一種誘導(dǎo)胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島樣細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種誘導(dǎo)胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島樣細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，許多學(xué)者正在積極尋找能夠分化為胰島素分泌細(xì)胞的干細(xì)胞來源。目前用于胰島細(xì)胞來源研究的干細(xì)胞主要有胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。從理論上講，胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells, ESCs)是一群較原始的細(xì)胞，具有全能干細(xì)胞的特點(diǎn)，但其易引起腫瘤的發(fā)生，并存在倫理問題的爭議；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞也是干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)，是目前應(yīng)用最廣泛的干細(xì)胞，但骨髓干細(xì)胞的數(shù)量會因個(gè)體的衰老而逐漸減少，分化功能也會隨著年齡的增長而減低，并且取材較困難，所以尋找新的干細(xì)胞來源迫在眉睫。
[0003]骨髓中間充質(zhì)干細(xì)胞含量很低，一般問0.001% -0.01%，直接取材分析根本滿足不了要求；胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells, ESCs)是一群較原始的細(xì)胞，具有全能干細(xì)胞的特點(diǎn)，但其易引起腫瘤的發(fā)生，并存在倫理問題的爭議。而胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞可貼壁生長，而且增殖迅速，可以在6周內(nèi)增加2*109倍，能滿足移植的需要。胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞擴(kuò)增10代以上和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，且保持正常核型和端粒酶活性及其它原有的生物學(xué)活性。因此我們選擇誘導(dǎo)胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞分化。
[0004]國內(nèi)外均有體外誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞分化的報(bào)道，其所使用的方法不一，其中典型的方式如下:
[0005](I)用高濃度的葡萄糖培養(yǎng)液(25mmol/L)培養(yǎng)液DMEM(含質(zhì)量濃度為10 %的FBS)以及bFGF (basic Fibroblast Growth Factor)和尼克酰胺誘導(dǎo)劑靜脈間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞分化。
[0006](2) 一種將人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成胰島素分泌細(xì)胞的誘導(dǎo)劑，由以下組分組成:大株紅景天注射液、煙酰胺、?；撬岷虶LP-1。含有上述誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每1000ml所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中含有大株紅景天注射液20?40g、煙酰胺0.97?1.47g、牛磺酸0.25?
0.50g、GLP-126.84?40.27mg，余量為人間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，混勻過濾除菌即可。
[0007](3) 一種誘導(dǎo)培養(yǎng)基及其誘導(dǎo)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島樣細(xì)胞的方法。所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含下述含量的以下組分:葡萄糖10mM-20mM ;維生素B55mM-15mM ;活化素A10nM-30nM ;唾液素45nM_15nM ;肝細(xì)胞生長因子50pM_150pM ;五肽胃泌素5nM_15nM。
[0008](4) 一種體外誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島樣細(xì)胞的方法，包括四步誘導(dǎo)法把人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島樣細(xì)胞，其中主要的誘導(dǎo)液中首次采用胎豬胰腺提取液和醋酸鋅的誘導(dǎo)成分，分化為胰島樣細(xì)胞的胰島素分泌量顯著提高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的提供一種誘導(dǎo)胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島樣細(xì)胞的方法，利用人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、地塞米松、巰基乙醇等細(xì)胞因子誘導(dǎo)胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞分化及其鑒定。在于進(jìn)一步探討胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的分化潛能，探討和研究胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)、分化的最佳條件，研究誘導(dǎo)胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的可能性和可行性，尋找體外誘導(dǎo)分化的最佳誘導(dǎo)體系，進(jìn)而找到一種誘導(dǎo)胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞(insulin-producing cells, IPCs)分化的方法。進(jìn)而為胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞的臨床應(yīng)用提供了基礎(chǔ)研究依據(jù)。
[0010]為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明提供了一種誘導(dǎo)胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島樣細(xì)胞的方法的處理方案，具體如下:
[0011]—種誘導(dǎo)胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島樣細(xì)胞的方法，步驟如下:
[0012]步驟1:胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)階段，具體如下:
[0013]選擇足月剖宮產(chǎn)的胎盤，胎盤組織以I型膠原酶消化60分鐘，以1800r/min離心5min，獲得消化后的細(xì)胞沉淀，細(xì)胞沉淀清洗2-3遍，接種于普通培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37°C、設(shè)定濃度的C02、95%飽和濕度，72小時(shí)后開始換液，2_3天換液一次，顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長情況；
[0014]步驟2:胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的表型測定階段，具體如下:
[0015]取第3代生長旺盛的細(xì)胞以胰蛋白酶消化后，PBS沖洗2遍，調(diào)整細(xì)胞密度，分裝于6個(gè)離心管中，分別加入鼠抗人單克隆抗體⑶29、⑶34、⑶44、⑶45，流式細(xì)胞儀檢測其表型，結(jié)果表明，所取得的細(xì)胞表面表達(dá)⑶44、⑶29，不表達(dá)⑶34、⑶45，因此，可以確定本發(fā)明所提取的細(xì)胞為胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞；
[0016]步驟3:細(xì)胞因子誘導(dǎo)胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島樣細(xì)胞，具體如下:
[0017]取第三代胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，質(zhì)量濃度為0.25%的胰蛋白酶+0.02% EDTA消化細(xì)胞，以2*105/mL密度接種于6平板中，24h后，待細(xì)胞鋪滿60%，去除舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液清洗細(xì)胞3次，每孔加3mL誘導(dǎo)液，誘導(dǎo)培養(yǎng)2天后，去除舊培養(yǎng)基，繼續(xù)每孔加入3mL誘導(dǎo)液培養(yǎng)，以此類推，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)14天，并在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，對照組單純的采用含質(zhì)量濃度為10%的FBS的α -MEM。
[0018]所述的步驟I中的C02的質(zhì)量濃度為5%。
[0019]所述的步驟I中培養(yǎng)基內(nèi)含質(zhì)量濃度為10%胎牛血清和α -MEM。
[0020]所述的步驟I中I型膠原酶的質(zhì)量濃度為0.1 %。
[0021]所述的步驟2中調(diào)整細(xì)胞密度為106/100uL。
[0022]所述步驟3中的誘導(dǎo)液包括β -巰基乙醇、人堿性成纖維細(xì)胞生長因子、地塞米松及含F(xiàn)BS的α -MEM。
[0023]所述的β -巰基乙醇濃度為0.lmmol/Lo
[0024]所述的人堿性成纖維細(xì)胞生長因子濃度為5ug/L。
[0025]所述的地塞米松濃度為10mmol/L。
[0026]所述的FBS質(zhì)量濃度為10%。
[0027]本發(fā)明還具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0028]1、胎盤來源廣泛，不引起供者不適以及不涉及倫理道德問題，其分離培養(yǎng)后的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞擴(kuò)增能力較強(qiáng)，具有多向分化潛能、造血支持及免疫抑制效應(yīng)。此與捐獻(xiàn)骨髓或采集動員外周血相比，供者無痛苦，感染機(jī)會少，擴(kuò)增能力強(qiáng)。
[0029]2、本發(fā)明所用到的誘導(dǎo)體系安全、無副作用，誘導(dǎo)體系容易獲取，進(jìn)而為胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞的臨床應(yīng)用提供了基礎(chǔ)研究依據(jù)，同時(shí)提供一種獲得大量胰島樣細(xì)胞團(tuán)以用于糖尿病細(xì)胞治療的方法。
【附圖說明】
[0030]圖1為本發(fā)明的實(shí)施例的步驟I的觀察結(jié)果圖。
[0031]圖2為本發(fā)明的實(shí)施例的步驟2的一組表達(dá)結(jié)果。
[0032]圖3為本發(fā)明的實(shí)施例的步驟2的另一組表達(dá)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0033]胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞(placenta-derivedmesenchymal stem cells, PMSCs)是利用間充質(zhì)干細(xì)胞易貼壁生長的特性從胎盤組織中分離培養(yǎng)出來的細(xì)胞，在體外可被培養(yǎng)、傳代，并具有定向分化為神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞的潛能，與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有相似的生物學(xué)特性，已被作為研究細(xì)胞定向分化、多向誘導(dǎo)的“種子細(xì)胞”，是未來臨床替代治療和基因治療的新的干細(xì)胞來源，已受到廣泛的關(guān)注。本發(fā)明試圖探討胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞在特定的誘導(dǎo)條件下分化為胰島素分泌細(xì)胞，從而起到治療糖尿病的作用。
[0034]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明:
[0035]實(shí)施例1
[0036]誘導(dǎo)胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島樣細(xì)胞的方法，步驟如下:
[0037]步驟1:胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)階段，具體如下:
[003