人胚胎干細(xì)胞向胰腺內(nèi)胚層的分化的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了促進(jìn)多能干細(xì)胞分化的方法。具體地講，本發(fā)明提供產(chǎn)生胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞群的方法，其中未分化多能細(xì)胞的初始接種密度被限定。
【專利說明】人胚胎干細(xì)胞向胰腺內(nèi)胚層的分化
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2012年5月7日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)61/643, 684的權(quán)益， 所述美國臨時(shí)專利申請(qǐng)全文以引用方式并入本文用于任何目的。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003] 本發(fā)明在細(xì)胞分化領(lǐng)域中。更具體地講，本發(fā)明提供各種范圍的接種密度的人多 能細(xì)胞和/或表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞，其可用于隨后高效生成表達(dá)指示胰腺 內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞和表達(dá)指示胰腺內(nèi)分泌的標(biāo)志物的細(xì)胞。

【背景技術(shù)】
[0004] 用于I型糖尿病的細(xì)胞替代療法的進(jìn)展以及可移植胰島的缺乏已使得注意力集 中在開發(fā)適于移植物移入的胰島素生成細(xì)胞或0細(xì)胞的來源上。一種方法是從多能干細(xì) 胞，例如胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生功能性0細(xì)胞。
[0005] 在脊椎動(dòng)物的胚胎發(fā)育中，多能干細(xì)胞可在稱為原腸胚形成的過程中產(chǎn)生包括三 個(gè)胚層（外胚層、中胚層和內(nèi)胚層）的一組細(xì)胞。組織例如甲狀腺、胸腺、胰腺、腸和肝將從 內(nèi)胚層經(jīng)由中間階段發(fā)育而來。該過程中的中間階段是形成定形內(nèi)胚層。定形內(nèi)胚層細(xì)胞 表達(dá)多種標(biāo)志物，例如HNF3P、GATA4、MIXL1、CXCR4和S0X17。
[0006] 到原腸胚形成為止，內(nèi)胚層劃分成可通過一組因子的表達(dá)來識(shí)別的前-后域，所 述因子獨(dú)特標(biāo)志內(nèi)胚層的前、中和后區(qū)。例如，Hhex和Sox2鑒定內(nèi)胚層的前區(qū)，而Cdxl、2 和4鑒定內(nèi)胚層的后半部分。
[0007] 內(nèi)胚層組織的遷移使內(nèi)胚層與不同的中胚層組織緊密接近，這幫助腸管的區(qū)域 化。這通過多種分泌因子例如？6?、1拉、16?-8、視黃酸（狀）和81^配體及其拮抗劑來完成。 例如，F(xiàn)GF4和BMP促進(jìn)預(yù)定的后腸內(nèi)胚層中的Cdx2表達(dá)并阻遏前基因Hhex和S0X2的表達(dá) (2000Development，127 :1563-1567)。WNT信號(hào)傳導(dǎo)也已顯示與FGF信號(hào)傳導(dǎo)平行工作， 以促進(jìn)后腸發(fā)育并抑制前腸命運(yùn)（2007Development，134:2207-2217)。最后，由間充質(zhì)分 泌的視黃酸調(diào)節(jié)前腸-后腸邊界（2002CurrBiol，12:1215-1220)。
[0008] 特異性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平可用于指定組織的身份。在定形內(nèi)胚層轉(zhuǎn)化成原腸管 的過程中，腸管變得區(qū)域化成廣泛域，所述廣泛域可通過限制性基因表達(dá)模式在分子水平 上進(jìn)行觀察。例如，腸管中區(qū)域化的胰腺域顯示I3DX-I的極高表達(dá)以及⑶X2和S0X2的極 低表達(dá)。相似地，高水平的Foxel的存在指示食道組織；在肺組織中高度表達(dá)的是NKX2. 1 ; S0X2/0ddl(OSRl)在胃組織中高度表達(dá)；PROXl/Hhex/AFP的表達(dá)在肝組織中比較高；S0X17 在膽道結(jié)構(gòu)組織中高度表達(dá)；PDX1、NKX6. 1/PTfla和NKX2. 2在胰腺組織中高度表達(dá)；并且 CDX2的表達(dá)在腸組織中高。上文概括摘自DevDyn2009,238:29-42和AnnuRevCellDev Biol2009,25 :221-251。
[0009] 胰腺的形成起于定形內(nèi)胚層分化成胰腺內(nèi)胚層（2009AnnuRevCellDevBiol, 25 :221-251 ;2009DevDyn，238:29-42)。背側(cè)和腹側(cè)胰腺域起于前腸上皮。前腸也產(chǎn)生 食道、氣管、肺、甲狀腺、胃、肝、胰腺和膽管系統(tǒng)。
[0010] 胰腺內(nèi)胚層的細(xì)胞表達(dá)胰-十二指腸同源盒基因roxi。在不存在roxi時(shí)，胰腺形 成腹胰芽和背胰芽后不再發(fā)育。因而，roxi表達(dá)標(biāo)志著胰腺器官發(fā)生中的一個(gè)關(guān)鍵步驟。 除了其他細(xì)胞類型，成熟的胰腺還包括外分泌組織和內(nèi)分泌組織。外分泌和內(nèi)分泌組織來 自胰腺內(nèi)胚層的分化。
[0011]D'Amour等人描述了在高濃度激活素和低血清的存在下，產(chǎn)生人胚胎干細(xì)胞（ES) 衍生的定形內(nèi)胚層的富集培養(yǎng)物（NatureBiotechnol2005,23:1534-1541;美國專利 7, 704, 738)。將這些細(xì)胞移植在小鼠的腎囊下導(dǎo)致分化成具有內(nèi)胚層組織特征的更成熟的 細(xì)胞（美國專利7, 704, 738)。在添加FGF-IO和視黃酸后，人胚胎干細(xì)胞衍生的定形內(nèi)胚層 細(xì)胞還可分化成I3DXl陽性細(xì)胞（美國專利公布2005/0266554A1)。這些胰腺前體細(xì)胞在免 疫缺陷小鼠的脂肪墊中的后續(xù)移植導(dǎo)致在3-4個(gè)月成熟期后形成功能胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞（美 國專利7, 993, 920和美國專利7, 534, 608)。
[0012]Fisk等人報(bào)道用于由人胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生胰島細(xì)胞的系統(tǒng)（美國專利7, 033, 831)。 在這種情況下，分化途徑分成三個(gè)階段。人胚胎干細(xì)胞首先使用丁酸鈉和激活素A的組合 而分化成內(nèi)胚層（美國專利7,326,572)。然后將細(xì)胞和與￡6?或0細(xì)胞素〇3的 &(^11111111) 結(jié)合的bmp拮抗劑例如頭蛋白一起培養(yǎng)，以生成roxi陽性細(xì)胞。通過煙酰胺誘導(dǎo)終末分化。
[0013] 小分子抑制劑也已用于誘導(dǎo)胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞。例如，TGF-B受體和BMP受體 的小分子抑制劑（Development2011,138 :861-871;Diabetes2011,60:239-247)已用 于顯著提高胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的數(shù)目。另外，小分子活化劑也已用于生成定形內(nèi)胚層細(xì)胞 或胰腺前體細(xì)胞（CurrOpinCellBiol2009,21:727-732;NatureChemBiol2009,5: 258-265)。
[0014] 雖然已在改善由人多能干細(xì)胞生成胰腺細(xì)胞的方案方面取得重大進(jìn)展，但不同團(tuán) 隊(duì)所報(bào)道的有關(guān)由ES細(xì)胞生成胰腺細(xì)胞的效率的結(jié)果存在很大程度的可變性。該可變性 歸因于多種因素，諸如ES細(xì)胞系的差異、方案（包括所用的試劑）的持續(xù)時(shí)間、以及貼壁培 養(yǎng)與懸浮培養(yǎng)的選擇。我們?cè)诖俗C實(shí)了雖然引導(dǎo)ES細(xì)胞分化成定形內(nèi)胚層的效率對(duì)于細(xì) 胞密度并不非常敏感，但生成胰腺內(nèi)胚層的效率高度依賴于ES細(xì)胞的初始接種密度。具體 地講，在0. 8-2XIO5個(gè)細(xì)胞/cm2范圍內(nèi)的初始細(xì)胞密度導(dǎo)致胰腺內(nèi)胚層和內(nèi)分泌標(biāo)志物的 最商表達(dá)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及培養(yǎng)多能干細(xì)胞的方法，該方法包括將多能干細(xì)胞 接種于表面上，其中以約0. 8XIO5個(gè)細(xì)胞/cm2至約3. 0XIO5個(gè)細(xì)胞/cm2的密度接種多能 干細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，所培養(yǎng)的多能干細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，所培養(yǎng)的 多能干細(xì)胞是人胚胎干細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，接種多能干細(xì)胞的表面包括Matrigel?。 [0016] 在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及使多能干細(xì)胞分化的方法，該方法包括將多能干細(xì) 胞以約0. 8XIO5個(gè)細(xì)胞/cm2至約3.OXIO5個(gè)細(xì)胞/cm2的密度接種于表面上，以及使多能 干細(xì)胞分化成表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，所分化的多能干細(xì) 胞是胚胎干細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，所分化的多能干細(xì)胞是人胚胎干細(xì)胞。在一些實(shí)施例 中，接種多能干細(xì)胞的表面包括Matrigel?。在一些實(shí)施例中，表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志 物的細(xì)胞是人的。
[0017] 在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及獲得表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞的方法， 該方法包括使以約0. 8XIO5個(gè)細(xì)胞/cm2至約3. 0XIO5個(gè)細(xì)胞/cm2的接種密度接種于表面 上的多能干細(xì)胞分化。在一些實(shí)施例中，在獲得表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞的方 法中使用的多能干細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，在獲得表達(dá)定形內(nèi)胚層特征性標(biāo) 志物的細(xì)胞的方法中使用的胚胎干細(xì)胞是人胚胎干細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，多能干細(xì)胞接 種在包括Matrigel?的表面上。在一些實(shí)施例中，表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞是 人的。
[0018] 在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供使表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞分化的方 法，該方法包括使已以足以使多能干細(xì)胞向表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞分化的效 率最大化的接種密度接種于第一表面上的多能干細(xì)胞分化，以及通過將表達(dá)指示定形內(nèi)胚 層的標(biāo)志物的細(xì)胞以足以使表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞向表達(dá)胰腺內(nèi)胚層特征 性標(biāo)志物的細(xì)胞分化的效率最大化的接種密度接種于第二表面上，使表達(dá)指示定形內(nèi)胚層 的標(biāo)志物的細(xì)胞分化成表達(dá)指示胰腺內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞。在本發(fā)明的一些方面中，足 以使多能干細(xì)胞向表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞分化的效率最大化的接種密度為 約0. 8XIO5個(gè)細(xì)胞/cm2至約3.OXIO5個(gè)細(xì)胞/cm2。在本發(fā)明的一些方面中，足以使表達(dá) 指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞向表達(dá)胰腺內(nèi)胚層特征性標(biāo)志物的細(xì)胞分化的效率最大 化的接種密度為約I. 5XIO5個(gè)細(xì)胞/cm2至約5. 0XIO5個(gè)細(xì)胞/cm2。在一些實(shí)施例中，在 使細(xì)胞分化的方法中使用的多能干細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，在使細(xì) 胞分化的方法中使用的胚胎干細(xì)胞是人胚胎干細(xì)胞。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，接種多能 干細(xì)胞的第一表面包括Matrigel?。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，接種表達(dá)指示定形內(nèi)胚層 的標(biāo)志物的細(xì)胞的第二表面包括Matrigel?。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，表達(dá)指示定形內(nèi) 胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞是人的。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，表達(dá)指示胰腺內(nèi)胚層的標(biāo)志物的 細(xì)胞是人的。
[0019] 在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及使表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞分化成表達(dá) 指示胰腺內(nèi)分泌的標(biāo)志物的細(xì)胞的方法，該方法包括使已以約〇. 8XIO5個(gè)細(xì)胞/cm2至約 3.OXIO5個(gè)細(xì)胞/cm2的接種密度接種于表面上的多能干細(xì)胞分化成表達(dá)指示定形內(nèi)胚層 的標(biāo)志物的細(xì)胞，以及使表達(dá)定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞分化成表達(dá)指示胰腺內(nèi)分泌的標(biāo) 志物的細(xì)胞。在本發(fā)明的一些方面中，用于分化成表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞的 多能干細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，用于分化成表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的 細(xì)胞的胚胎干細(xì)胞是人胚胎干細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，將用于分化成表達(dá)指示定形內(nèi)胚層 的標(biāo)志物的細(xì)胞的多能干細(xì)胞接種于包括Matrigel?的表面上。
[0020] 在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及獲得表達(dá)指示胰腺內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞的方法， 該方法包括將多能干細(xì)胞接種于表面上，使多能干細(xì)胞分化成表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo) 志物的細(xì)胞，將表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞接種于表面上，以及使表達(dá)指示定形 內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞分化成表達(dá)指示胰腺內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞。在本發(fā)明的一些 方面中，將在獲得表達(dá)指示胰腺內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞的方法中使用的多能干細(xì)胞以約 0. 8XIO5個(gè)細(xì)胞/cm2至約3. 0XIO5個(gè)細(xì)胞/cm2的密度接種于表面上。在本發(fā)明的一些方 面中，將表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞以約I. 5XIO5個(gè)細(xì)胞/cm2至約5.OXIO5個(gè) 細(xì)胞/cm2的密度接種于表面上。在本發(fā)明的一些方面中，分化成表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo) 志物的細(xì)胞的多能干細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。在本發(fā)明的一些方面中，分化成表達(dá)指示定形內(nèi) 胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞的胚胎干細(xì)胞是人胚胎干細(xì)胞。在本發(fā)明的一些方面中，將多能干細(xì) 胞接種于包括Matrigel?的表面上。在本發(fā)明的一些方面中，將表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo) 志物的細(xì)胞接種于包括Matrigel?的表面上。
[0021] 在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及獲得表達(dá)指示胰腺內(nèi)分泌的標(biāo)志物的細(xì)胞的方法， 該方法包括將多能干細(xì)胞接種于表面上；使多能干細(xì)胞分化成表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志 物的細(xì)胞；以及使表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞分化成表達(dá)指示胰腺內(nèi)分泌的標(biāo)志 物的細(xì)胞。在本發(fā)明的一些方面中，將在獲得表達(dá)指示胰腺內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞的方法 中使用的多能干細(xì)胞以約〇.8XIO5個(gè)細(xì)胞/cm2至約3. 0XIO5個(gè)細(xì)胞/cm2的密度接種于表 面上。在本發(fā)明的一些方面中，將表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞以約I. 5XIO5個(gè)細(xì) 胞/cm2至約5. 0XIO5個(gè)細(xì)胞/cm2的密度接種于表面上。在本發(fā)明的一些方面中，分化成表 達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞的多能干細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。在本發(fā)明的一些方面中， 分化成表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞的胚胎干細(xì)胞是人胚胎干細(xì)胞。在本發(fā)明的一 些方面中，將多能干細(xì)胞接種于包括Matrigel?的表面上。在本發(fā)明的一些方面中，將表達(dá) 指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞接種于包括Matrigel?的表面上。
[0022] 在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及使表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞分化的方 法，該方法包括將表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞以約1.5XIO5個(gè)細(xì)胞/cm2至約 5.OXIO5個(gè)細(xì)胞/cm2的接種密度接種于表面上，以及使表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì) 胞分化成表達(dá)指示胰腺內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞。在本發(fā)明的一些方面中，所使用的細(xì)胞是 人的。
[0023] 本發(fā)明提供了通過0. 8XIO5個(gè)多能細(xì)胞/cm2至3XIO5個(gè)多能細(xì)胞/cm2的逐步分 化而體外獲得的表達(dá)指示胰腺內(nèi)胚層譜系的標(biāo)志物的細(xì)胞群。
[0024] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，通過0. 8XIO5個(gè)多能細(xì)胞/cm2至3XIO5個(gè)多能細(xì)胞/ cm2的逐步分化而體外獲得表達(dá)指示胰腺內(nèi)分泌譜系的標(biāo)志物的細(xì)胞。
[0025] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，通過以1.5XIO5個(gè)細(xì)胞/cm2至5XIO5個(gè)細(xì)胞/cm2的 密度接種于表面上的表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞的逐步分化而體外獲得表達(dá)指 示胰腺內(nèi)胚層譜系的標(biāo)志物的細(xì)胞。
[0026] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，通過以I. 5XIO5至5XIO5個(gè)細(xì)胞/cm2接種于表面上 的表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞的逐步分化而體外獲得表達(dá)指示胰腺內(nèi)分泌譜系 的標(biāo)志物的細(xì)胞。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖IA至圖IF示出了以0?3XIO5個(gè)細(xì)胞/cm2 (圖1A)、0. 75XIO5個(gè)細(xì)胞/cm2 (圖 18)、1父105個(gè)細(xì)胞/〇112(圖1〇、1.5\105個(gè)細(xì)胞/〇11 2(圖10)、1.8\105個(gè)細(xì)胞/〇112(圖 1E)和2XIO5個(gè)細(xì)胞/cm2(圖1F)接種的Hl細(xì)胞的CXCR4(Y軸，DE的標(biāo)志物）和CD-9(X 軸，未分化ES細(xì)胞的標(biāo)志物）的FACS直方表達(dá)譜。
[0028] 圖2A至圖2G示出了如實(shí)例1所概述的以各種密度接種并隨后分化為DE的人胚胎 干細(xì)胞系Hl的細(xì)胞中的下列基因的表達(dá)的實(shí)時(shí)PCR分析的數(shù)據(jù)：S0X7(圖2A)、NANOG(圖 2B)、0CT4 (圖 2C)、AFP(圖 2D)、S0X17 (圖 2E)、F0XA2 (圖 2F)和CXCR4 (圖 2G)。
[0029] 圖3A-3H示出了在誘導(dǎo)以如下各種細(xì)胞密度接種的DE之前培養(yǎng)物的相襯圖像： 0? 3XIO5 個(gè)細(xì)胞 /cm2 (圖 3A)、0? 5XIO5 個(gè)細(xì)胞 /cm2 (圖 3B)、0? 75XIO5 個(gè)細(xì)胞 /cm2 (圖 3C)、 0. 9XIO5 個(gè)細(xì)胞/cm2 (圖 3D)、1XIO5 個(gè)細(xì)胞/cm2 (圖 3E)、1.IXIO5 個(gè)細(xì)胞/cm2 (圖 3F)、 1. 2XIO5 個(gè)細(xì)胞 /cm2 (圖 3G)和I. 5XIO5 個(gè)細(xì)胞 /cm2 (圖 3H)。
[0030] 圖4A-4G示出了初始以如下各種ES細(xì)胞的細(xì)胞密度接種的DE第4天培養(yǎng)物的 相襯圖像：〇? 3X105個(gè)細(xì)胞/cm2(圖4A)、0. 5X105個(gè)細(xì)胞/cm2 (圖4B)、0. 75X105個(gè)細(xì)胞 /cm2 (圖 4C)、IXIO5 個(gè)細(xì)胞 /cm2 (圖 4D)、I.IXIO5 個(gè)細(xì)胞 /cm2 (圖 4E)、I. 2XIO5 個(gè)細(xì)胞 / cm2 (圖 4F)和I. 5XIO5 個(gè)細(xì)胞 /cm2 (圖 4G)。
[0031] 圖5A-5F示出了初始以如下各種ES細(xì)胞的細(xì)胞密度接種的第5階段培養(yǎng)物的相 襯圖像：5X104個(gè)細(xì)胞/cm2 (圖5A)、7. 5X104個(gè)細(xì)胞/cm2 (圖5B)、1X105個(gè)細(xì)胞/cm2 (圖 5C)、I. 5XIO5 個(gè)細(xì)胞 /cm2 (圖OT)、I. 8XIO5 個(gè)細(xì)胞 /cm2 (圖 5E)和 2. 0XIO5 個(gè)細(xì)胞 /cm2 (圖 5F)。
[0032] 圖6A至圖6J示出了如實(shí)例2所概述的以各種密度接種并隨后分化為第5階段 的人胚胎干細(xì)胞系Hl的細(xì)胞中的下列基因的表達(dá)的實(shí)時(shí)PCR分析的數(shù)據(jù)：ZICl(圖6A)、 CDX2 (圖 6B)、roX-1 (圖 6C)、NKX6. 1 (圖 6D)、NKX2. 2 (圖 6E)、NGN3 (圖 6F)、NEUROD(圖 6G)、胰島素（圖 6H)、HNF4a(圖 61)和PTFla(圖 6J)。

【具體實(shí)施方式】
[0033] 為了以不受限制的方式清晰說明本公開，將本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】分成下列描述 或闡明本發(fā)明某些特征、實(shí)施例或應(yīng)用的小節(jié)。
[0034] 定義
[0035] 干細(xì)胞是通過其在單細(xì)胞水平上既自我更新又分化的能力來定義的未分化細(xì)胞。 干細(xì)胞可產(chǎn)生子代細(xì)胞，包括自我更新祖細(xì)胞、非更新祖細(xì)胞和終末分化細(xì)胞。干細(xì)胞的特 征還在于其在體外分化成來自多個(gè)胚層（內(nèi)胚層、中胚層和外胚層）的多種細(xì)胞譜系的功 能細(xì)胞的能力。干細(xì)胞還在移植后產(chǎn)生多種胚層的組織，并且在注射到胚泡內(nèi)之后，促成基 本上至大部分（如果不是所有的話）組織。
[0036] 干細(xì)胞通過其發(fā)育潛能分類為：（1)全能的，意指能夠產(chǎn)生所有胚胎和胚胎外細(xì) 胞類型；（2)多能的，意指能夠產(chǎn)生所有胚胎細(xì)胞類型；(3)多潛能的，意指能夠產(chǎn)生細(xì)胞譜 系子系，但全部在特定組織、器官或生理系統(tǒng)內(nèi)（例如造血干細(xì)胞（HSC)可產(chǎn)生的后代包 括HSC(自我更新）、局限于血細(xì)胞的寡能祖細(xì)胞、以及其為正常血液組分的所有細(xì)胞類型 和成分（例如血小板））；(4)寡能的，意指能夠產(chǎn)生比多潛能干細(xì)胞更受限制的細(xì)胞譜系子 系；以及（5)單能的，意指能夠產(chǎn)生單細(xì)胞譜系（例如生精干細(xì)胞）。
[0037] 分化是未特化的（"未定向的"）或特化不足的細(xì)胞獲得特化細(xì)胞（如神經(jīng)細(xì)胞或 肌肉細(xì)胞）的特征的過程。分化的細(xì)胞或誘導(dǎo)分化的細(xì)胞是已在細(xì)胞譜系中占據(jù)更特化的 ("定型的"）位置的細(xì)胞。當(dāng)應(yīng)用于分化的過程時(shí)，術(shù)語"定型的"指在分化途徑中已進(jìn)行 到這樣的點(diǎn)的細(xì)胞：其中在正常環(huán)境下，它繼續(xù)分化成特定的細(xì)胞類型或細(xì)胞類型子集，并 且在正常環(huán)境下，不能分化成不同細(xì)胞類型或回復(fù)到分化程度較低的細(xì)胞類型。"去分化" 指細(xì)胞通過其回復(fù)到在細(xì)胞譜系內(nèi)特化（或定型）程度較低的位置的過程。本文所用的 "細(xì)胞的譜系"限定細(xì)胞的遺傳關(guān)系，即它來自哪些細(xì)胞和它能產(chǎn)生什么細(xì)胞。細(xì)胞譜系將 細(xì)胞定位于發(fā)育和分化的遺傳計(jì)劃內(nèi)。譜系特異性標(biāo)志物指與所關(guān)注譜系的細(xì)胞的表型明 確相關(guān)的特征，可用來評(píng)估未定向細(xì)胞向所關(guān)注譜系的分化。
[0038] 如本文所用的，"標(biāo)志物"是在所關(guān)注細(xì)胞中差異表達(dá)的核酸或多肽分子。在該 語境中，差異表達(dá)意指與未分化細(xì)胞相比陽性標(biāo)志物的水平升高并且陰性標(biāo)志物的水平下 降。標(biāo)志物核酸或多肽的可檢測水平，在所關(guān)注細(xì)胞中充分地高于或低于在其他細(xì)胞中，使 得可使用多種本領(lǐng)域公知的方法中的任何一種將所關(guān)注細(xì)胞與其他細(xì)胞鑒別和區(qū)分開來。
[0039] 如本文所用，當(dāng)在細(xì)胞中檢測到特定標(biāo)志物時(shí)，細(xì)胞對(duì)于"特定標(biāo)志物"是"陽性 的"或是"陽性的"。相似地，當(dāng)在細(xì)胞中未檢測到特定標(biāo)志物時(shí)，細(xì)胞對(duì)于"特定標(biāo)志物"是 "陰性的"或是"陰性的"。
[0040] 如本文所用，"細(xì)胞密度"和"接種密度"在本文可互換使用，并且是指每單位面積 的平坦或彎曲基底所接種的細(xì)胞的數(shù)量。
[0041] 如本文所用，"第1階段"和"S1"在本文中可互換使用，以鑒定表達(dá)定形內(nèi)胚層 (DE)特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。
[0042] 如本文所用，"定形內(nèi)胚層"指這樣的細(xì)胞，其具有在原腸胚形成過程中起于上胚 層的細(xì)胞的特征，并形成胃腸道及其衍生物。定形內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)下述標(biāo)志物中的至少一 種：HNF3P、GATA4、S0X17、CXCR4、Cerberus、0TX2、goosecoid、C-Kit、CD99 和MIXLl。 [0043] 如本文所用，"腸管"指源自定形內(nèi)胚層的細(xì)胞，所述細(xì)胞表達(dá)下述標(biāo)志物中的至 少一種：HNF3-0、HNF1-P*HNF4-a。腸管細(xì)胞可產(chǎn)生所有內(nèi)胚層器官，例如肺、肝、胰腺、 胃和腸。
[0044] 在本文中可互換使用的是"第2階段"和"S2"，其鑒定表達(dá)原腸管特征性標(biāo)志物的 細(xì)胞。
[0045] "前腸內(nèi)胚層"指產(chǎn)生食道、肺、胃、肝、胰腺、膽囊和一部分十二指腸的內(nèi)胚層細(xì) 胞。
[0046]"后前腸"指可產(chǎn)生后胃、胰腺、肝和一部分十二指腸的內(nèi)胚層細(xì)胞。
[0047]"中腸內(nèi)胚層"指可產(chǎn)生腸、一部分十二指腸、盲腸和升結(jié)腸的內(nèi)胚層細(xì)胞。
[0048]"后腸內(nèi)胚層"指可產(chǎn)生橫結(jié)腸遠(yuǎn)端三分之一、降結(jié)腸、乙狀結(jié)腸和直腸的內(nèi)胚層 細(xì)胞。
[0049] "第3階段"和"S3"可互換使用，以鑒定表達(dá)前腸內(nèi)胚層特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。如 本文所用，"表達(dá)前腸譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞"指表達(dá)下述標(biāo)志物中的至少一種的細(xì)胞： PDX-1、F0XA2、CDX2、S0X2 和HNF4a。
[0050] 本文可互換使用的是"第4階段"和"S4"，以鑒定表達(dá)胰腺前腸前體特征性標(biāo)志物 的細(xì)胞。如本文所用，"表達(dá)胰腺前腸前體譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞"指表達(dá)下述標(biāo)志物中 的至少一種的細(xì)胞：PDX-1、NKX6. 1、HNF6、F0XA2、PTFla、Proxl和HNF4a。
[0051] 如本文所用，"第5階段"和"S5"可互換使用，以鑒定表達(dá)胰腺內(nèi)胚層和胰腺內(nèi)分 泌前體細(xì)胞特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。如本文所用的，"表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì) 胞"指表達(dá)下述標(biāo)志物中的至少一種的細(xì)胞：PDX1、NKX6. 1、HNF1P、PTF1a、HNF6、HNF4a、 S0X9、HB9或PROXl。表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞基本上不表達(dá)⑶X2或S0X2。
[0052] 如本文所用，"胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞"或"胰腺激素表達(dá)細(xì)胞"或"表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系 特征性標(biāo)志物的細(xì)胞"指能夠表達(dá)下述激素中的至少一種的細(xì)胞：胰島素、胰高血糖素、生 長抑素、生長素釋放肽和胰多肽。
[0053]"胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞"或"胰腺內(nèi)分泌祖細(xì)胞"指能夠變成胰腺激素表達(dá)細(xì)胞的 胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞。此類細(xì)胞可表達(dá)下述標(biāo)志物中的至少一種：NGN3、NKX2. 2、NeuroD、ISL-l、 Pax4、Pax6 或ARX。
[0054] 本文可互換使用的是"dl"、"d1"和"第I天"；"d2"、"d2"和"第2天"；"d3"、 "d3"和"第3天"等等。這些數(shù)字字母組合指定在本專利申請(qǐng)的逐步分化方案過程中的不 同階段中的溫育天數(shù)。
[0055]"葡萄糖"和"D-葡萄糖"在本文中可互換使用，并且指右旋糖，在自然界中通常發(fā) 現(xiàn)的糖。
[0056] 在本文中可互換使用的是"NeuroD"和"NeuroDl"，其鑒定在胰腺內(nèi)分泌祖細(xì)胞中 表達(dá)的蛋白質(zhì)及其編碼基因。
[0057] 在本文中可互換使用的是"LDN"和"LDN-193189"，以指示可得自Stemgent(CA， USA)的BMP受體抑制劑。
[0058] 多能干細(xì)朐的分離、擴(kuò)增和培養(yǎng)
[0059] 多能干細(xì)胞可表達(dá)階段特異性胚胎抗原（SSEA)3和4以及可用稱為Tra-1-60 和Tra-1-81的抗體檢測的標(biāo)志物中的一種或多種（Thomson等人，1998，Science282 : 1145-1147)。多能干細(xì)胞在體外的分化導(dǎo)致SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81表達(dá)的喪失。 未分化的多能干細(xì)胞通常具有堿性磷酸酶活性，所述堿性磷酸酶活性可通過用4%多聚 甲醛固定細(xì)胞，然后用矢量紅（VectorRed)作為底物顯色來檢測，如由制造商（Vector Laboratories，CA,USA)描述的。如通過RT-PCR檢測的，未分化的多能干細(xì)胞通常也表達(dá) 0CT4 和TERT。
[0060] 增殖多能干細(xì)胞的另一種希望表型是分化成所有三種胚層的細(xì)胞的潛能：內(nèi)胚 層、中胚層和外胚層。多能干細(xì)胞的多能性可例如通過下述加以證實(shí)：將細(xì)胞注射到SCID 小鼠內(nèi)，使用4%多聚甲醛固定所形成的畸胎瘤，然后就來自三個(gè)胚層的細(xì)胞類型的證據(jù)對(duì) 它們進(jìn)行組織學(xué)檢查。作為另一種選擇，多能性可通過這樣來確定：產(chǎn)生胚狀體并評(píng)價(jià)該胚 狀體是否存在與三個(gè)胚層相關(guān)的標(biāo)志物。
[0061] 增殖的多能干細(xì)胞系可以用標(biāo)準(zhǔn)G-顯帶技術(shù)進(jìn)行核型分析并與所公開的相應(yīng)靈 長類物種的核型相比較。理想的是獲得具有"正常核型"的細(xì)胞，"正常核型"的細(xì)胞意指該 細(xì)胞是整倍體，其中所有人染色體都存在并且沒有顯著改變。多能細(xì)胞在培養(yǎng)物中可使用 多種飼養(yǎng)層或通過使用基質(zhì)蛋白質(zhì)涂布的容器容易地?cái)U(kuò)增。作為另外一種選擇，與成分確 定的培養(yǎng)基例如mTeSRl培養(yǎng)基（StemCellTechnologies，Vancouver，Canada)組合的化學(xué) 成分確定的表面可用于常規(guī)細(xì)胞擴(kuò)增。多能細(xì)胞可使用酶促、機(jī)械或使用多種鈣螯合劑例 如EDTA(乙二胺四乙酸）容易地從培養(yǎng)皿中取出。作為另外一種選擇，多能細(xì)胞可在不存 在任何基質(zhì)蛋白質(zhì)或飼養(yǎng)層的情況下懸浮擴(kuò)增。
[0062] 多能干細(xì)朐的來源
[0063] 可使用的多能干細(xì)胞的類型包括源自妊娠后形成的組織的建立的多能細(xì)胞系，包 括在妊娠期間的任何時(shí)間取得的胚胎前組織（例如胚泡）、胚胎組織或胎兒組織，所述時(shí)間 通常但不一定是在大約10至12周妊娠前。非限制性例子是建立的人胚胎干細(xì)胞（hESC) 或人胚胎生殖細(xì)胞系，例如人胚胎干細(xì)胞系HI、H7和H9(WiCellResearchInstitute，Madison,WI，USA)。另外合適的是取自已在不存在飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下培養(yǎng)的多能干細(xì)胞 群體的細(xì)胞。還合適的是誘導(dǎo)多能細(xì)胞（IPS)或重編程的多能細(xì)胞，其可使用多種多能 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的被迫表達(dá)而源自成人體細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)錄因子例如0CT4、NANOG、Sox2、KLF4 和ZFP42(AnnuRevGenomicsHumGenet2011,12:165-185)。在本發(fā)明的方法中使用的 人胚胎干細(xì)胞也可如由Thomson等人描述的進(jìn)行制備（美國專利5, 843, 780 ;Science， 1998,282 :1145-1147；CurrTopDevBiol1998,38 ： 133-165；ProcNatlAcadSci U.S.A. 1995,92 :7844-7848)。
[0064] 由多能干細(xì)朐形成表汰胰腺內(nèi)杯層譜系特征件標(biāo)志物的細(xì)朐
[0065] 多能干細(xì)胞的特征是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，并且多能干細(xì)胞的附加特征不 斷被鑒定。多能干細(xì)胞標(biāo)志物包括例如下述中的一種或多種的表達(dá)：ABCG2、cripto、F0XD3、C0NNEXIN43、C0NNEXIN45、0CT4、S0X2、NAN0G、hTERT、UTF1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra 1-60、Tra1-81。
[0066]適用于本發(fā)明的多能干細(xì)胞包括例如人胚胎干細(xì)胞系H9(NIH代碼：WA09)、人胚 胎干細(xì)胞系H1(NIH代碼：WA01)、人胚胎干細(xì)胞系H7(NIH代碼：WA07)和人胚胎干細(xì)胞系 SA002(Cellartis，Sweden)。還適用于本發(fā)明的是表達(dá)下述多能細(xì)胞特征性標(biāo)志物中的至 少一種的細(xì)胞：ABCG2、cripto、CD9、F0XD3、C0NNEXIN43、C0NNEXIN45、0CT4、S0X2、NAN0G、 hTERT、UTFl、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tral-6(^PTral-81。
[0067] 定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物選自S0X17、GATA4、HNF3P、GSC、CER1、Nodal、 FGF8、Brachyury、Mix樣同源盒蛋白、FGF4、CD48、脫中胚蛋白（EOMES)、DKK4、FGF17、GATA6、 CXCR4、C-Kit、⑶99和0TX2。適用于本發(fā)明的是表達(dá)至少一種定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志 物的細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)方面，表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞是原條前體細(xì) 胞。在另一方面，表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞是中內(nèi)胚層細(xì)胞。在另一方面， 表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞是定形內(nèi)胚層細(xì)胞。
[0068] 胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物選自PDX1、NKX6. 1、HNF1P、PTF1a、HNF6、HNF4a、 S0X9、HB9和PR0X1。適用于本發(fā)明的是表達(dá)至少一種胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì) 胞。在本發(fā)明的一個(gè)方面，表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞是胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞，其 中TOX-I和NKX6. 1的表達(dá)基本上高于⑶X2和S0X2的表達(dá)。
[0069] 胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物選自NGN3、NEUR0D、ISL1、PDX1、NKX6. 1、PAX4、ARX、 NKX2. 2和PAX6。在一個(gè)實(shí)施例中，胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞能夠表達(dá)下述激素中的至少一種：胰島 素、胰高血糖素、生長抑素和胰多肽。適用于本發(fā)明的是表達(dá)至少一種胰腺內(nèi)分泌譜系特征 性標(biāo)志物的細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)方面，表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞是胰腺 內(nèi)分泌細(xì)胞。胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞可以是表達(dá)胰激素的細(xì)胞。作為另外一種選擇，胰腺內(nèi)分泌 細(xì)胞可以是分泌胰腺激素的細(xì)胞。
[0070] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞是表達(dá)P細(xì)胞譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。 表達(dá)P細(xì)胞譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞表達(dá)I3DXl和下述轉(zhuǎn)錄因子中的至少一種：NKX2. 2、 NKX6. 1、NEUR0D、ISL1、HNF3P、MAFA、PAX4和PAX6。在本發(fā)明的一個(gè)方面，表達(dá)P細(xì)胞譜 系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞是P細(xì)胞。
[0071] 本發(fā)明描述了培養(yǎng)人多能干細(xì)胞的方法，該方法包括將人多能干細(xì)胞以約 0.8XIO5個(gè)細(xì)胞/cm2至約3.OXIO5個(gè)細(xì)胞/cm2的密度接種于表面上。在本發(fā)明的一 個(gè)方面，人多能干細(xì)胞是人胚胎干細(xì)胞。在本發(fā)明的一些方面中，接種細(xì)胞的表面包括 Matrigel?。
[0072] 在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及使多能干細(xì)胞分化的方法。該方法包括將多能干細(xì)胞以 約0. 8XIO5個(gè)細(xì)胞/cm2至約3.OXIO5個(gè)細(xì)胞/cm2的密度接種于表面上，然后使多能細(xì)胞 分化成表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞。在本發(fā)明的一些方面中，多能細(xì)胞是胚胎干 細(xì)胞。在本發(fā)明的一些方面中，胚胎干細(xì)胞是人胚胎干細(xì)胞。在本發(fā)明的一些方面中，接種 細(xì)胞的表面包括Matrigel?。
[0073] 本發(fā)明涉及通過如下方式獲得表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞的方法：使已 以約0. 8XIO5個(gè)細(xì)胞/cm2至約3. 0XIO5個(gè)細(xì)胞/cm2的接種密度接種于表面上的人胚胎多 能干細(xì)胞分化。在本發(fā)明的一些方面中，接種細(xì)胞的表面包括Matrigel?。
[0074] 在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及使表達(dá)指示人定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞分化的方法， 該方法包括使已以足以使多能細(xì)胞分化最大化的接種密度接種于第一表面上的人胚胎多 能干細(xì)胞分化成表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞；以及使以足以使分化效率最大化的 接種密度接種于第二表面上的表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞分化成表達(dá)指示胰腺 內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，以約0. 8XIO5個(gè)細(xì)胞/cm2至約3.OXIO5個(gè)細(xì) 胞/cm2的接種密度接種多能干細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，將表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的 細(xì)胞以約I. 5XIO5個(gè)細(xì)胞/cm2至約5.OXIO5個(gè)細(xì)胞/cm2的接種密度接種于表面上。在一 些方面，使表達(dá)指示人定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞分化的方法中的多能細(xì)胞包括使用胚胎 干細(xì)胞。在本發(fā)明的一些方面中，胚胎干細(xì)胞是人胚胎干細(xì)胞。在本發(fā)明的一些方面中，接 種細(xì)胞的表面包括Matrigel?。
[0075] 本發(fā)明涉及使表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞分化的方法，所述表達(dá)指示定 形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞已通過多能干細(xì)胞分化成表達(dá)指示胰腺內(nèi)分泌的標(biāo)志物的細(xì)胞 產(chǎn)生。其中多能干細(xì)胞已以約〇. 8XIO5個(gè)細(xì)胞/cm2至約3. 0XIO5個(gè)細(xì)胞/cm2的接種密度 接種于表面上。在本發(fā)明的一些方面中，所使用的多能干細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。在本發(fā)明的 一些方面中，所使用的胚胎干細(xì)胞是人胚胎干細(xì)胞。在本發(fā)明的一些方面中，接種細(xì)胞的表 面包括Matrigel?。
[0076] 在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及獲得表達(dá)指示胰腺內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞的方法，該方 法包括將多能干細(xì)胞接種于表面上；使多能干細(xì)胞分化成表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的 細(xì)胞；以及使表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞分化成表達(dá)指示胰腺內(nèi)胚層的標(biāo)志物的 細(xì)胞。在本發(fā)明的一些方面中，以約〇. 8XIO5個(gè)細(xì)胞/cm2至約3. 0XIO5個(gè)細(xì)胞/cm2的密 度接種多能干細(xì)胞。在本發(fā)明的一些方面中，以約I. 5XIO5個(gè)細(xì)胞/cm2至約5. 0XIO5個(gè) 細(xì)胞/cm2的密度接種表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞。在本發(fā)明的一些方面中，多能 干細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。在本發(fā)明的一些方面中，胚胎干細(xì)胞是人胚胎干細(xì)胞。在本發(fā)明的 一些方面中，接種細(xì)胞的表面包括Matrigel?。
[0077] 在一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及獲得表達(dá)指示胰腺內(nèi)分泌譜系的標(biāo)志物的細(xì)胞的方 法，該方法包括將多能干細(xì)胞接種于表面上；使多能干細(xì)胞分化成表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的 標(biāo)志物的細(xì)胞；以及使表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞分化成表達(dá)指示胰腺內(nèi)分泌的 標(biāo)志物的細(xì)胞。在本發(fā)明的一些方面中，以約0. 8XIO5個(gè)細(xì)胞/cm2至約3.OXIO5個(gè)細(xì)胞/ cm2的密度接種用于獲得表達(dá)指示胰腺內(nèi)分泌譜系的標(biāo)志物的細(xì)胞的多能干細(xì)胞。在本發(fā) 明的一些方面中，以約I. 5XIO5個(gè)細(xì)胞/cm2至約5.OXIO5個(gè)細(xì)胞/cm2的密度接種表達(dá)指 示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞。在本發(fā)明的一些方面中，多能干細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。在本 發(fā)明的一些方面中，胚胎干細(xì)胞是人胚胎干細(xì)胞。在本發(fā)明的一些方面中，接種細(xì)胞的表面 包括Matrigel?。
[0078] 在一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及使表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞分化的方 法，該方法包括將表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞以約1.5XIO5個(gè)細(xì)胞/cm2至約 5. 0XIO5個(gè)細(xì)胞/cm2的接種密度接種于表面上，然后使表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì) 胞分化成表達(dá)指示胰腺內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞。在本發(fā)明的一些方面中，該方法中使用的 表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞是表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的人細(xì)胞。在本發(fā)明 的一些方面中，表達(dá)指示胰腺內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞是人的。
[0079] 在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及這樣的方法：使以約I. 5XIO5個(gè)細(xì)胞/cm2至約5.OXIO5 個(gè)細(xì)胞/cm2的接種密度接種于表面上的表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞分化，然后使 表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞分化成表達(dá)指示胰腺內(nèi)分泌的標(biāo)志物的細(xì)胞。在一些 方面，表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞是人的。在一些方面，表達(dá)指示胰腺內(nèi)分泌的標(biāo) 志物的細(xì)胞是人的。
[0080] 本發(fā)明描述了可高效分化為胰腺內(nèi)胚層和內(nèi)分泌譜系的一系列ES細(xì)胞密度。
[0081] 本發(fā)明的另一個(gè)方面描述了可高效分化為胰腺內(nèi)胚層和內(nèi)分泌譜系的一系列DE 細(xì)胞密度。
[0082] 將本文通篇中所引用的出版物的全文以引用的方式并入本文。本發(fā)明通過下述實(shí) 例進(jìn)一步舉例說明，但并不受其限制。
[0083] SM
[0084]實(shí)例1
[0085] 杯胎干細(xì)朐的接種密度不會(huì)顯著影響定形內(nèi)杯層標(biāo)志物的表汰
[0086] 進(jìn)行該實(shí)例以便了解ES細(xì)胞的初始接種密度是否會(huì)顯著影響定形內(nèi)胚層譜系的 細(xì)胞的產(chǎn)生。
[0087] 人胚胎干細(xì)胞系Hl(hESCHl)的細(xì)胞在不同傳代（第40代至第52代）時(shí)進(jìn)行收 獲，并且以如下密度：〇. 3XIO5個(gè)細(xì)胞/cm2、0. 5XIO5個(gè)細(xì)胞/cm2、0. 75XIO5個(gè)細(xì)胞/cm2、 0. 9XIO5 個(gè)細(xì)胞 /cm2、IXIO5 個(gè)細(xì)胞 /cm2、1. 25XIO5 個(gè)細(xì)胞 /cm2、I. 5XIO5 個(gè)細(xì)胞 /cm2、 1.8X105個(gè)細(xì)胞/cm2和2X105個(gè)細(xì)胞/cm2作為單細(xì)胞接種于Matrigel?(l: 30稀釋 度；BDBiosciences，F(xiàn)ranklinLakes，NJ)包被的培養(yǎng)皿上的補(bǔ)充有IOiiMY27632(Rock 抑制劑，目錄號(hào)Y0503，SigmaAldrich，St.Louis,MO)的niTeSR'、1 培養(yǎng)基（StemCell Technologies，Vancouver，Canada)或MEF-CM(條件培養(yǎng)基）中。接種后四十八小時(shí)，將培 養(yǎng)物洗滌并在不完全PBS(不含Mg或Ca的磷酸鹽緩沖鹽水）中溫育大約30秒。按照如下 方法使培養(yǎng)物分化成定形內(nèi)胚層（DE)譜系：
[0088]第1階段（定形內(nèi)胚層（DE)_4天）：細(xì)胞在下述第1階段培養(yǎng)基中培養(yǎng)一天： MCDB-131 培養(yǎng)基（目錄號(hào) 10372-019,Invitrogen，Carlsbad，CA)，其補(bǔ)充有 2 %無脂肪 酸BSA(目錄號(hào) 68700,Proliant，Ankeny，IA)、0.0012g/ml碳酸氫鈉（目錄號(hào)S3187， SigmaAldrich)、lXGlutaMax?(目錄號(hào) 35050-079，Invitrogen)、2.5mMD-葡萄糖（目錄 號(hào)G8769，SigmaAldrich)、1 : 50000XITS-X(Invitrogen)、100ng/ml⑶F8(R&DSystems,Minneapolis，MN)和 2. 5iiMMCX化合物（GSK3B抑制劑，14-丙-2-烯-1-基 _3,5,7，14，17， 23, 27-七氮雜四環(huán)[19. 3.I. 1 ?2,6 -- 1 ?8,12 ?]二十七-1(25)，2(27)，3, 5,8 (26)， 9,11，21，23-壬烯-16-酮，美國專利申請(qǐng)公布2010-0015711 ;該專利申請(qǐng)全文以引用的方 式并入本文）。細(xì)胞隨后在MCDB-131培養(yǎng)基中培養(yǎng)另外三天，所述MCDB-131培養(yǎng)基補(bǔ)充有 2%無脂肪酸BSA、0.0012g/ml碳酸氫鈉、IXGlutaMax?、2.5mMD-葡萄糖、lOOng/ml⑶F8 和I: 50000XITS-X。
[0089] 在DE階段結(jié)束時(shí)，收集樣品并通過實(shí)時(shí)PCR和熒光激活細(xì)胞分選（FACS)進(jìn)行分 析。通過在37°C下在TrypLEExpress(Invitrogen目錄號(hào)12604)中溫育3-5分鐘，使細(xì) 胞hESC來源的細(xì)胞釋放到單細(xì)胞懸液中，隨后使用血球計(jì)進(jìn)行雙重計(jì)數(shù)。然后將細(xì)胞在 染色緩沖液（含〇? 2%BSA的PBS)(BDBiosciences目錄號(hào)554657)中洗滌兩次。為進(jìn)行 表面標(biāo)志物染色，將IXlO5至IXlO6個(gè)細(xì)胞重懸于100 封閉緩沖液（以1 : 4稀釋于 染色緩沖液中的0.5%人Y-球蛋白）中。將直接偶聯(lián)的一抗⑶184APC(別藻藍(lán)蛋白，BD Biosciences目錄號(hào) 555976)和CD9PE(BDBiosciences目錄號(hào) 555372)以 1 : 20 的最終 稀釋度添加到細(xì)胞中，并在4°C下溫育30分鐘。將染色細(xì)胞在BD染色緩沖液中洗滌兩次， 重懸于200ill染色緩沖液中，然后在15ill的7AAD中溫育以便在BDFACSCanto上分析 之前進(jìn)行活/死細(xì)胞辨別。
[0090] 根據(jù)制造商說明書，用RNeasy小量提取試劑盒（Qiagen!Valencia,CA)提取 總RNA并使用高容量cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,CA)逆轉(zhuǎn) 錄。使用預(yù)上樣于定制Taqman陣列（AppliedBiosystems)上的Taqman通用預(yù)混液和 Taqman基因表達(dá)分析試劑盒擴(kuò)增cDNA。使用序列檢測軟件（AppliedBiosystems)分析數(shù) 據(jù)，并使用△ACt方法歸一化為未分化的人胚胎干細(xì)胞（hES)。所有引物均購自Applied Biosystems0
[0091] 圖IA至圖IF示出了以0?3XIO5個(gè)細(xì)胞/cm2 (圖1A)、0. 75XIO5個(gè)細(xì)胞/cm2 (圖 18)、1父105個(gè)細(xì)胞/〇112(圖1〇、1.5\105個(gè)細(xì)胞/〇11 2(圖10)、1.8\105個(gè)細(xì)胞/〇112(圖 1E)和2XIO5個(gè)細(xì)胞/cm2(圖1F)接種的Hl細(xì)胞的CXCR4(Y軸，DE的標(biāo)志物）和CD-9(X 軸，未分化ES細(xì)胞的標(biāo)志物）的FACS直方表達(dá)譜。CXCR4和⑶9的表達(dá)百分比匯總于表I 中。如圖1和表I所示，未分化ES細(xì)胞的初始接種密度對(duì)隨后分化為定形內(nèi)胚層沒有顯著 影響，如CXCR4的上調(diào)和CD9的下調(diào)所測量的。
[0092] MI
[0093]ES細(xì)朐的接種密度對(duì)定形內(nèi)杯層標(biāo)志物CXCR4的表汰的影響
[0094]

【權(quán)利要求】
1. 一種培養(yǎng)多能干細(xì)胞的方法，包括將所述多能干細(xì)胞以約0. 8X 105個(gè)細(xì)胞/cm2至 約3. OX 105個(gè)細(xì)胞/cm2的接種密度接種于表面上。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多能干細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述胚胎干細(xì)胞是人胚胎干細(xì)胞。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多能干細(xì)胞接種于包括Matrigel?的表面上。
5. -種使多能干細(xì)胞分化的方法，包括將所述多能干細(xì)胞以約0.8X105個(gè)細(xì)胞/cm 2至 約3. 0X105個(gè)細(xì)胞/cm2的密度接種于表面上；以及使所述多能干細(xì)胞分化為表達(dá)指示定形 內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述多能干細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述胚胎干細(xì)胞是人胚胎干細(xì)胞。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中接種所述多能干細(xì)胞的所述表面包括Matrigel?。
9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞是人 的。
10. -種獲得表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞的方法，包括使多能干細(xì)胞分化成 表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞，其中所述多能干細(xì)胞已以約0.8X10 5個(gè)細(xì)胞/cm2至 約3. OX 105個(gè)細(xì)胞/cm2的密度接種于表面上。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述多能干細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述胚胎干細(xì)胞是人胚胎干細(xì)胞。
13. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中接種所述多能干細(xì)胞的所述表面包括 MatrigelTm〇
14. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞是人 的。
15. -種使表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞分化的方法，包括將多能干細(xì)胞以足 以使所述多能干細(xì)胞的分化效率最大化的接種密度接種于第一表面上；使所述多能干細(xì)胞 分化成表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞；以足以使所述表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物 的細(xì)胞的分化效率最大化的接種密度接種所述表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞；以及 使所述表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞分化成表達(dá)指示胰腺內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述多能干細(xì)胞以約0. 8X 105個(gè)細(xì)胞/cm2至 約3. OX 105個(gè)細(xì)胞/cm2的接種密度接種于所述第一表面上。
17. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞以約 1. 5X 105個(gè)細(xì)胞/cm2至約5. OX 105個(gè)細(xì)胞/cm2的接種密度接種于所述第二表面上。
18. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述多能干細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述胚胎干細(xì)胞是人胚胎干細(xì)胞。
20. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述第一表面包括Matrigel?。
21. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述第二表面包括Matrigel?。
22. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述第一表面和所述第二表面是相同表面。
23. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞是人 的。
24. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述表達(dá)指示胰腺內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞是人 的。
25. -種使表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞分化的方法，包括使多能干細(xì)胞分化 成表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞；以及使所述表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞 分化成表達(dá)指示胰腺內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞；其中所述多能干細(xì)胞已以約0. 8X 105個(gè)細(xì)胞 /cm2至約3. OX 105個(gè)細(xì)胞/cm2的接種密度接種于表面上。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述多能干細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。
27. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述胚胎干細(xì)胞是人胚胎干細(xì)胞。
28. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述表面包括Matrigel?。
29. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞是人 的。
30. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述表達(dá)指示胰腺內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞是人 的。
31. -種獲得表達(dá)指示胰腺內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞的方法，包括： a) 將多能干細(xì)胞接種于表面上； b) 使所述多能干細(xì)胞分化成表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞；以及 c) 使所述表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞分化成表達(dá)指示胰腺內(nèi)胚層的標(biāo)志物 的細(xì)胞。
32. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述多能干細(xì)胞以約0. 8X 105個(gè)細(xì)胞/cm2至 約3. OX 105個(gè)細(xì)胞/cm2的接種密度接種于表面上。
33. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，還包括以約1. 5X 105個(gè)細(xì)胞/cm2至約5. OX 105個(gè) 細(xì)胞/cm2的接種密度接種所述表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞的步驟。
34. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述多能干細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。
35. 根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述胚胎干細(xì)胞是人胚胎干細(xì)胞。
36. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述表面包括Matrigel'
37. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞是人 的。
38. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述表達(dá)指示胰腺內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞是人 的。
39. -種獲得表達(dá)指示胰腺內(nèi)分泌的標(biāo)志物的細(xì)胞的方法，包括： a) 將多能干細(xì)胞接種于表面上； b) 使所述多能干細(xì)胞分化成表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞；以及 c) 使所述表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞分化成表達(dá)指示胰腺內(nèi)分泌的標(biāo)志物 的細(xì)胞。
40. 根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述多能干細(xì)胞以約0. 8X 105個(gè)細(xì)胞/cm2至 約3. OX 105個(gè)細(xì)胞/cm2的接種密度接種。
41. 根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，還包括以約1. 5X 105個(gè)細(xì)胞/cm2至約5. OX 105個(gè) 細(xì)胞/cm2的接種密度接種所述表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞的步驟。
42. 根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述多能干細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。
43. 根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述胚胎干細(xì)胞是人胚胎干細(xì)胞。
44. 根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述表面包括Matrigel?。
45. 根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞是人 的。
46. 根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述表達(dá)指示胰腺內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞是人 的。
47. -種使表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞分化的方法，包括將表達(dá)指示定形內(nèi) 胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞以約1. 5 X105個(gè)細(xì)胞/cm2至約5. 0X105個(gè)細(xì)胞/cm2的接種密度接種 于表面上；以及使所述表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞分化成表達(dá)指示胰腺內(nèi)胚層的 標(biāo)志物的細(xì)胞。
48. 根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中所述表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞是人 的。
49. 根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中所述表達(dá)指示胰腺內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞是人 的。
50. -種使表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞分化成表達(dá)指示胰腺內(nèi)分泌的標(biāo)志物 的細(xì)胞的方法，包括將表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞以約1.5X10 5個(gè)細(xì)胞/cm2至約 5. OX 105個(gè)細(xì)胞/cm2的接種密度接種于表面上；以及使所述表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物 的細(xì)胞分化成表達(dá)指示胰腺內(nèi)分泌的標(biāo)志物的細(xì)胞。
51. 根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中所述表達(dá)指示定形內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞是人 的。
52. 根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中所述表達(dá)指示胰腺內(nèi)胚層的標(biāo)志物的細(xì)胞是人 的。
53. -種由人胚胎干細(xì)胞體外分化的細(xì)胞群，其與人胚胎干細(xì)胞相比時(shí)顯示出選自 H)X-1、NKX6. 1、NGN3、NKX2. 2、NeuroD和胰島素的至少一種標(biāo)志物的表達(dá)下降，以及ZIC1和 CDX2的上調(diào)；并且其中所述人胚胎干細(xì)胞以小于5X105個(gè)細(xì)胞/cm2的接種密度接種于表 面上。
【文檔編號(hào)】C12N5/0735GK104284977SQ201380024226
【公開日】2015年1月14日 申請(qǐng)日期:2013年5月7日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月7日
【發(fā)明者】A.雷扎尼亞 申請(qǐng)人:詹森生物科技公司