順式-5-羥基-l-六氫吡啶甲酸的生物學制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了制備順式-5-羥基-L-六氫吡啶甲酸的方法。本發(fā)明的制備方法可應(yīng)用能夠直接生產(chǎn)順式-5-羥基-L-六氫吡啶甲酸的基因重組微生物。本發(fā)明也提供了該基因重組微生物。本發(fā)明的優(yōu)選方式的特征是，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有下列DNA的基因重組微生物：編碼參與L-六氫吡啶甲酸的生物合成的蛋白質(zhì)的DNA、以及編碼具有L-六氫吡啶甲酸的順式-5位羥化酶活性的蛋白質(zhì)的DNA，并從該培養(yǎng)液獲得順式-5-羥基-L-六氫吡啶甲酸。
【專利說明】順式-5-超基-L-六氨n比惦甲酸的生物學制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及具有生產(chǎn)順式-5-輕基-k六氨化巧甲酸的能力的基因重組微生物、 W及利用該些微生物制備順式-5-輕基-k六氨化巧甲酸的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 順式-5-輕基-k六氨化巧甲酸是具有在心六氨化巧甲酸中引入輕基的結(jié)構(gòu)的 修飾氨基酸中的一種，是用作藥物合成中間體的物質(zhì)。
[0003] 另一方面，k六氨化巧甲酸（或者2-脈巧甲酸或k同型脯氨酸）的生物學制備 方法已被報告（非專利文獻1、非專利文獻2、W及專利文獻1)。該些報告中，通過具有W下 多核巧酸（有時也稱為DNA)的大腸桿菌，從k賴氨酸制備心六氨化巧甲酸。
[0004]a)編碼具有k賴氨酸6-氨基轉(zhuǎn)移酶酶活性的蛋白質(zhì)的多核巧酸， b)編碼具有化咯晰-5-駿酸還原酶（U歹ク夕一書'酵素）酶活性的蛋白質(zhì)的多核巧 酸。
[0005] 該些報告中，上述a)的例子可列舉泥色黃桿菌(Flavobacteriumlutescens) IF03084株衍生的基因（序列號1)、上述b)的例子可列舉大腸桿菌衍生proC基因 (序列號3)。大腸巧菌原本具有oroC基因，因此導(dǎo)入lat基因、衷武該基因的大腸巧菌具 有k六氨化巧甲酸生產(chǎn)能力。另外報告了，通過下列大腸桿菌，k六氨化巧甲酸的生產(chǎn)速 度提高，所述大腸桿菌也具有編碼具有賴氨酸特異性穿透活性的蛋白質(zhì)的DNA、例如大腸桿 菌衍生坐基因（序列號4)。
[0006] 據(jù)報告，首薦根瘤菌首薦中華根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)1021衍生的 CAC47686蛋白質(zhì)具有將k六氨化巧甲酸轉(zhuǎn)化為順式-5-輕基-k六氨化巧甲酸的能力（非 專利文獻3)。該氨基酸序列在數(shù)據(jù)庫GenBank中W登錄號CAC47686登錄。堿基序列在數(shù) 據(jù)庫GenBank中W登錄號AL591792登錄（序列號6)。
[0007]另外據(jù)報告，百脈根根瘤菌(Mesorhizobiumloti)MAFF303099衍生的BAB52605 蛋白質(zhì)、或者CAC47686蛋白質(zhì)具有將k脯氨酸轉(zhuǎn)化為順式-4-輕基脯氨酸的能力（專利 文獻2)。BAB52605蛋白質(zhì)的氨基酸序列在數(shù)據(jù)庫GenBank中W登錄號BAB52605登錄。堿 基序列在數(shù)據(jù)庫GenBank中W登錄號BA000012登錄（序列號7；loti基因）。
[0008] 現(xiàn)有技術(shù)文獻 專利文獻 專利文獻1 ;W02001/048216(專利第4516712號） 專利文獻 2 ;W02009/139365 非專利文獻 非專利文獻l;Biosci.Biotechnol.Biochem.，66 (3)，622-627，2002非專利文獻 2;Biosci.Biotechnol.Biochem. , 66 巧），1981-1984, 2002 非專利文獻 3 ;Adv.Synth.Catal.，353，1375-1383，2011。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 發(fā)明要解決的問題 CAC47686蛋白質(zhì)被認為是用于合成非天然氨基酸的有益的酶，但其存在W下問題。
[0010] 問題1)用一般方法在大腸桿菌中表達該蛋白質(zhì)時，該蛋白質(zhì)不溶且不活化。
[0011] 問題2)該蛋白質(zhì)在提供給ML反應(yīng)時迅速變性。
[001引問題3)該蛋白質(zhì)在提供給化化反應(yīng)時，與順式-5-輕基-k六氨化巧甲酸共同 地，順式-3-輕基六氨化巧甲酸也從k六氨化巧甲酸幾乎等量地蓄積。
[0013] 在非專利文獻3中，為了回避問題1)、且在大腸桿菌中表達CAC47686蛋白質(zhì)，應(yīng)用 冷激啟動子在低溫誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達，且使得天藍鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)的 GroEL/GroES共表達等。另外，作為回避問題2)的方法之一，可列舉向表達了該蛋白質(zhì)的 大腸桿菌的活菌提供k六氨化巧甲酸使其輕化的想法，但該方法實際上是否有效尚不明 確。問題3)的回避方法沒有提示。如此地，應(yīng)用表達CAC47686蛋白質(zhì)的大腸桿菌制備順 式-5-輕基-k六氨化巧甲酸存在許多困難。
[0014] 認為BAB52605蛋白質(zhì)也與CAC47686蛋白質(zhì)同樣地可具有將心六氨化巧甲酸轉(zhuǎn) 化為順式-5-輕基-k六氨化巧甲酸的能力，但如本說明書實施例所示可知，表達基 因編碼的BAB52605蛋白質(zhì)的大腸桿菌的順式-5-輕基-k六氨化巧甲酸生產(chǎn)能力比較低。 另外，BAB52605蛋白質(zhì)與CAC47686蛋白質(zhì)的氨基酸序列同一性是66%。
[001引解決問題的手段 另一方面，EFV12517蛋白質(zhì)是SegniliparusrugosusATCCBAA-974衍生的蛋白質(zhì)， 其氨基酸序列在數(shù)據(jù)庫GenBank中W登錄號邸V12517登錄。其堿基序列在數(shù)據(jù)庫GenBank 中W登錄號ACZI01000186(區(qū)域：1378..2229)登錄（序列號8:shortcis某巧）。EFV12517 蛋白質(zhì)在GenBank中標注為天冬氨醜/天冬醜胺醜目-輕化酶（aspartyl/Asparagin^ 目-hy化oxylase)，如本發(fā)明實施例所示地，在表達EFV12517蛋白質(zhì)的大腸桿菌中不能 檢測到將k六氨化巧甲酸轉(zhuǎn)化為順式-5-輕基-k六氨化巧甲酸的能力。但是發(fā)現(xiàn)了， 表達下列蛋白質(zhì)的大腸桿菌具有k六氨化巧甲酸的順式-5位輕化酶活性，能夠?qū)六 氨化巧甲酸轉(zhuǎn)化為順式-5-輕基-k六氨化巧甲酸，從而完成本發(fā)明，所述蛋白質(zhì)由從距 EFV12517蛋白質(zhì)標注位置上游48個堿基（相當于16個氨基酸）表達的多核巧酸（序列號 2 :過^基因）編碼。
[0016]本發(fā)明提供W下內(nèi)容：
[1]順式-5-輕基-k六氨化巧甲酸或其藥學上可接受的鹽或者它們的溶劑合物的 制備方法，其包含，通過W可表達的狀態(tài)含有下述（A)?（巧中任一多核巧酸的微生物，W k六氨化巧甲酸為底物生成順式-5-輕基-k六氨化巧甲酸的步驟： (A)由序列號2記載的堿基序列組成的多核巧酸； 炬）與由與序列號2記載的堿基序列互補的堿基序列組成的多核巧酸在嚴格條件下雜 交、并且編碼具有催化Wk六氨化巧甲酸為底物生成順式-5-輕基-k六氨化巧甲酸的反 應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)的多核巧酸； (C)與序列號2記載的堿基序列具有至少85%W上的同一性、并且編碼具有催化W心六氨化巧甲酸為底物生成順式-5-輕基-心六氨化巧甲酸的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)的多核 巧酸； (D)編碼由序列號25記載的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核巧酸； 似編碼由在序列號25記載的氨基酸序列中置換、缺失、插入、和/或添加1個或多數(shù) 氨基酸而成的氨基酸序列組成、并且具有催化Wk六氨化巧甲酸為底物生成順式-5-輕 基-心六氨化巧甲酸的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)的多核巧酸； (巧編碼由與序列號25記載的氨基酸序列具有至少85%W上同一性的氨基酸序列組 成、并且具有催化Wk六氨化巧甲酸為底物生成順式-5-輕基-k六氨化巧甲酸的反應(yīng)的 活性的蛋白質(zhì)的多核巧酸。
[0017] 巧][1]中記載的制備方法，所述微生物W可表達的狀態(tài)進一步含有；編碼具有催 化Wk賴氨酸為底物生成k氨基己二酸-A-半酵的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)的多核巧酸、W 及編碼具有催化^A1-脈巧帰-6-甲酸（尹從夕1 _t。U尹シ_ 6 _力從樂シ酸） 為底物生成k六氨化巧甲酸的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)的多核巧酸，所述方法進一步包含： Wk賴氨酸為底物生成k氨基己二酸-A-半酵、隨后將k氨基己二酸-A-半酵轉(zhuǎn) 化為A1-脈巧帰-6-甲酸的步驟；W及 WA1-脈巧帰-6-甲酸為底物生成k六氨化巧甲酸的步驟。
[0018] 巧][2]中記載的制備方法，所述編碼具有催化Wk賴氨酸為底物生成k氨基 己二酸-A-半酵的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)的多核巧酸從泥色黃桿菌(Flavobacterium lutescens)衍生。
[0019] [4] [2]或者巧]中記載的制備方法，所述微生物是大腸桿菌，其原本具有編碼具 有催化WA1-脈巧帰-6-甲酸為底物生成k六氨化巧甲酸的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)的多核 巧酸。
[0020] 閒下述（A)?（巧中任一多核巧酸： (A)由序列號2記載的堿基序列組成的多核巧酸； 炬）與由與序列號2記載的堿基序列互補的堿基序列組成的多核巧酸在嚴格條件下雜 交、并且編碼具有催化Wk六氨化巧甲酸為底物生成順式-5-輕基-k六氨化巧甲酸的反 應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)的多核巧酸； (C) 與序列號2記載的堿基序列具有至少85%W上的同一性、并且編碼具有催化W 心六氨化巧甲酸為底物生成順式-5-輕基-心六氨化巧甲酸的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)的多核 巧酸； (D) 編碼由序列號25記載的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核巧酸； 似編碼由在序列號25記載的氨基酸序列中置換、缺失、插入、和/或添加1個或多數(shù) 氨基酸而成的氨基酸序列組成、并且具有催化^心六氨化巧甲酸為底物生成順式-5-輕 基-心六氨化巧甲酸的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)的多核巧酸； (巧編碼由與序列號25記載的氨基酸序列具有至少85%W上同一性的氨基酸序列組 成、并且具有催化Wk六氨化巧甲酸為底物生成順式-5-輕基-k六氨化巧甲酸的反應(yīng)的 活性的蛋白質(zhì)的多核巧酸。
[0021] [6]轉(zhuǎn)化用載體，其包含[5]中記載的多核巧酸。
[0022] [7] [6]中記載的微生物的轉(zhuǎn)化用載體，其進一步包含編碼具有催化^k賴氨酸 為底物生成k氨基己二酸-A-半酵的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)的多核巧酸。
[0023] 巧][6]或者[7]中記載的微生物的轉(zhuǎn)化用載體，其進一步包含編碼具有催化生成 a-麗戊二酸的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)和/或具有催化WA1-脈巧帰-6-甲酸為底物生成 心六氨化巧甲酸的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)的多核巧酸。
[0024] [9]基因重組微生物，其通過[6]?巧]的任一項中記載的載體轉(zhuǎn)化。
[002引[10]基因重組大腸桿菌，其通過閒中記載的多核巧酸、W及編碼具有催化W k賴氨酸為底物生成k氨基己二酸-A-半酵的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)的多核巧酸轉(zhuǎn)化，且 具有Wk賴氨酸為原料生成順式-5-輕基-k六氨化巧甲酸的能力。
[002引山]下述（d)?訊中任一蛋白質(zhì)： (d) 由序列號25記載的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (e) 由在序列號25記載的氨基酸序列中置換、缺失、插入、和/或添加1個或多數(shù)氨 基酸而成的氨基酸序列組成、并且具有催化^心六氨化巧甲酸為底物生成順式-5-輕 基-k六氨化巧甲酸的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)； (f) 由與序列號25記載的氨基酸序列具有至少85%W上同一性的氨基酸序列組成、并 且具有催化Wk六氨化巧甲酸為底物生成順式-5-輕基-k六氨化巧甲酸的反應(yīng)的活性 的蛋白質(zhì)。
[0027] [12]順式-5-輕基-k六氨化巧甲酸或其藥學上可接受的鹽或者它們的溶劑合 物的制備方法，其包含使[11]中記載的蛋白質(zhì)作用于心六氨化巧甲酸生成順式-5-輕 基-k六氨化巧甲酸的步驟。
[0028] [13] [12]中記載的制備方法，其進一步包含： 使具有催化Wk賴氨酸為底物生成k氨基己二酸-A-半酵的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì) 作用于k賴氨酸生成k氨基己二酸-A-半酵，隨后將k氨基己二酸-A-半酵轉(zhuǎn)化為 A1-脈巧帰-6-甲酸的步驟；W及 使具有催化WA1-脈巧帰-6-甲酸為底物生成k六氨化巧甲酸的反應(yīng)的活性的蛋白 質(zhì)作用于得到的A1-脈巧帰-6-甲酸生成k六氨化巧甲酸的步驟。
[0029] [14] [9]或者[10]中記載的基因重組微生物或者基因重組大腸桿菌，其具有每1L 培養(yǎng)液生產(chǎn)50mgW上順式-5-輕基-k六氨化巧甲酸的能力。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030] 圖1是本發(fā)明的制備方法的一個例子，從k賴氨酸至順式-5-輕基-心六氨化巧 甲酸的轉(zhuǎn)化途徑。
[0031] 圖2是質(zhì)粒pRSF-Cis(參考實施例1)。
[003引圖3是化21 0E3) /pRSF-Cis株的產(chǎn)物的HPLC圖（參考實施例2)。
[003引圖4是化21 0E3)/pRSF-Cis株的產(chǎn)物的LC/MS圖（參考實施例2)。上3點是 200yg/mL標準品、下2點是化21 0E3) /pRSF-Cis株生產(chǎn)的物質(zhì)。
[0034] 圖5是酶lat、酶cis、變體cis的堿基序列W及氨基酸序列。

【具體實施方式】
[0035] 本發(fā)明提供了制備W下述式（I)的結(jié)構(gòu)式表示的順式-5-輕基-k六氨化巧甲酸 或其藥學上可接受的鹽或者它們的溶劑合物的方法。
[0036] 化學式1

【權(quán)利要求】
1. 順式-5-羥基-L-六氫吡啶甲酸或其藥學上可接受的鹽或者它們的溶劑合物的制備 方法，其包含，通過以可表達的狀態(tài)含有下述（A)?（F)中任一多核苷酸的微生物，以L-六 氫吡啶甲酸為底物生成順式-5-羥基-L-六氫吡啶甲酸的步驟： (A) 由序列號2記載的堿基序列組成的多核苷酸； (B) 與由與序列號2記載的堿基序列互補的堿基序列組成的多核苷酸在嚴格條件下雜 交、并且編碼具有催化以L-六氫吡啶甲酸為底物生成順式-5-羥基-L-六氫吡啶甲酸的反 應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸； (C) 與序列號2記載的堿基序列具有至少85%以上的同一性、并且編碼具有催化以 L-六氫吡啶甲酸為底物生成順式-5-羥基-L-六氫吡啶甲酸的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)的多核 苷酸； (D) 編碼由序列號25記載的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸； (E) 編碼由在序列號25記載的氨基酸序列中置換、缺失、插入、和/或添加1個或多數(shù) 氨基酸而成的氨基酸序列組成、并且具有催化以L-六氫吡啶甲酸為底物生成順式-5-羥 基-L-六氫吡啶甲酸的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸； (F) 編碼由與序列號25記載的氨基酸序列具有至少85%以上同一性的氨基酸序列組 成、并且具有催化以L-六氫吡啶甲酸為底物生成順式-5-羥基-L-六氫吡啶甲酸的反應(yīng)的 活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
2. 權(quán)利要求1中記載的制備方法，其中所述微生物以可表達的狀態(tài)進一步含有：編碼 具有催化以L-賴氨酸為底物生成L-氨基己二酸-A -半醛的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)的多核 苷酸、以及編碼具有催化以A 1-哌啶烯-6-甲酸為底物生成L-六氫吡啶甲酸的反應(yīng)的活 性的蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述方法進一步包含： 以L-賴氨酸為底物生成L-氨基己二酸-A -半醛、隨后將L-氨基己二酸-A -半醛轉(zhuǎn) 化為A 1-哌啶烯-6-甲酸的步驟；以及 以A 1-哌啶烯-6-甲酸為底物生成L-六氫吡啶甲酸的步驟。
3. 權(quán)利要求2中記載的制備方法，其中所述編碼具有催化以L-賴氨酸為底 物生成L-氨基己二酸-△-半醛的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸從泥色黃桿菌 (Flavobacterium lutescens)衍生。
4. 權(quán)利要求2或3中記載的制備方法，其中所述微生物是大腸桿菌，其原本具有編碼具 有催化以△ 1-哌啶烯-6-甲酸為底物生成L-六氫吡啶甲酸的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)的多核 苷酸。
5. 下述（A)?（F)中任一多核苷酸： (A) 由序列號2記載的堿基序列組成的多核苷酸； (B) 與由與序列號2記載的堿基序列互補的堿基序列組成的多核苷酸在嚴格條件下雜 交、并且編碼具有催化以L-六氫吡啶甲酸為底物生成順式-5-羥基-L-六氫吡啶甲酸的反 應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸； (C) 與序列號2記載的堿基序列具有至少85%以上的同一性、并且編碼具有催化以 L-六氫吡啶甲酸為底物生成順式-5-羥基-L-六氫吡啶甲酸的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)的多核 苷酸； (D) 編碼由序列號25記載的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸； (E) 編碼由在序列號25記載的氨基酸序列中置換、缺失、插入、和/或添加1個或多數(shù) 氨基酸而成的氨基酸序列組成、并且具有催化以L-六氫吡啶甲酸為底物生成順式-5-羥 基-L-六氫吡啶甲酸的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸； (F) 編碼由與序列號25記載的氨基酸序列具有至少85%以上同一性的氨基酸序列組 成、并且具有催化以L-六氫吡啶甲酸為底物生成順式-5-羥基-L-六氫吡啶甲酸的反應(yīng)的 活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
6. 轉(zhuǎn)化用載體，其包含權(quán)利要求5中記載的多核苷酸。
7. 權(quán)利要求6中記載的微生物的轉(zhuǎn)化用載體，其進一步包含編碼具有催化以L-賴氨酸 為底物生成L-氨基己二酸-A -半醛的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
8. 權(quán)利要求6或7中記載的微生物的轉(zhuǎn)化用載體，其進一步包含編碼具有催化生成 a -酮戊二酸的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)和/或具有催化以A 1-哌啶烯-6-甲酸為底物生成 L-六氫吡啶甲酸的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
9. 基因重組微生物，其通過權(quán)利要求6?8的任一項中記載的載體轉(zhuǎn)化。
10. 基因重組大腸桿菌，其通過權(quán)利要求5中記載的多核苷酸、以及編碼具有催化以 L-賴氨酸為底物生成L-氨基己二酸-△-半醛的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸轉(zhuǎn)化，且 具有以L-賴氨酸為原料生成順式-5-羥基-L-六氫吡啶甲酸的能力。
11. 下述⑷?（f)中任一蛋白質(zhì)： (d) 由序列號25記載的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (e) 由在序列號25記載的氨基酸序列中置換、缺失、插入、和/或添加1個或多數(shù) 氨基酸而成的氨基酸序列組成、并且具有催化以L-六氫吡啶甲酸為底物生成順式-5-羥 基-L-六氫吡啶甲酸的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)； (f) 由與序列號25記載的氨基酸序列具有至少85%以上同一性的氨基酸序列組成、 并且具有催化以L-六氫吡啶甲酸為底物生成順式-5-羥基-L-六氫吡啶甲酸的反應(yīng)的活 性的蛋白質(zhì)。
12. 順式-5-羥基-L-六氫吡啶甲酸或其藥學上可接受的鹽或者它們的溶劑合物的 制備方法，其包含使權(quán)利要求11中記載的蛋白質(zhì)作用于L-六氫吡啶甲酸生成順式-5-羥 基-L-六氫吡啶甲酸的步驟。
13. 權(quán)利要求12中記載的制備方法，其進一步包含： 使具有催化以L-賴氨酸為底物生成L-氨基己二酸-△-半醛的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì) 作用于L-賴氨酸生成L-氨基己二酸-A -半醛，隨后將L-氨基己二酸-A -半醛轉(zhuǎn)化為 A 1-哌陡烯-6-甲酸的步驟；以及 使具有催化以△ 1-哌啶烯-6-甲酸為底物生成L-六氫吡啶甲酸的反應(yīng)的活性的蛋白 質(zhì)作用于得到的A 1-哌啶烯-6-甲酸生成L-六氫吡啶甲酸的步驟。
14. 權(quán)利要求9或10中記載的基因重組微生物或者基因重組大腸桿菌，其具有每1L培 養(yǎng)液生產(chǎn)50mg以上順式-5-羥基-L-六氫吡啶甲酸的能力。
【文檔編號】C12N1/19GK104395466SQ201380030961
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2013年6月12日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月13日
【發(fā)明者】藤井匡, 田村圭輔 申請人:日本邁科洛生物制藥有限公司