烷鍵合硅膠的粒度為5~10ym，優(yōu)選5ym;所述色譜柱的內(nèi)徑為2~5mm，優(yōu)選4. 6mm; 所述色譜柱的長(zhǎng)度為10~30cm，優(yōu)選25cm。
[0014] 所述流動(dòng)相A的pH值為6. 0~6. 5,優(yōu)選6. 3 (用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值）；所述流動(dòng)相B中甲醇：乙腈：水的體積比為（15~25): (55~65): (15~25)，優(yōu)選為（20:60:20)。
[0015] 所述檢測(cè)方法中，檢測(cè)波長(zhǎng)為210~320nm，優(yōu)選254nm。
[0016] 所述檢測(cè)方法中，進(jìn)樣量為1~50yL，優(yōu)選2yL。
[0017] 所述檢測(cè)方法中，洗脫流速為0. 5~2mL/min，優(yōu)選lmL/min。
[0018] 所述檢測(cè)方法中，柱溫為20~50°C，優(yōu)選35°C。
[0019] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)至少在于：采用高效液相色譜法測(cè)定轉(zhuǎn)移因子溶 液及其制劑中游離氨基酸的含量，通過篩選流動(dòng)相組成以及梯度洗脫的體積比，使液相色 譜圖中各氨基酸峰峰形好，分離度高，大大降低了相鄰組分峰間的重疊比例，提高了檢測(cè)準(zhǔn) 確度，適用于轉(zhuǎn)移因子溶液及其相關(guān)制劑中的游離氨基酸的檢測(cè)，以便對(duì)轉(zhuǎn)移因子的生產(chǎn) 及其制劑實(shí)施有效的監(jiān)督控制。
[0020] 通過篩選色譜柱、流動(dòng)相pH值、色譜柱柱溫等措施，進(jìn)一步確定了最優(yōu)檢測(cè)色譜 條件，進(jìn)一步提高了檢測(cè)準(zhǔn)確度，液相色譜圖中各氨基酸峰分離度得到提高。
【附圖說明】
[0021] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例中18種氨基酸對(duì)照品溶液的液相色譜圖。
[0022] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例中轉(zhuǎn)移因子溶液供試品的液相色譜圖。
[0023] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例中轉(zhuǎn)移因子口服溶液供試品的液相色譜圖。
[0024] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例中轉(zhuǎn)移因子膠囊供試品的液相色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是，這些實(shí)施例僅 是用于說明本發(fā)明，而不是對(duì)本發(fā)明范圍的限制。
[0026] 本發(fā)明依據(jù)18種常見氨基酸的性質(zhì)及轉(zhuǎn)移因子溶液中所含游離氨基酸的情況， 建立檢測(cè)色譜條件；對(duì)建立的色譜條件進(jìn)行系統(tǒng)的方法學(xué)驗(yàn)證研宄，并由對(duì)照品圖譜中氨 基酸濃度與氨基酸峰面積之間存在的線性關(guān)系，實(shí)現(xiàn)對(duì)游離氨基酸含量的準(zhǔn)確測(cè)定。以及， 利用所述檢測(cè)色譜條件對(duì)不同批次轉(zhuǎn)移因子溶液及其制劑樣品進(jìn)行游離氨基酸含量測(cè)定， 驗(yàn)證了方法的適用性。氨基酸對(duì)照品包括門冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨 酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨 酸、色氨酸及鹽酸賴氨酸。
[0027] 1.色譜條件
[0028] 采用Dionex高效液相色譜儀，使用填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠的色譜柱（島 津，Shim-packVP_0DS，4. 6mmX250mm，5iim);以0.lmol/L醋酸鈉緩沖溶液（用冰醋酸調(diào)節(jié) pH值為6. 3)為流動(dòng)相A，甲醇-乙腈-水（甲醇：乙腈：水的體積比20:60: 20)為流動(dòng)相 B，照下表進(jìn)行梯度洗脫；流速為每分鐘1.OmL，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm，柱溫為35°C，進(jìn)樣體積為 2uL〇
[0029] 表1洗脫梯度時(shí)間表
[0031] 2.標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定：
[0032] 對(duì)照品貯備液的制備精密稱取18種常見氨基酸對(duì)照品：門冬氨酸對(duì)照品 12.Omg、谷氨酸對(duì)照品13. 5mg、絲氨酸對(duì)照品13. 5mg、甘氨酸對(duì)照品12.Omg、組氨酸對(duì)照品 20.Omg、精氨酸對(duì)照品20.Omg、蘇氨酸對(duì)照品17. 5mg、丙氨酸對(duì)照品12.Omg、脯氨酸對(duì)照品 15.Omg、酪氨酸對(duì)照品17.Omg、繳氨酸對(duì)照品11.Omg、甲硫氨酸對(duì)照品12.Omg、胱氨酸對(duì)照 品17.Omg、異亮氨酸對(duì)照品12. 5mg、亮氨酸對(duì)照品12. 5mg、苯丙氨酸對(duì)照品17.Omg、色氨酸 對(duì)照品15.Omg、鹽酸賴氨酸對(duì)照品10.Omg，分置于50mL量瓶中，加0.lmol/L鹽酸溶解并稀 釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液。
[0033] 標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液的制備以其中一種氨基酸對(duì)照品為例，分別精密量取對(duì)照品 貯備液0. 5mL、2mL、5mL、10mL，分置于20mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勾，作為對(duì)照品溶液 1~4 ;對(duì)照品溶液5同對(duì)照品貯備液。