用于干細(xì)胞的培養(yǎng)基的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及用于儲(chǔ)存、保存、培養(yǎng)和/或分化干細(xì)胞的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基采用分散在水性媒介物中的合成的熱響應(yīng)共聚物，其允許培養(yǎng)基通過(guò)簡(jiǎn)單地調(diào)整溫度跨過(guò)培養(yǎng)基的膠凝溫度容易地在非凝膠狀(流體)形式和凝膠狀形式之間“轉(zhuǎn)換”。如此，干細(xì)胞可以通過(guò)以下被容易地捕獲在3D凝膠基質(zhì)中：將干細(xì)胞與非凝膠狀/流體形式的培養(yǎng)基簡(jiǎn)單混合、并且然后通過(guò)調(diào)整溫度跨過(guò)培養(yǎng)基的膠凝溫度使培養(yǎng)基膠凝。被包封在凝膠狀形式的培養(yǎng)基內(nèi)的干細(xì)胞然后可在直接使用培養(yǎng)基中的干細(xì)胞之前(例如，在治療中或在培養(yǎng)、分化等中)、或在所述干細(xì)胞從培養(yǎng)基提取之后的使用之前被保存很長(zhǎng)一段時(shí)間。
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于干細(xì)胞的培養(yǎng)基
[0001] 引言
[0002] 本發(fā)明涉及用于儲(chǔ)存、保存、培養(yǎng)和/或分化干細(xì)胞的培養(yǎng)基。本發(fā)明還涉及使用 本發(fā)明的培養(yǎng)基儲(chǔ)存、保存、培養(yǎng)和/或分化干細(xì)胞的方法，以及用于形成本發(fā)明的培養(yǎng)基 的試劑盒，和包含分散在本發(fā)明的培養(yǎng)基中的干細(xì)胞的組合物（例如，藥物組合物）。
[0003] 背景
[0004] 干細(xì)胞是多年來(lái)密集研究的焦點(diǎn)。對(duì)干細(xì)胞的生物學(xué)和功能存在固有的興趣以及 對(duì)其潛在的治療用途存在濃厚的興趣。
[0005] 在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，研究者認(rèn)為干細(xì)胞具有徹底改變某些人類(lèi)疾病的治療的潛能。事 實(shí)上，很多成體干細(xì)胞治療已經(jīng)存在，諸如在治療白血病中使用的骨髓移植物。在將來(lái)，醫(yī) 學(xué)研究者期望能夠使用源自干細(xì)胞研究的技術(shù)以治療廣泛范圍的疾病，除了一些其他損害 和狀況之外包括癌癥、帕金森氏疾病、脊髓損傷、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥、多發(fā)性硬化癥 和肌肉損傷。
[0006] 對(duì)于正在進(jìn)行的干細(xì)胞研究和將來(lái)基于干細(xì)胞的治療的開(kāi)發(fā)，對(duì)培養(yǎng)干細(xì)胞的有 效且有成本效益的方法存在需求。特別是對(duì)能夠在儲(chǔ)存、運(yùn)輸和培養(yǎng)期間維持干細(xì)胞的活 力和表型的培養(yǎng)基存在需求。還對(duì)可以：（i)被容易地被滅菌；（ii)消除或最小化生物材料 的存在；并且（iii)當(dāng)期望時(shí)允許干細(xì)胞從培養(yǎng)基容易地收集并分離的干細(xì)胞培養(yǎng)基存在 需求。
[0007] 目前在市場(chǎng)上的干細(xì)胞培養(yǎng)基產(chǎn)品使用動(dòng)物來(lái)源的材料，由于其組成中批次間的 變化性，其是次佳的。
[0008] 因此，本發(fā)明的目的是提供滿(mǎn)足一些或所有前述需求的用于干細(xì)胞的培養(yǎng)基。
[0009] 發(fā)明概述
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了用于干細(xì)胞的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包含分散在水 性媒介物中的合成的熱響應(yīng)共聚物的顆粒；
[0011] 其中培養(yǎng)基能夠響應(yīng)溫度變化經(jīng)受非凝膠狀形式和凝膠狀形式之間的變化，并且 在非凝膠狀形式中，培養(yǎng)基包含合成的熱響應(yīng)共聚物的顆粒的膠狀穩(wěn)定的水性分散體，并 且在凝膠狀形式中，培養(yǎng)基是提供能夠容納干細(xì)胞的支架或基質(zhì)的凝膠形式；
[0012] 并且其中水性媒介物還包含用于維持干細(xì)胞的活力的營(yíng)養(yǎng)物。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了一種干細(xì)胞組合物，所述干細(xì)胞組合物包含分散 在根據(jù)本發(fā)明第一方面的培養(yǎng)基中的一種或更多種干細(xì)胞。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供了制備根據(jù)本發(fā)明第二方面的干細(xì)胞組合物的方 法，所述方法包括：
[0015] (i)使非凝膠狀形式的根據(jù)本發(fā)明第一方面的培養(yǎng)基與一種或更多種干細(xì)胞接觸 以產(chǎn)生流體干細(xì)胞組合物（即，干細(xì)胞在培養(yǎng)基中的流體分散體）；以及
[0016] (ii)任選地改變培養(yǎng)基的溫度使得培養(yǎng)基從非凝膠狀形式改變?yōu)槟z狀形式，從 而產(chǎn)生膠凝的干細(xì)胞組合物，其中干細(xì)胞被分散在膠凝的培養(yǎng)基中。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供了儲(chǔ)存或保存一種或更多種干細(xì)胞的方法，所述方 法包括：
[0018] (i)使非凝膠狀形式的根據(jù)本發(fā)明第一方面的培養(yǎng)基與一種或更多種干細(xì)胞接觸 以產(chǎn)生流體干細(xì)胞組合物；
[0019] (ii)改變培養(yǎng)基的溫度使得培養(yǎng)基從非凝膠狀形式改變?yōu)槟z狀形式并且從而 產(chǎn)生膠凝的干細(xì)胞組合物；以及
[0020] (iii)儲(chǔ)存膠凝的干細(xì)胞組合物。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明的第五方面，提供了培養(yǎng)干細(xì)胞的方法，所述方法包括：
[0022] (i)使非凝膠狀形式的根據(jù)本發(fā)明第一方面的培養(yǎng)基與一種或更多種干細(xì)胞接觸 以產(chǎn)生流體干細(xì)胞組合物；
[0023] (ii)改變培養(yǎng)基的溫度使得培養(yǎng)基從非凝膠狀形式改變成凝膠狀形式并且從而 產(chǎn)生膠凝的干細(xì)胞組合物；以及
[0024] (iii)在膠凝的干細(xì)胞組合物內(nèi)培養(yǎng)干細(xì)胞。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明的第六方面，提供了分化干細(xì)胞的方法，所述方法包括：
[0026] (i)使非凝膠狀形式的根據(jù)本發(fā)明第一方面的培養(yǎng)基與一種或更多種干細(xì)胞接觸 以產(chǎn)生流體干細(xì)胞組合物；
[0027] (ii)改變培養(yǎng)基的溫度使得培養(yǎng)基從非凝膠狀形式改變成凝膠狀形式并且從而 產(chǎn)生膠凝的干細(xì)胞組合物；以及
[0028] (iii)在促進(jìn)干細(xì)胞的分化的條件下培養(yǎng)干細(xì)胞。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明的第七方面，提供了從如本文定義的膠凝的干細(xì)胞組合物釋放一種或 更多種干細(xì)胞的方法，所述方法包括：
[0030] (i)提供膠凝的干細(xì)胞組合物，所述膠凝的干細(xì)胞組合物包含分散在凝膠狀形式 的根據(jù)第一方面的培養(yǎng)基中的一種或更多種干細(xì)胞；
[0031] (ii)改變干細(xì)胞培養(yǎng)基的溫度使得培養(yǎng)基從凝膠狀形式改變成非凝膠狀形式，從 而產(chǎn)生流體干細(xì)胞組合物；以及
[0032] (iii)任選地其后從流體干細(xì)胞組合物分離所述干細(xì)胞。
[0033] 根據(jù)本發(fā)明的第八方面，提供了制備根據(jù)本發(fā)明第一方面的培養(yǎng)基的方法，所述 方法包括使所述合成的熱響應(yīng)共聚物的顆粒分散在水性媒介物中，所述水性媒介物還包含 用于維持干細(xì)胞的活力的營(yíng)養(yǎng)物。
[0034] 根據(jù)本發(fā)明的第九方面，提供了用于制備根據(jù)本發(fā)明第一方面的培養(yǎng)基的試劑 盒，所述試劑盒包括：
[0035] (i)合成的熱響應(yīng)共聚物的顆粒，如本文定義的；以及
[0036] (ii)水性媒介物，所述水性媒介物還包含用于維持干細(xì)胞的活力的營(yíng)養(yǎng)物。
[0037] 根據(jù)本發(fā)明的第十方面，提供了藥物組合物，所述藥物組合物包含根據(jù)本發(fā)明第 二方面的干細(xì)胞組合物和任選地一種或更多種藥學(xué)上可接受的賦形劑。
[0038] 根據(jù)本發(fā)明的第十一方面，提供了根據(jù)第十方面的藥物組合物，用于在治療中使 用。
[0039] 根據(jù)本發(fā)明的第十一方面，提供了根據(jù)第十方面的藥物組合物，用于在細(xì)胞治療 中使用。
[0040] 根據(jù)本發(fā)明的第十二方面，提供了如本文定義的培養(yǎng)基用于儲(chǔ)存、保存、培養(yǎng)和/ 或分化一種或更多種干細(xì)胞的用途。
[0041] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的是，除非另有聲明，包括本發(fā)明的任何特定方面的任選 的、合適的和優(yōu)選的特征的特征可以適用于包括本發(fā)明的任何其他方面的任選的、合適的 和優(yōu)選的特征的特征。
[0042] 附圖簡(jiǎn)述
[0043] 本發(fā)明的實(shí)施方案在下文中參考附圖被進(jìn)一步描述，其中：
[0044] 圖1是d4-甲醇中記錄的PGMA45-PHPMA n。和PGMA 45的蟲(chóng)NMR光譜。
[0045] 圖2顯示了 10 % w/w PGMA45-PHPMAn。雙嵌段共聚物分散體的損耗模量和儲(chǔ)能模量 的溫度依賴(lài)性。臨界凝膠化溫度（CGT)被估計(jì)為17°C。
[0046] 圖 3 是 d4-甲醇中記錄的粗 PGMA55-P (HPMAS4-stat-DEGMA36)的1H NMR 光譜。
[0047] 圖 4 顯示了 10% w/w PGMA55 - P(HPMAS4-stat-DEGMA36)雙嵌段共聚物的損耗模量 和儲(chǔ)能模量的溫度依賴(lài)性。臨界凝膠化溫度（CGT)被估計(jì)為26°C。
[0048] 圖5顯示了凝膠內(nèi)（培養(yǎng)4天后）的胚胎干細(xì)胞聚集物。直至培養(yǎng)期的結(jié)束存在 少的聚集物擴(kuò)展。
[0049] 圖6顯示了 21天之后從凝膠恢復(fù)的胚胎干細(xì)胞聚集物。聚集物顯示出相對(duì)少的 分化的形態(tài)學(xué)指示。
[0050] 圖7顯示了培養(yǎng)21天之后從凝膠恢復(fù)的并且傳代進(jìn)入標(biāo)準(zhǔn)胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的胚 胎干細(xì)胞聚集物。在48h之后，形成胚胎干細(xì)胞的集落并且從聚集物擴(kuò)展（標(biāo)有箭頭的）。
[0051] 圖8顯示了之前在蠕蟲(chóng)凝膠（worm gel)/細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)基中孵育21天的胚胎干 細(xì)胞聚集物的用抗體表面標(biāo)志物Tra-1-60 (多能性（pluripotency))、SSEA-4 (多能性）、 SSEA1 (分化）標(biāo)記的細(xì)胞的比例的FACS分析的直方圖。
[0052] 圖9顯示了培養(yǎng)21天之后從凝膠恢復(fù)并且傳代進(jìn)入標(biāo)準(zhǔn)胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的胚胎 干細(xì)胞聚集物。在培養(yǎng)14天之后，聚集物顯示出形態(tài)分化為多種細(xì)胞類(lèi)型。
[0053] 圖10顯示了被平鋪至具有單獨(dú)的培養(yǎng)基（對(duì)照-無(wú)凝膠）的孔的胚胎干細(xì)胞凝 聚物的用抗體表面標(biāo)志物Tra-1-60 (多能性）、SSEA-4 (多能性）、SSEA1 (分化）標(biāo)記的細(xì) 胞的比例的FACS分析的直方圖。
[0054] 圖11顯示了取決于溫度形成不同形態(tài)的PGMA-HPMA嵌段共聚物。
[0055] 圖12顯示了 MTS測(cè)定。在組織培養(yǎng)塑制品（2D)中和PGMA-PHPMA共聚物凝膠（3D) 中培養(yǎng)NTERA2克隆D1細(xì)胞直至7天。
[0056] 圖13顯示了 NTERA克隆D1 EC細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白/DAPI染色。蠕蟲(chóng)凝膠和2D平面 基底（組織培養(yǎng)塑制品）之間的比較顯示了細(xì)胞的增殖直至7天。
[0057] 圖14顯示了通過(guò)免疫熒光分析的標(biāo)志物表達(dá)。在3D(蠕蟲(chóng)凝膠）和2D(組織培 養(yǎng)塑制品）中，用視黃酸培養(yǎng)NTERA2克隆D1 EC細(xì)胞7、14、21天之后，TRA 1-60多能性標(biāo) 志物表達(dá)（紅色）和DAPI核酸染色（藍(lán)色）。在3D (蠕蟲(chóng)凝膠）和2D (組織培養(yǎng)塑制品） 中，用視黃酸培養(yǎng)NTERA2克隆D1 EC細(xì)胞7、14、21天之后，Vin2Pb22分化標(biāo)志物表達(dá)（紅 色）和DAPI核酸染色（藍(lán)色）。
[0058] 圖15顯示了通過(guò)qPCR分析的標(biāo)志物表達(dá)。Nanog、0ct_04和β 3微管蛋白、h-ASHl 分別為在用視黃酸培養(yǎng)14天之后對(duì)NTERA2克隆D1 EC細(xì)胞分析的多能性和分化標(biāo)志物。 值表示為Δ/ACt值。
[0059] 圖16顯示了 HDF細(xì)胞活力針對(duì)PGMA55-PHPMA135共聚物蠕蟲(chóng)凝膠的優(yōu)化。針對(duì)在細(xì) 胞培養(yǎng)基中產(chǎn)生共聚物蠕蟲(chóng)凝膠，三種方案被評(píng)價(jià)。方案1 (在150mM PBS中制備20% w/ v共聚物凝膠，稀釋兩倍并且對(duì)PBS透析兩天），方案2 (與方案1相同，但透析7天），方案 3 (與方案2相同，隨后冷凍干燥過(guò)夜并且再分散在純細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM)中）。利用與細(xì)胞 單層的直接接觸測(cè)定以及使用ThinCert插入物的間接測(cè)定兩者來(lái)評(píng)價(jià)HDF細(xì)胞活力。MTT 測(cè)定被用來(lái)評(píng)價(jià)在37°C下的細(xì)胞活力。實(shí)驗(yàn)以一式三份（N = 3)來(lái)實(shí)施Γρ〈0. 0l/p〈0. 05。
[0060] 圖17顯示了使用PGMA55-PHPMA135蠕蟲(chóng)凝膠，用于hES細(xì)胞集落的凝膠化/去凝膠 化過(guò)程。A)機(jī)械地收獲在t25容器內(nèi)的Nutristem中生長(zhǎng)的集落并且在8孔ibidi載玻片 上立即凝膠化。使含有細(xì)胞集落的凝膠在增濕的培養(yǎng)箱（5% C02/95%空氣）中于37°C維持 超過(guò)7、14或21天。B)在每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)之后，將ibidi孔置于冰上5分鐘以引起凝膠化。然 后將含有細(xì)胞集落的自由流動(dòng)的冷的共聚物分散體在含有Nutristem培養(yǎng)基的Cellstart 處理的6孔板中稀釋約10倍以釋放集落。
[0061] 圖18顯示了使用共聚焦顯微術(shù)對(duì)浸入PGMA55-PHPMA135蠕蟲(chóng)凝膠內(nèi)的hES細(xì)胞集 落的存活/死亡成像。在37°C使用Syto 9和碘化丙啶（PI)染料對(duì)浸入蠕蟲(chóng)凝膠（根據(jù) 方案3制備的）內(nèi)7、14或21天的細(xì)胞集落存活/死亡染色之后記錄的代表性熒光顯微圖 像。細(xì)胞可滲透的染料Syto-9報(bào)告細(xì)胞膜完整性（活細(xì)胞），而細(xì)胞不可滲透的染料PI僅 染色死細(xì)胞。Hoechst 33342被用作核復(fù)染劑。
[0062] 圖19顯示了 hES細(xì)胞集落在其于37°C在使用Nutristem制備的PGMA55-PHPMA135 蠕蟲(chóng)凝膠中長(zhǎng)期儲(chǔ)存之后的恢復(fù)。集落恢復(fù)％被計(jì)算為每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的平均集落恢復(fù)（在去 凝膠化之前將SEM對(duì)集落的初始數(shù)目歸一化）。集落損耗％也被相似地評(píng)價(jià)。內(nèi)部對(duì)照組 也被包含在該研究中，其中將集落浸入蠕蟲(chóng)凝膠中約l〇min，冷卻至5°C以引起去凝膠化并 且隨后通過(guò)離心分離。實(shí)驗(yàn)在一式三份的孔的樣品中執(zhí)行，η = 3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。
[0063] 圖20顯示了原始hES集落大小對(duì)在37°C于蠕蟲(chóng)凝膠中長(zhǎng)期儲(chǔ)存14天之后、隨 后經(jīng)由冷卻至5°C的去凝膠化的分離的集落恢復(fù)的影響。將hES集落機(jī)械地分散在包含 Nutristem細(xì)胞培養(yǎng)基的水性PGMA-PHPMA蠕蟲(chóng)凝膠中并且在37°C儲(chǔ)存14天。然后將集落 通過(guò)冷卻至5°C的去凝膠化分離并且隨后將集落平鋪在Cellstart和Nutristem液體培養(yǎng) 基上。（A)-(E)培養(yǎng)5天后多種hES細(xì)胞集落的光學(xué)顯微圖像。小集落（〈100 μπι)表現(xiàn)出 (Α)隨時(shí)間推移最小的生長(zhǎng)和分化或（Β)在去凝膠化之后未能旺盛生長(zhǎng)。（C)對(duì)于尺寸大 于100 μ m的集落，獲得了改進(jìn)的附著和生長(zhǎng)并且（D)對(duì)于100-200 μ m的集落，獲得了最佳 生長(zhǎng)，其還表現(xiàn)出典型的ES細(xì)胞形態(tài)。（E)在高密度培養(yǎng)物中，在相對(duì)大的（》200 μπι)集 落的邊緣觀察到分化的神經(jīng)元細(xì)胞。痕跡線(xiàn)表示初始去凝膠化后原始集落大小。
[0064] 圖21顯示了在37°C浸入6% w/v PGMA55-PHPMA135蠕蟲(chóng)凝膠內(nèi)直至21天的hES細(xì) 胞的增殖曲線(xiàn)。集落通過(guò)在相關(guān)時(shí)間點(diǎn)（〇、7、14和21天）的去凝膠化而被收獲并且收獲 并定量總DNA，如在實(shí)施例9中描述的。將數(shù)據(jù)對(duì)從在第0天接種的集落獲得的初始DNA量 歸一化（作為100% )。數(shù)據(jù)代表一式兩份的孔中執(zhí)行的η = 3次實(shí)驗(yàn)的平均值。光學(xué)顯 微圖像（參見(jiàn)插圖）表明集落大小隨時(shí)間推移的非常小的變化，其與非增殖的觀察結(jié)果是 一致的。
[0065] 圖22顯示了免疫標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，其如在實(shí)施例9中描述的被實(shí)施。（Α)在液體培養(yǎng)基 和Cellstart基質(zhì)中正常增殖期間hES細(xì)胞集落針對(duì)ki-67被陽(yáng)性染色。然后將集落機(jī) 械地移除并且在37°C浸入含有Nutristem培養(yǎng)基的PGMA55-PHPMA135蠕蟲(chóng)凝膠內(nèi)持續(xù)（B) 7 天、（D) 14天和（F) 21天。盡管浸入蠕蟲(chóng)凝膠內(nèi)，對(duì)任何細(xì)胞集落（B、D和F)都未檢測(cè)到 ki-67蛋白質(zhì)。在（C)7天、（E) 14天和（G)21天之后通過(guò)去凝膠化分離集落，再平鋪至用 Cellstart包被的孔上并且在Nutristem培養(yǎng)基中生長(zhǎng)5天，然后實(shí)施另外的ki-67的免疫 標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。在所有情況（參見(jiàn)C、E和G)中，ki-67的存在通過(guò)陽(yáng)性染色（Cy3,紅色）來(lái)確 認(rèn)。核復(fù)染劑（Hoechst 33342,藍(lán)色）。實(shí)驗(yàn)在一式三份的孔中執(zhí)行，η = 3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。
[0066] 圖23顯示了在18-22°C儲(chǔ)存直至72h之后hES細(xì)胞集落的恢復(fù)。在每一個(gè)時(shí)間點(diǎn) (即24h、48h或72h)之后，將儲(chǔ)存在液體Nutristem中的hES細(xì)胞集落返回至正常細(xì)胞培 養(yǎng)條件（37°C，于增濕的培養(yǎng)箱（5% C02/95%空氣）中），而將儲(chǔ)存在6% PGMA55-PHPMA135 蠕蟲(chóng)凝膠內(nèi)的hES細(xì)胞集落通過(guò)去凝膠化分離，如之前描述的。將細(xì)胞集落留置在細(xì)胞培 養(yǎng)箱中過(guò)夜以恢復(fù)。光學(xué)顯微圖像表明在16h的恢復(fù)時(shí)間段之后細(xì)胞集落的典型外觀。
[0067] 圖24顯示了于37°C在傳統(tǒng)的液體3i細(xì)胞培養(yǎng)基或使用相同的3i培養(yǎng)基制備的 6% PGMA55-PHPMA135蠕蟲(chóng)凝膠內(nèi)儲(chǔ)存24h之后的hES細(xì)胞恢復(fù)。（A)將于37°C在傳統(tǒng)的液 體3i培養(yǎng)基內(nèi)儲(chǔ)存24h的個(gè)體hES細(xì)胞的懸浮液在Cellstart包被的6孔板上培養(yǎng)。（B) 于37°C在增濕的培養(yǎng)箱（5% C02/95%空氣）中儲(chǔ)存24h之后將浸入6% PGMA55-PHPMA135蠕 蟲(chóng)凝膠內(nèi)的hES細(xì)胞通過(guò)去凝膠化分離并且平鋪在Cellstart包被的6孔板上。允許細(xì)胞 培養(yǎng)物粘附至Cellstart包被的6孔板上16h并且然后通過(guò)光學(xué)顯微術(shù)檢查。不考慮其儲(chǔ) 存條件，觀察到與多能性干細(xì)胞有關(guān)的典型形態(tài)。
[0068] 圖25顯示了（a)在1. 0%的應(yīng)用的應(yīng)變和1. Orad s 1的固定的角頻率下，凝膠強(qiáng) 度（G<、G")對(duì)將6%w/v PGMA55-PHPMA135蠕蟲(chóng)凝膠（根據(jù)方案3通過(guò)將冷凍干燥的共聚 物粉末在4°C分散入多種水性培養(yǎng)基中制備；詳細(xì)請(qǐng)參見(jiàn)標(biāo)記）從37°C冷卻至2°C的溫度 依賴(lài)性。（b)凝膠強(qiáng)度（G<、G")在lrads 1的角頻率、37°C下隨應(yīng)用的應(yīng)變的變化。（C) 對(duì)于多種細(xì)胞培養(yǎng)基中的6%w/v PGMA55-PHPMA135蠕蟲(chóng)凝膠，凝膠強(qiáng)度（G<、G")隨角頻 率（在1. 0%的固定的應(yīng)用應(yīng)變下）的變化。
[0069] 發(fā)明詳述
[0070] 定義
[0071] 除非有相反的特別聲明，根據(jù)1巴的一般大氣壓的推定給出所有溫度、溫度范圍、 和對(duì)應(yīng)所述溫度的材料的任何特征/特性。
[0072] 本文中，術(shù)語(yǔ)"干細(xì)胞"指的是可以分裂并分化為廣泛范圍的特定細(xì)胞類(lèi)型的細(xì) 胞，并且還可以自我更新/復(fù)制以產(chǎn)生呈其未分化狀態(tài)的更多干細(xì)胞。盡管干細(xì)胞現(xiàn)在可 以人工生長(zhǎng)，但是哺乳動(dòng)物干細(xì)胞包括從囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離的"胚胎干細(xì)胞"，以及在包 括以下的多種組織中發(fā)現(xiàn)的"成體干細(xì)胞"：
[0073] -骨髓，其需要通過(guò)鉆入骨骼（例如股骨或髂骨）中提取；
[0074] -脂肪組織（脂質(zhì)細(xì)胞），其需要通過(guò)抽脂術(shù)提取；
[0075] -血液，其需要通過(guò)單采術(shù)（pheresis)提取，其中血液從供體提取，通過(guò)提取干細(xì) 胞的機(jī)器并且將血液的其他部分返回至供體；以及
[0076] -剛出生后的臍帶血。
[0077] 本文中，"干細(xì)胞"包括全能性（totipotent)和多能性（pluripotent)干細(xì)胞（其 可以成熟為任何細(xì)胞類(lèi)型），以及多能（multipotent)或單能（unipotent)祖細(xì)胞（在其 能變成的細(xì)胞類(lèi)型方面其是更局限的）。最合適地，用于本發(fā)明的"干細(xì)胞"包括全能性和 /或多能性干細(xì)胞，特別是多能性干細(xì)胞。
[0078] 本文中，術(shù)語(yǔ)"全能性"指的是可以分化為胚胎和胚外細(xì)胞類(lèi)型并且可以導(dǎo)致完整 的活的生物體的構(gòu)建的干細(xì)胞。此類(lèi)細(xì)胞通過(guò)融合卵細(xì)胞和精細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生，并且通過(guò)受精 卵的最初幾個(gè)循環(huán)的分裂來(lái)進(jìn)一步產(chǎn)生。
[0079] 本文中，術(shù)語(yǔ)"多能性"指的是已經(jīng)從全能性干細(xì)胞傳代的干細(xì)胞，并且其可分化 為來(lái)自以下三個(gè)胚層的任何一種的基本上所有細(xì)胞類(lèi)型：即內(nèi)胚層（內(nèi)部胃黏膜、胃腸道、 肺）、中胚層（肌肉、骨骼、血液、泌尿生殖器）或外胚層（表皮組織和神經(jīng)系統(tǒng)）。盡管多 能性細(xì)胞可以導(dǎo)致任何胎兒或成體細(xì)胞類(lèi)型，但是其自身不能發(fā)育成胎兒或成體生物體， 因?yàn)槠淙鄙俅俪膳咄饨M織（例如，胎盤(pán)）的能力。多能性干細(xì)胞（諸如卵裂球）可以從哺 乳動(dòng)物胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ICM)獲得。
[0080] 本文中，術(shù)語(yǔ)"多能"或"多能祖細(xì)胞"指的是仍可以分化為許多細(xì)胞類(lèi)型，但僅是 密切相關(guān)家族的那些的干細(xì)胞。如此，多能細(xì)胞具有比全能性或多能性干細(xì)胞更局限的命 運(yùn)。多能祖細(xì)胞可以長(zhǎng)時(shí)間自我更新，但不同于多能性干細(xì)胞，并不是無(wú)限期地。多能祖細(xì) 胞也已經(jīng)被稱(chēng)為"成體干細(xì)胞"或"間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞"以表示存在于非胚胎生物體的組織中 的細(xì)胞。例如，多能祖細(xì)胞可以從骨髓、臍帶血、外周血、乳房、肝臟、皮膚、胃腸道、胎盤(pán)和子 宮獲得。多能祖細(xì)胞可以包括能夠分化為神經(jīng)元細(xì)胞的神經(jīng)元干細(xì)胞、能夠分化為血細(xì)胞 的造血干細(xì)胞、能夠分化為骨骼、軟骨、脂肪和肌肉的間充質(zhì)干細(xì)胞、以及能夠分化為肝細(xì) 胞的肝干細(xì)胞。
[0081] 本文中，術(shù)語(yǔ)"分化的細(xì)胞"指的是注定成為特定細(xì)胞類(lèi)型且通常不能夠分化為其 他細(xì)胞類(lèi)型的細(xì)胞。例如，分化的細(xì)胞的實(shí)例包括內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、橫紋肌、皮膚和間 質(zhì)成纖維細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞（例如，星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞）、心肌細(xì)胞、肝 細(xì)胞和胰腺細(xì)胞。
[0082] 本文中，"未分化的細(xì)胞"是還沒(méi)有變?yōu)樘囟?xì)胞類(lèi)型的干細(xì)胞。
[0083] 本文中，提及"分化后的干細(xì)胞"意指根據(jù)本發(fā)明即使用本文描述的干細(xì)胞培養(yǎng)基 已經(jīng)分化的干細(xì)胞，并且除非另外聲明不意圖包括已經(jīng)通過(guò)任何其他方法分化的干細(xì)胞。
[0084] 本文中，分化的細(xì)胞和多能祖細(xì)胞包括來(lái)源于任何動(dòng)物不論是人、猴、豬、馬、牛、 綿羊、狗、貓、小鼠或大鼠的那些，優(yōu)選地來(lái)源于人的那些。
[0085] 本文中，術(shù)語(yǔ)"水性媒介物"指的是合成的熱響應(yīng)的共聚物分散遍布其中以形成本 發(fā)明的培養(yǎng)基的培養(yǎng)基。水性媒介物必要地包括延長(zhǎng)儲(chǔ)存于其中的干細(xì)胞的活力的營(yíng)養(yǎng) 物。如此，水性媒介物可以簡(jiǎn)單地允許干細(xì)胞存活。但是，水性媒介物可以是或可以包含促 進(jìn)干細(xì)胞生長(zhǎng)（即復(fù)制）和存活的培養(yǎng)基。此外，水性媒介物可以是、可以包含或可在其中 加入其他分化劑的生長(zhǎng)因子，以促進(jìn)干細(xì)胞的原位（in situ)分化。
[0086] 本文中，術(shù)語(yǔ)"培養(yǎng)基"，特別是"標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基"指的是使哺乳動(dòng)物細(xì)胞能夠體外 生長(zhǎng)和存活的培養(yǎng)基。用于本發(fā)明的培養(yǎng)基可包括本領(lǐng)域中通常使用的所有有關(guān)的培養(yǎng) 基。培養(yǎng)基可以是細(xì)胞培養(yǎng)最低培養(yǎng)基（CCMM)，其通常包含碳源、氮源和微量元素 。CCMM 的實(shí)例包括，但不限于DMEM(Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基）、MEM(最低必需培養(yǎng)基）、 BME (Eagle 基本培養(yǎng)基）、RPMI1640、F-10、F-12、α ΜΕΜ(α 最低必需培養(yǎng)基）、GMEM(Glasgow 最低必需培養(yǎng)基）、和IMDM(Iscove改良的Dulbecco培養(yǎng)基）。用于本發(fā)明的培養(yǎng)基還可 以包含許多不同添加劑的一種或更多種，如本領(lǐng)域中已知的，例如抗生素諸如青霉素、鏈霉 素、慶大霉素或其組合、氨基酸、維生素、胎牛血清或其替代物。
[0087] 本文中，關(guān)于細(xì)胞的術(shù)語(yǔ)"培養(yǎng)的（caltured) "意指在受控制的環(huán)境條件下，通常 維持在37°C并且含有用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的約21 %的氧和約5-10%的0)2的環(huán)境中，在定義 的培養(yǎng)基存在下生長(zhǎng)的細(xì)胞群體。相似地，術(shù)語(yǔ)"培養(yǎng)（culturing)"指的是通過(guò)在受控制 的環(huán)境條件下，通常維持在設(shè)定的溫度并提供定義的氧和C0 2的濃度以及任選地其它參數(shù) 諸如濕度的培養(yǎng)箱中，并且以設(shè)定的速率以受控制的方式攪動(dòng)使感興趣的一種細(xì)胞或多種 細(xì)胞生長(zhǎng)，來(lái)產(chǎn)生細(xì)胞的擴(kuò)大的群體的過(guò)程。
[0088] 本文中，術(shù)語(yǔ)"有活力的"，當(dāng)關(guān)于細(xì)胞使用時(shí)，指活細(xì)胞。
[0089] 本文中，術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞活力"指的是在給定的樣品中活細(xì)胞的比例，其可以通過(guò)本領(lǐng) 域中熟知的方法來(lái)評(píng)價(jià)。
[0090] 本文中，術(shù)語(yǔ)諸如"保存的活力"、"持續(xù)的活力"、"延長(zhǎng)的活力"、"持續(xù)的儲(chǔ)存壽 命"、"延長(zhǎng)的維持"和"延長(zhǎng)的存活"可交換地使用，并且指的是與未被本發(fā)明的處理方法 (例如，儲(chǔ)存/保存的方法）之一處理的細(xì)胞群體或其樣品相比，在經(jīng)受如此處理的細(xì)胞群 體中存活的活細(xì)胞的較大比例。
[0091] 本文中，術(shù)語(yǔ)"室溫"指的是在20°C至26°C范圍內(nèi)的溫度。
[0092] 本文中，術(shù)語(yǔ)"環(huán)境溫度"指的是在約18°C至約32°C范圍內(nèi)的溫度。
[0093] 在低于其或高于其干細(xì)胞培養(yǎng)基變成或開(kāi)始變成凝膠狀的溫度在本文中被稱(chēng)作 "膠凝溫度（gelling tempreture)"。本文中，調(diào)整溫度"跨過(guò)"膠凝溫度意指降低溫度低于 膠凝溫度（在其中當(dāng)從某點(diǎn)降低溫度之后培養(yǎng)基變成凝膠狀的實(shí)施方案中）或升高溫度高 于膠凝溫度（在其中當(dāng)從某點(diǎn)升高溫度之后培養(yǎng)基變成凝膠狀的實(shí)施方案中）。
[0094] 本文中，術(shù)語(yǔ)"凝膠狀"被用來(lái)描述物質(zhì)（例如干細(xì)胞培養(yǎng)基）的凝膠（即膠狀的） 形式。盡管凝膠可以是硬的或軟的，但是通常本發(fā)明的培養(yǎng)基的凝膠形式是軟的。此類(lèi)凝 膠是非流體的并且通常以其穩(wěn)定的狀態(tài)不會(huì)流動(dòng)。
[0095] 本文中，術(shù)語(yǔ)"非凝膠狀"被用來(lái)描述物質(zhì)諸如干細(xì)胞培養(yǎng)基的（大體上）的流體 形式。此類(lèi)流體形式通常表現(xiàn)出可流動(dòng)的特性。
[0096] 一般描述
[0097] 本發(fā)明本質(zhì)上提供了用于干細(xì)胞的培養(yǎng)基（即干細(xì)胞培養(yǎng)基），所述培養(yǎng)基能夠 經(jīng)受可逆凝膠化。因此，該培養(yǎng)基可以通過(guò)簡(jiǎn)單地調(diào)整溫度跨過(guò)培養(yǎng)基的凝膠化溫度在非 凝膠狀（流體）形式和凝膠狀形式之間容易地"轉(zhuǎn)換"。如此，干細(xì)胞可以通過(guò)以下被容易 地捕獲在3D凝膠基質(zhì)中：將干細(xì)胞與非凝膠狀/流體形式的培養(yǎng)基簡(jiǎn)單地混合、并且然后 通過(guò)調(diào)整溫度跨過(guò)培養(yǎng)基的膠凝溫度來(lái)使培養(yǎng)基膠凝。被包封在凝膠狀形式的培養(yǎng)基內(nèi)的 干細(xì)胞然后可在直接使用培養(yǎng)基內(nèi)的干細(xì)胞之前（例如，在治療中或在培養(yǎng)、分化等中）、 或在所述干細(xì)胞從培養(yǎng)基提取之后的使用之前被保存很長(zhǎng)時(shí)間段。
[0098] 另外，膠凝的培養(yǎng)基可以被用作用于干細(xì)胞的3D培養(yǎng)和/或分化的培養(yǎng)基。培養(yǎng) 基內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物可以被改變以促進(jìn)干細(xì)胞的培養(yǎng)。另外的營(yíng)養(yǎng)物、生長(zhǎng)因子或孵育條件可以 被用來(lái)促進(jìn)干細(xì)胞分化。如此，本發(fā)明的培養(yǎng)基用途極其廣泛。
[0099] 由于本發(fā)明的培養(yǎng)基可以適用于在環(huán)境溫度或室溫下干細(xì)胞的相對(duì)長(zhǎng)期儲(chǔ)存，提 供了更便利、有成本效益且節(jié)能的干細(xì)胞儲(chǔ)存系統(tǒng)。特別是，本發(fā)明的培養(yǎng)基可以緩解對(duì)用 于干細(xì)胞的長(zhǎng)期儲(chǔ)存和/或運(yùn)輸?shù)陌嘿F的冷卻系統(tǒng)的需求。
[0100] 用以產(chǎn)生本發(fā)明的培養(yǎng)基的材料是相對(duì)便宜的并且可以使用穩(wěn)健的且可擴(kuò)展的 合成化學(xué)技術(shù)來(lái)容易地產(chǎn)生。
[0101] 考慮到本發(fā)明的培養(yǎng)基是完全合成的，待儲(chǔ)存的干細(xì)胞不存在生物污染或干擾的 風(fēng)險(xiǎn)（不同于當(dāng)動(dòng)物來(lái)源的產(chǎn)品被用來(lái)形成此類(lèi)培養(yǎng)基時(shí)）。此外，本發(fā)明的培養(yǎng)基的合成 性質(zhì)有助于更好的批次間再現(xiàn)性并且從而降低不期望的變化性，所述不期望的變化性通常 與生物來(lái)源的產(chǎn)品諸如動(dòng)物蛋白質(zhì)的使用相關(guān)。本發(fā)明共聚物的合成性質(zhì)還允許培養(yǎng)基的 合理調(diào)整以?xún)?yōu)化特性，如需要的。
[0102] 本發(fā)明的培養(yǎng)基與干細(xì)胞生物相容并且對(duì)其無(wú)毒。凝膠狀形式的培養(yǎng)基的相對(duì)柔 軟性和滲透性使?fàn)I養(yǎng)物能夠容易地?cái)U(kuò)散遍及培養(yǎng)基以確保其中包含的干細(xì)胞被合適地滋 養(yǎng)并且從而被保存。
[0103] 本發(fā)明的培養(yǎng)基易于滅菌，因?yàn)槠浞悄z狀形式可以通過(guò)過(guò)濾容易地滅菌（熱響 應(yīng)共聚物的顆粒的小的尺寸和呈該形式的培養(yǎng)基的流體性質(zhì)）。
[0104] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的培養(yǎng)基還是透明的，其使干細(xì)胞能夠例如使用光 學(xué)顯微鏡在培養(yǎng)基自身中被研究。當(dāng)培養(yǎng)基另外被用于培養(yǎng)被研究的干細(xì)胞和/或使其分 化時(shí)，這是特別地有用的。
[0105] 培養(yǎng)基的可轉(zhuǎn)換形式使干細(xì)胞能夠在容器之間靈巧地轉(zhuǎn)移，并且還可以有助于干 細(xì)胞的準(zhǔn)確的體積測(cè)量和分配。
[0106] 本發(fā)明的培養(yǎng)基的可逆凝膠化使能夠靈巧操作儲(chǔ)存于其中的干細(xì)胞，因?yàn)槠淇梢?在被釋放入非凝膠狀流體形式之前在凝膠狀形式的培養(yǎng)基內(nèi)儲(chǔ)存一段時(shí)間以使干細(xì)胞在 被重新捕獲到凝膠狀形式的培養(yǎng)基內(nèi)之前能夠接收另外的營(yíng)養(yǎng)物。
[0107] 本發(fā)明的培養(yǎng)基還是生物相容的，所以培養(yǎng)基自身可以用作用于干細(xì)胞的治療性 施用的藥物載體（carrier)或媒介物（vehicle)，無(wú)論是作為植入物的部分、貼劑或干細(xì)胞 的其他合適的施用形式。此外，培養(yǎng)基可以被調(diào)整使得膠凝溫度對(duì)于設(shè)想的任何一種治療 用途是合適的。
[0108] 本發(fā)明的培養(yǎng)基的許多其他優(yōu)勢(shì)將從以下的描述是明顯的。
[0109] 培養(yǎng)基
[0110] 本發(fā)明提供了用于干細(xì)胞的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包含分散在水性媒介物中的合成 的熱響應(yīng)共聚物的顆粒；
[0111] 其中培養(yǎng)基能夠響應(yīng)溫度變化經(jīng)受非凝膠狀形式和凝膠狀形式之間的變化，并且 在非凝膠狀形式中，培養(yǎng)基包含合成的熱響應(yīng)共聚物的顆粒的膠狀穩(wěn)定的水性分散體，并 且在凝膠狀形式中，培養(yǎng)基提供能夠容納干細(xì)胞的支架或基質(zhì)；
[0112] 并且其中水性媒介物還包括用于維持干細(xì)胞的活力的營(yíng)養(yǎng)物。
[0113] 合適地，培養(yǎng)基是干細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0114] 由于合成的熱響應(yīng)共聚物的顆粒的存在，培養(yǎng)基合適地是熱響應(yīng)的。
[0115] 培養(yǎng)基合適地能夠響應(yīng)溫度變化經(jīng)受非凝膠狀形式和凝膠狀形式之間的可逆變 化。這意味著可逆凝膠化的至少一個(gè)循環(huán)可以被實(shí)施，即凝膠化和隨后的去凝膠化（即流 體化）的至少一個(gè)循環(huán)可（通過(guò)合適的溫度變化）被選擇性地引起。在特定的實(shí)施方案中， 培養(yǎng)基能夠經(jīng)過(guò)多于一個(gè)循環(huán)可逆凝膠化，并且合適地可逆凝膠化經(jīng)過(guò)多個(gè)凝膠化和去凝 膠化的循環(huán)被保持。此類(lèi)可逆凝膠化允許干細(xì)胞重復(fù)地被捕獲/包封入本發(fā)明的膠凝的干 細(xì)胞組合物中并且然后從其釋放。
[0116] 培養(yǎng)基的非凝膠狀形式和凝膠狀形式之間的轉(zhuǎn)變（并且反之亦然），合適地通過(guò) 培養(yǎng)基的相變或狀態(tài)改變來(lái)表征。相變合適地是由于熱響應(yīng)共聚物的顆粒的形態(tài)的溫度依 賴(lài)性改變。在宏觀尺度上，培養(yǎng)基的相變通過(guò)培養(yǎng)基的粘度的改變來(lái)表征。培養(yǎng)基的非凝 膠狀形式是相對(duì)地自由流動(dòng)的流體并且因此具有相對(duì)低的粘度，而凝膠狀形式是基本上無(wú) 需支撐的（free-standing)凝膠，其不能自由流動(dòng)并且因此具有相對(duì)高的粘度。
[0117] 培養(yǎng)基的凝膠狀形式合適地是相對(duì)軟的凝膠。
[0118] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基在低于膠凝溫度的溫度下以非凝膠狀形式存在并且 在高于培養(yǎng)基的膠凝溫度的溫度下以凝膠狀形式存在。
[0119] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基在環(huán)境溫度和/或在室溫下是凝膠狀形式。合適地， 在大于或等于15°C、合適地大于或等于20°C、合適地大于或等于30°C的溫度下是凝膠狀 形式。合適地，培養(yǎng)基在35°C和40°C之間的溫度下是凝膠狀形式。合適地，培養(yǎng)基在直至 45°C、合適地直至60°C的溫度下保持凝膠狀形式。
[0120] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基在小于或等于10°C、合適地小于或等于5°C的溫度 下是非凝膠狀形式。合適地，培養(yǎng)基在低至〇°C、合適地低至-5°C的溫度下保持非凝膠狀形 式。
[0121] 合適地，干細(xì)胞培養(yǎng)基的"膠凝溫度"在5°C和30°C之間、合適地在10°C和25°C之 間、合適地在15°C和20°C之間。培養(yǎng)基的膠凝溫度和特性可以通過(guò)調(diào)整某種關(guān)鍵參數(shù)諸如 熱響應(yīng)共聚物或其部分的聚合度、熱響應(yīng)共聚物的親水性/疏水性平衡、存在于熱響應(yīng)共 聚物中的特定單體等來(lái)改變。如此，本發(fā)明提供了調(diào)整用于關(guān)注的特定應(yīng)用的培養(yǎng)基的膠 凝溫度的方法。
[0122] 培養(yǎng)基合適地是生物相容的。特別地，培養(yǎng)基自身合適地是對(duì)細(xì)胞無(wú)毒的，特別是 對(duì)干細(xì)胞無(wú)毒的。合適地，在其中存在合適的營(yíng)養(yǎng)物的培養(yǎng)基中儲(chǔ)存干細(xì)胞將保存所述干 細(xì)胞的活力。
[0123] 培養(yǎng)基合適地是與哺乳動(dòng)物細(xì)胞特別是人細(xì)胞生物相容的（例如，當(dāng)并入用于治 療應(yīng)用的組合物諸如藥物組合物中時(shí)），并且合適地以治療有效量對(duì)哺乳動(dòng)物物種和/或 細(xì)胞是無(wú)毒的。這允許培養(yǎng)基用作用于施用干細(xì)胞治療（或來(lái)源于干細(xì)胞的分化的細(xì)胞的 治療）的媒介物或藥物載體。
[0124] 培養(yǎng)基合適地以凝膠狀形式是透明的，或至少足夠透明以允許用裸眼和/或通過(guò) 合適的放大倍數(shù)（例如使用光學(xué)或共聚焦顯微鏡）觀察凝膠狀培養(yǎng)基內(nèi)捕獲的任何細(xì)胞。 培養(yǎng)基合適地以非凝膠狀形式是透明的，或至少足夠透明以允許分散于其中的任何細(xì)胞通 過(guò)裸眼和/或通過(guò)合適的放大倍數(shù)（例如使用光學(xué)或共聚焦顯微鏡）是可視的。這樣的透 明度允許原位分析培養(yǎng)基內(nèi)的細(xì)胞。
[0125] 培養(yǎng)基（任何干細(xì)胞/分化后的細(xì)胞除外）合適地不含動(dòng)物來(lái)源的產(chǎn)品。合適地， 本發(fā)明的培養(yǎng)基無(wú)任何熱響應(yīng)蛋白質(zhì)、肽或從生物（例如動(dòng)物）來(lái)源獲得的其他生物聚合 物。例如，熱響應(yīng)共聚物合適地是完全合成的。培養(yǎng)基內(nèi)使用的熱響應(yīng)共聚物的合成性質(zhì) 允許最小化批次間變化（與使用生物體來(lái)源的熱響應(yīng)共聚物的培養(yǎng)基截然不同）并且從而 改進(jìn)本發(fā)明的干細(xì)胞培養(yǎng)基的可靠性。
[0126] 在凝膠形式中，培養(yǎng)基提供了特別地適于儲(chǔ)存、保存、培養(yǎng)和/分化干細(xì)胞的3D支 架或基質(zhì)。合適地，支架有效地模擬體內(nèi)（in vivo)發(fā)現(xiàn)的三維（3D)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM)。
[0127] 本發(fā)明的培養(yǎng)基被合適地配置以允許在凝膠狀形式的培養(yǎng)基中選擇性捕獲或包 封干細(xì)胞。然后，干細(xì)胞隨后可以被釋放并且通過(guò)將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換回非凝膠狀形式來(lái)分離。例 如，干細(xì)胞可通過(guò)以下被合適地包封在凝膠狀培養(yǎng)基內(nèi)：首先將所述干細(xì)胞與非凝膠狀形 式的培養(yǎng)基混合并且然后通過(guò)調(diào)整溫度跨過(guò)膠凝溫度使得培養(yǎng)基改變?yōu)槠淠z狀形式，從 而將干細(xì)胞包封在凝膠狀形式的培養(yǎng)基內(nèi)。這提供了膠凝的干細(xì)胞組合物。然后干細(xì)胞可 在膠凝的干細(xì)胞組合物內(nèi)被儲(chǔ)存、保存、培養(yǎng)和/或分化。干細(xì)胞可通過(guò)以下從膠凝的干細(xì) 胞組合物/基質(zhì)合適地釋放：再次通過(guò)調(diào)整溫度跨過(guò)膠凝溫度，使得培養(yǎng)基改變?yōu)槠浞悄?膠狀形式。任選地，然后干細(xì)胞可以通過(guò)重復(fù)整個(gè)過(guò)程而被捕獲在凝膠狀培養(yǎng)基內(nèi)。
[0128] 當(dāng)干細(xì)胞從凝膠狀形式的培養(yǎng)基被釋放時(shí)（例如通過(guò)使得干細(xì)胞培養(yǎng)基改變?yōu)?其非凝膠狀形式），其可通過(guò)本領(lǐng)域中熟知的方法（諸如超濾法和/或離心）合適地從非凝 膠狀形式的培養(yǎng)基提取。
[0129] 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的是，以上概述的過(guò)程不會(huì)影響干細(xì)胞的活力。因此，本發(fā)明的培養(yǎng)基是 用于儲(chǔ)存/保存、培養(yǎng)和/或分化干細(xì)胞的有用的工具，并且為使用干細(xì)胞的研究者、制造 者、治療專(zhuān)家和臨床醫(yī)生提供了明顯的益處。
[0130] 本發(fā)明的培養(yǎng)基合適地包含1%和30% w/w之間的合成的熱響應(yīng)共聚物，合適地 2%和20% w/w之間的合成的熱響應(yīng)共聚物，合適地3%和12% w/w之間的合成的熱響應(yīng)共 聚物。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的培養(yǎng)基包含3%和7% w/w之間的合成的熱響應(yīng)共聚 物。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的培養(yǎng)基包含8%和12% w/w之間的合成的熱響應(yīng)共聚 物。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的培養(yǎng)基包含5%和12% w/w之間的合成的熱響應(yīng)共聚 物。
[0131] 本發(fā)明的培養(yǎng)基包含用于維持干細(xì)胞的活力的營(yíng)養(yǎng)物。可以將此類(lèi)營(yíng)養(yǎng)物直接添 加至合成的熱響應(yīng)共聚物或其分散體以便稀釋合成的熱響應(yīng)共聚物?？蛇x地，可通過(guò)透析 將此類(lèi)營(yíng)養(yǎng)物引入合成的熱響應(yīng)共聚物的分散體。可選地，可通過(guò)透析方法和直接添加的 組合將此類(lèi)營(yíng)養(yǎng)物引入培養(yǎng)基。
[0132] 合適地，干細(xì)胞培養(yǎng)基（基本上）不含表面活性劑，合適地包含小于或等于lwt% 表面活性劑、合適地小于或等于0. 5wt%表面活性劑、合適地小于或等于0. lwt%表面活性 劑、合適地包含零表面活性劑。
[0133] 合適地，干細(xì)胞培養(yǎng)基（基本上）不含十二烷基磺酸鈉（即有時(shí)在RAFT聚合反應(yīng) 中使用的一種類(lèi)型的表面活性劑），合適地包含小于或等于lwt%十二烷基磺酸鈉、合適地 小于或等于〇. 5wt %十二烷基磺酸鈉、合適地小于或等于0. lwt %十二烷基磺酸鈉、合適地 包含零十二烷基磺酸鈉。
[0134] 合成的熱響應(yīng)共聚物的顆粒
[0135] 合成的熱響應(yīng)共聚物合適地是合成的，即，其通過(guò)合成化學(xué)技術(shù)形成而不是生物 來(lái)源的。
[0136] 熱響應(yīng)共聚物合適地是生物相容的，并且合適地對(duì)干細(xì)胞是無(wú)毒的。合適地，熱響 應(yīng)共聚物（基本上）不含表面活性劑。合適地，熱響應(yīng)共聚物（基本上）不含十二烷基磺 酸鈉。
[0137] 熱響應(yīng)共聚物合適地在水性媒介物中形成膠束顆粒。這些顆粒合適地經(jīng)受形態(tài) 方面的溫度依賴(lài)的改變并且該形態(tài)方面的改變被理解為使得培養(yǎng)基從非膠凝的狀態(tài)改 變成膠凝的狀態(tài)。合適地，形成核心的鏈（即P 2)是熱響應(yīng)的，其合適地是（基本上）水 (aqueous)/水（water)不溶性的或合適地否則是疏水性的（至少相對(duì)于穩(wěn)定劑鏈（即 PJ)。合適地，穩(wěn)定劑鏈（即PJ相比形成核心的鏈（即P2)是較不熱響應(yīng)的并且最合適地 穩(wěn)定劑鏈（基本上）是非熱響應(yīng)的，其合適地是（基本上）水溶性的/可溶于水的或合適 地否則是親水性的（至少相對(duì)于形成核心的鏈（即P 2))。因此，合適地，形成核心的鏈?zhǔn)枪?聚物的熱響應(yīng)行為的原因。這合適地通過(guò)經(jīng)由以下形成熱響應(yīng)共聚物的顆粒來(lái)實(shí)現(xiàn)：以包 括式A的部分（參見(jiàn)以下-這涉及Pi部分）的預(yù)形成的水溶性聚合物開(kāi)始，并且在（基本 上）水溶性的/可溶于水的單體％的存在下（因?yàn)檫@促進(jìn)最佳顆粒的形成）通過(guò)經(jīng)由RAFT 聚合的鏈延伸在所述聚合物基礎(chǔ)上構(gòu)建另外的（基本上）水不溶性的/不可溶于水的嵌段 (P2)。合理地改變各共聚單體和聚合物的相對(duì)溶解度可以有助于形成這種性質(zhì)的熱響應(yīng)共 聚物。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言辨別個(gè)體聚合物嵌段是否是水溶性的/可溶于水的和/或 熱響應(yīng)的是簡(jiǎn)單的。
[0138] 顆粒經(jīng)受形態(tài)改變的溫度對(duì)應(yīng)于培養(yǎng)基的膠凝溫度。因此，在一些實(shí)施方案中，形 態(tài)改變發(fā)生在15°C和30°C之間、合適地10°C和30°C之間、合適地6°C和36°C之間。
[0139] 在培養(yǎng)基的"非凝膠狀形式"中，熱響應(yīng)共聚物的顆粒是聚合物顆粒的膠狀穩(wěn)定的 分散體。合適地，顆粒是大小小于500nm、并且更合適地小于100nm的納米顆粒。合適地，顆 粒基本上是球形（例如球體或類(lèi)球體顆粒），合適地為膠束的形式。該非凝膠狀形式天然地 比對(duì)應(yīng)的干細(xì)胞培養(yǎng)基的凝膠狀形式更具流動(dòng)性且粘性較小。培養(yǎng)基的非凝膠狀形式是自 由流動(dòng)的并且適于將干細(xì)胞混合在其中。
[0140] 在培養(yǎng)基的"凝膠狀形式"中，熱響應(yīng)共聚物的顆粒合適地是具有與非凝膠狀形式 中存在的顆粒不同形態(tài)的膠狀穩(wěn)定的聚合物顆粒。合適地，在培養(yǎng)基的"凝膠狀形式"中， 熱響應(yīng)共聚物的顆粒合適地是各向異性的"懦蟲(chóng)（worm) "或"懦蟲(chóng)狀（worm like) "顆粒。 這些細(xì)長(zhǎng)的顆粒彼此相互作用以形成培養(yǎng)基的凝膠狀形式。不希望被任何特定的理論所束 縛，認(rèn)為這些"蠕蟲(chóng)狀"顆粒彼此相互作用并且該相互作用被認(rèn)為引起培養(yǎng)基的"凝膠狀形 式"。干細(xì)胞培養(yǎng)基的凝膠狀形式雖然不能自由流動(dòng)但合適地是相對(duì)軟的，其促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物的 分散并且有助于容納活的干細(xì)胞并且從而延長(zhǎng)其活力。彈性模數(shù)（G'）通常是20-1000Pa、 合適地10-200Pa。
[0141] 此類(lèi)顆粒的形狀可以使用本領(lǐng)域中已知的合適的電子顯微鏡技術(shù)（例如SEM、 TEM)來(lái)適當(dāng)?shù)仳?yàn)證。
[0142] 熱響應(yīng)共聚物合適地具有1，000g/mol和100, 000g/mol之間、合適地5, 000g/mol 和 80, 000g/mol 之間、更合適地 7, 000g/mol 和 70, 000g/mol 之間、最合適地 10, 000g/mol 和60, 000g/mol之間的數(shù)均摩爾質(zhì)量（Mn)。
[0143] 熱響應(yīng)共聚物合適地具有數(shù)均摩爾質(zhì)量（Mn)和重均摩爾質(zhì)量（Mw)使得1/^在 1. 05和1. 50之間。
[0144] 無(wú)論在干細(xì)胞培養(yǎng)基的凝膠狀形式或非凝膠狀形式中，熱響應(yīng)共聚物的顆粒的性 質(zhì)取決于存在的溫度（即其決定共聚物形態(tài)）和共聚物自身的性質(zhì)（即在所研究的溫度下 其是否形成"球形"顆粒或"蠕蟲(chóng)狀"顆粒）。
[0145] 熱響應(yīng)共聚物合適地是兩性共聚物（即包括親水性和疏水性特性?xún)烧撸?。在許 多實(shí)施方案中，熱響應(yīng)共聚物包含至少一種親水性聚合物嵌段和至少一種疏水性聚合物嵌 段。
[0146] 合適地，熱響應(yīng)共聚物包含熱響應(yīng)聚合物嵌段。在特定的實(shí)施方案中，熱響應(yīng)共聚 物包含熱響應(yīng)聚合物嵌段和非熱響應(yīng)嵌段，其中非熱響應(yīng)聚合物嵌段合適地在〇°C和45°C 之間的溫度范圍中（基本上）是非熱響應(yīng)的。在特定的實(shí)施方案中，熱響應(yīng)共聚物包含熱 響應(yīng)的第一聚合物嵌段和相比第一聚合物嵌段是較不熱響應(yīng)的第二聚合物嵌段。
[0147] 在某些實(shí)施方案中，熱響應(yīng)共聚物可由式B來(lái)定義：
[0148]
[0149] 其中Pi表示源自單體M i的聚合物組分并且P 2表示源自水溶性單體Μ 2的基本上水 不溶性的聚合物組分。
[0150] 在一定程度上，Pi JpPjP Μ2可以由W0 2011/110841 Α2(謝菲爾德大學(xué)，2011年 3月8日提交）中給予其的含義的任一種來(lái)定義，這提供了根據(jù)本發(fā)明的熱響應(yīng)共聚物（即 適當(dāng)?shù)嘏懦朔菬犴憫?yīng)共聚物）。同樣地，在一定程度上，由式Β定義的熱響應(yīng)共聚物可以 通過(guò)W0 2011/110841 Α2(謝菲爾德大學(xué)，2011年3月8日提交）中定義的方法的任一種 來(lái)制備，這提供了根據(jù)本發(fā)明的熱響應(yīng)共聚物（即適當(dāng)?shù)嘏懦朔菬犴憫?yīng)共聚物）。如此， TO 2011/110841 Α2通過(guò)引用被并入本文。期望的熱響應(yīng)特性可以通過(guò)根據(jù)本發(fā)明將共聚 物分散在水或甚至水性媒介物內(nèi)并且檢查經(jīng)過(guò)"非凝膠狀"和"凝膠狀"形式之間轉(zhuǎn)換或反 之亦然的溫度范圍獲得的分散體來(lái)適當(dāng)?shù)仳?yàn)證。
[0151] 合適地，？1是至少部分水分溶性的/可溶于水的。合適地，P 1是（基本上上）水 溶性的/可溶于水的。合適地，Pi是比P 2更具水溶性/更加溶于水。
[0152]
[0153] 合適地，每一個(gè)單體吣選自式M1A、M1B和/或M 1C的單體：
[0154]
[0155] 其中R1、Rw和R 11表示允許P i是至少部分水溶性的M 1AS M i。的取代基，
[0156] R2代表 H、CH 3或 CN，
[0157] Rs代表有效允許Pi是至少部分水溶性的芳環(huán)的一個(gè)或更多個(gè)取代基，并且
[0158] 每一個(gè)單體M2選自式Μ 2A和/或Μ 2B的單體：
[0159]
[0160] 其中R3是允許P 2是基本上水不溶性的Μ 2的取代基，并且R4和R6獨(dú)立地表示Η或 甲基；
[0161] 或Pi是包括單體M i和單體Μ 2的共聚物，條件是聚合物P i保持水溶性。
[0162] 在本發(fā)明的實(shí)施方案中，？1是共聚物，其包括以上定義的式M1A、M 1B和M1C的兩個(gè)或 更多個(gè)單體吣。
[0163] 在可選的實(shí)施方案中，？1是包括選自以上定義的Μ 1A、M1B和M 1C的單體的單一單體 Mi的均聚物。
[0164] 在一個(gè)實(shí)施方案中，包括式Μ 1A或Μ 1B的單體的均聚物或共聚物。
[0165] 在一個(gè)實(shí)施方案中，？1是包括式Μ 1A的單體的均聚物或共聚物。
[0166] 在一個(gè)實(shí)施方案中，Pi是包括單體I和單體Μ 2A的共聚物，條件是聚合物Pi保持 水溶性。
[0167] 在本發(fā)明的另外的實(shí)施方案中，匕是共聚物，其中單體M2選自以上定義的式M 2A和 M2B的兩個(gè)或更多個(gè)單體。
[0168] 在可選的實(shí)施方案中，P2是包括選自式Μ 2A和Μ 2B的單體的單一單體Μ 2的均聚物。
[0169] 合適地，Ρ2是包括選自式Μ2Α的單體的單體Μ2的聚合物或共聚物。因此，在特定的 實(shí)施方案中，？ 2是包括式Μ 2Α的單體的聚合物或共聚物。
[0170] 在某些實(shí)施方案中，無(wú)論Ρ2是共聚物或均聚物，？2可以另外地包括交聯(lián)的單體單 元（諸如，例如EGDMA)。在其他實(shí)施方案中，？ 2不包括任何交聯(lián)的單體單元。
[0171] 在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，PJP Ρ2兩者均是如以上定義的均聚物。
[0172] 在一個(gè)實(shí)施方案中，熱響應(yīng)共聚物由式Β來(lái)定義，并且Pig身是包含單甲基丙烯 酸甘油酯（GMA)單體單元的聚合物或共聚物，并且匕自身是包含甲基丙烯酸2-羥基丙酯 (HPMA)單體單元的聚合物或共聚物。PJP/SP2可以是均聚體，例如分別是聚（單甲基丙 烯酸甘油酯）（PGMA)和聚（甲基丙烯酸2-羥基丙酯）（PHPMA)?？蛇x地P 2或P JP P 2 二者可以是共聚物或基本上是摻雜其他單體單元的均聚物。例如，鑒于？:可以是均聚物聚 (單甲基丙烯酸甘油酯）（PGMA)嵌段，P2可以是包括GMA和HPMA單體單元兩者的共聚物嵌 段或P 2可以是包括甲基丙烯酸二甘醇酯（DEGMA)和HPMA單體單元兩者的共聚物嵌段。
[0173] 在特定的實(shí)施方案中，熱響應(yīng)共聚物是選自包括以下的組的式BtPfPj的嵌段共 聚物：
[0174] 1. PGMA-PHPMA。PGMA嵌段可以合適地具有在10和200之間、合適地在25和100 之間、合適地在30和80之間的聚合度（DP)。PHPMA嵌段可以合適地具有在50和300之間、 合適地在60和280之間、合適地在70和250之間的聚合度（DP)。
[0175] 2. PGMA-P(GMA-HPMA)。PGMA嵌段可以合適地具有10至120的聚合度（DP)。 P(GMA-HPMA)嵌段可以合適地具有在20和200之間、合適地在50和150之間、合適地在70 和120之間的聚合度（DP)。在P(GMA-HPMA)嵌段內(nèi)的GMA與HPMA單體單元的比合適地在 10:1和1:10之間、合適地在1:1和1:5之間、合適地在1:2和1:3之間。
[0176] 3. PGMA-P(DEGMA-HPMA)。PGMA嵌段可以合適地具有在10和200之間、合適地在 30和100之間、合適地在40和60之間的聚合度（DP)。P(DEGMA-HPMA)嵌段可以合適地具 有在20和200之間、合適地在50和150之間、合適地在70和120之間的聚合度（DP)。在 P (DEGMA-HPMA)嵌段內(nèi)的DEGMA與HPMA單體單元的比合適地在10:1和1:10之間、合適地 在1:1和1:5之間、合適地在1:2和1:3之間。
[0177] 熱響應(yīng)共聚物的顆粒在其包括在本發(fā)明的干細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)之前使用合適的合成 過(guò)程合適地預(yù)形成。但是，在某些實(shí)施方案中，熱響應(yīng)共聚物的顆粒可以在水性培養(yǎng)基內(nèi)原 位形成，該水性培養(yǎng)基是或（在加入合適的營(yíng)養(yǎng)物之后）成為干細(xì)胞培養(yǎng)基的水性媒介物。 盡管從處理的角度來(lái)說(shuō)，在產(chǎn)生干細(xì)胞培養(yǎng)基之前以其"非凝膠狀"形式（即膠狀分散的流 體樣形式）初始地形成顆?；蛑辽賹⑵滢D(zhuǎn)化成其"非凝膠狀"形式是更加便利的，顆?？梢?以其"凝膠狀"或"非凝膠狀"形式（例如，作為分別地為蠕蟲(chóng)或球形）被初始形成。
[0178] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，熱響應(yīng)共聚物的顆粒被預(yù)形成并且然后在其用于干細(xì)胞培 養(yǎng)基之前被超濾。最合適地，在所述顆粒以其"非凝膠狀"形式的同時(shí)將所述顆粒超濾（即 超濾作為膠狀穩(wěn)定的聚合物顆粒的水性分散體，優(yōu)選地基本上是"球形"顆粒）。合適地，這 樣的超濾在低溫下執(zhí)行，合適地其中當(dāng)其被超濾時(shí)，膠狀穩(wěn)定的共聚物顆粒的預(yù)過(guò)濾的水 性分散體是在10°c或低于10°C、更合適地在5°C或低于5°C的溫度下。顆粒在其包括在干 細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)之前以這種方式合適地超濾以將顆粒滅菌。但是，這樣的超濾也可以便利地 移除顆粒的形成中涉及的試劑和副產(chǎn)物。然后將顆粒合適地分散在水性媒介物中或水性培 養(yǎng)基中，其隨后被調(diào)整以形成本發(fā)明的水性媒介物。
[0179] 在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，熱響應(yīng)共聚物的顆粒通過(guò)受控的合成聚合方法、最 優(yōu)選地通過(guò)聚合誘導(dǎo)的自組裝法（即從而顆粒在水性聚合反應(yīng)介質(zhì)中原位形成）來(lái)預(yù)形 成。在特定的實(shí)施方案中，熱響應(yīng)共聚物的顆粒使用在水性分散體聚合條件下執(zhí)行的可逆 加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移（RAFT)類(lèi)型聚合過(guò)程來(lái)制備。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，在一定程度上， 熱響應(yīng)共聚物的顆粒通過(guò)W0 2011/110841 A2(謝菲爾德大學(xué)，2011年3月8日提交）中定 義的方法的任一種來(lái)制備，這提供了根據(jù)本發(fā)明的熱響應(yīng)共聚物（即合適地排除非熱響應(yīng) 共聚物）。此類(lèi)技術(shù)對(duì)于以受控制的和可再生的方式制備雙嵌段共聚物的膠體顆粒是理想 的。如此，W0 2011/110841 A2通過(guò)引用被并入本文。期望的熱響應(yīng)特性可以通過(guò)根據(jù)本 發(fā)明將共聚物分散在水或甚至水性媒介物內(nèi)并且檢查在經(jīng)過(guò)"非凝膠狀"和"凝膠狀"形式 之間的轉(zhuǎn)換或反之亦然的溫度范圍內(nèi)獲得的分散體來(lái)合適地驗(yàn)證。
[0180] 在特定的實(shí)施方案中，熱響應(yīng)共聚物的顆粒通過(guò)在水基培養(yǎng)基中形成如以上定義 的式B的嵌段共聚物來(lái)形成，所述式B的嵌段共聚物通過(guò)以下形成：將以下（a)與（b)混 合，并且啟動(dòng)在水性分散體聚合條件下執(zhí)行的可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移（RAFT)聚合以提供式 B的嵌段共聚物：
[0181] (a)包括式A的部分的水溶性聚合物
[0182]
[0183] 其中X表示Pi的末端基團(tuán)，至少一些基團(tuán)X是鏈轉(zhuǎn)移劑（CTA)末端基團(tuán)，
[0184] (b)如以上定義的單體M2。
[0185] 合適地，形成式B的嵌段共聚物的可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移（RAFT)聚合（基本上） 在不存在表面活性劑的情況下被執(zhí)行。合適地，形成式B的嵌段共聚物的可逆加成-斷裂 鏈轉(zhuǎn)移（RAFT)聚合（基本上）在不存在十二烷基磺酸鈉的情況下被執(zhí)行。合適地，形成式 B的嵌段共聚物的可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移（RAFT)聚合被執(zhí)行，使得如果任何表面活性劑存 在，總表面活性劑與包括式A的部分的水溶性聚合物的重量比是1:25或更小（即更少的表 面活性劑）、合適地1:100或更小、合適地1:200或更小。合適地，形成式B的嵌段共聚物的 可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移（RAFT)聚合被執(zhí)行，使得如果任何表面活性劑存在，總表面活性劑 與單體M 2的重量比是1:25或更小（即更少的表面活性劑）、合適地1:100或更小、合適地 1:200或更小、合適地1:1000或更小。
[0186] 在特定的實(shí)施方案中，熱響應(yīng)共聚物由式B來(lái)定義：
[0187]
[0188] 其中，Pi表示來(lái)源于單體M i (其也合適地是基本上水溶性的/可溶于水的）的基 本上水溶性的（或可溶于水的）聚合物組分并且匕表示來(lái)源于水溶性（或可溶于水的）單 體％的基本上水不溶性的（或不可溶于水的）聚合物組分；
[0189] 其中：
[0190] i)形成核心的鏈（即P2)是熱響應(yīng)的并且穩(wěn)定劑鏈（即PJ是非熱響應(yīng)的；或者
[0191] ii)穩(wěn)定劑鏈（即PJ比形成核心的鏈（即P2)較不熱響應(yīng)并且最合適地穩(wěn)定劑 鏈?zhǔn)牵ɑ旧希┓菬犴憫?yīng)的。
[0192] 如前述的，在一定程度上，？1為、？2和12可以通過(guò)冊(cè)2011/110841八2(謝菲爾德 大學(xué)，2011年3月8日提交）中給予其的含義的任一種來(lái)定義，這提供了根據(jù)本發(fā)明的熱響 應(yīng)共聚物（即合適地排除了非熱響應(yīng)共聚物）。
[0193] 水件媒介物
[0194] 水性媒介物包含水和用于干細(xì)胞的合適的營(yíng)養(yǎng)物。水性媒介物合適地包含 80-9 5wt %的水。營(yíng)養(yǎng)物可以是本領(lǐng)域中已知的任何合適的細(xì)胞培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)物。
[0195] 水性媒介物合適地包含緩沖鹽水，諸如磷酸鹽緩沖鹽水。
[0196] 在一個(gè)實(shí)施方案中，水性媒介物可以是或可以包括本領(lǐng)域中已知的水性培養(yǎng)基。
[0197] 水性媒介物合適地包含干細(xì)胞培養(yǎng)基、合適地人干細(xì)胞培養(yǎng)基、最合適地人胚胎 干細(xì)胞培養(yǎng)基（例如來(lái)自Invitrogen的K0-DMEM培養(yǎng)基）作為營(yíng)養(yǎng)物。此類(lèi)干細(xì)胞培養(yǎng) 基自身合適地被提供作為相關(guān)營(yíng)養(yǎng)物的水性溶液或分散體。合適地，水性媒介物包含至少 20% w/w的干細(xì)胞培養(yǎng)基、合適地至少40% w/w的干細(xì)胞培養(yǎng)基。合適地，水性媒介物包含 至多97% w/w的干細(xì)胞培養(yǎng)基、合適地至多95% w/w的干細(xì)胞培養(yǎng)基、合適地至多80% w/ w的干細(xì)胞培養(yǎng)基、合適地至多60% w/w的干細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0198] 培養(yǎng)基還可以包含促進(jìn)干細(xì)胞分化為期望的細(xì)胞類(lèi)型的生長(zhǎng)因子或其他營(yíng)養(yǎng)物。
[0199] 干細(xì)朐
[0200] 任何干細(xì)胞都可以被用于本發(fā)明的培養(yǎng)基。
[0201 ] 在某些實(shí)施方案中，用于與本發(fā)明的方法和培養(yǎng)基一起使用的干細(xì)胞是哺乳動(dòng)物 干細(xì)胞，最合適地人干細(xì)胞。在特定的實(shí)施方案中，干細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞（例如人胚胎干細(xì) 胞）。然而，此類(lèi)胚胎干細(xì)胞合適地是干細(xì)胞而不是通過(guò)涉及破壞人胚胎和/或人胚胎干細(xì) 胞的方法產(chǎn)生或獲得的那些。在可選的實(shí)施方案中，干細(xì)胞是非胚胎（例如成體）干細(xì)胞。
[0202] 合適地，干細(xì)胞基本上是未分化的。合適地，干細(xì)胞是多能性干細(xì)胞。
[0203] 胚胎干細(xì)胞合適地從囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離。
[0204] 非胚胎干細(xì)胞可以從多種組織獲得和分離，所述組織包括：
[0205] -骨髓，其需要通過(guò)鉆入骨骼（例如股骨或髂骨）中提??；
[0206] -脂肪組織（脂質(zhì)細(xì)胞），其需要通過(guò)抽脂術(shù)提??；
[0207] -血液，其需要通過(guò)單采術(shù)提取，其中血液從供體提取，通過(guò)提取干細(xì)胞的機(jī)器并 且將血液的其他部分返回至供體；
[0208] -剛出生后的臍帶血。
[0209] 根據(jù)本發(fā)明使用的干細(xì)胞合適地是全能性干細(xì)胞或多能性干細(xì)胞、最合適地多能 性干細(xì)胞。此類(lèi)多能性干細(xì)胞合適地可以分化為來(lái)自三個(gè)胚層即內(nèi)胚層（內(nèi)部胃黏膜、胃 腸道、肺）、中胚層（肌肉、骨骼、血液、泌尿生殖器）或外胚層（表皮組織和神經(jīng)系統(tǒng)）的任 何一個(gè)的細(xì)胞類(lèi)型?？蛇x地，干細(xì)胞可以是多能干細(xì)胞。
[0210] 本發(fā)明的干細(xì)胞培養(yǎng)基合適地被配置以將一種或更多種干細(xì)胞捕獲/包封在凝 膠基質(zhì)內(nèi)，同時(shí)干細(xì)胞培養(yǎng)基是凝膠狀形式。此類(lèi)干細(xì)胞合適地與相關(guān)營(yíng)養(yǎng)物一起被包封 在3D支架內(nèi)，所述相關(guān)營(yíng)養(yǎng)物允許干細(xì)胞在凝膠中存活并且甚至生長(zhǎng)。
[0211] 合適的分離的細(xì)胞制品可以是富含多能祖細(xì)胞的制品，所述多能祖細(xì)胞通常從諸 如骨髓、外周全血、白細(xì)胞單采術(shù)產(chǎn)物或單采術(shù)產(chǎn)物、臍帶血和從組織或器官制備的細(xì)胞懸 浮液的來(lái)源獲得的。
[0212] 多能祖細(xì)胞可以使用本領(lǐng)域中已知的細(xì)胞培養(yǎng)、增殖和分離的方法，例如使用如 由本發(fā)明的發(fā)明人在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6, 737, 074和6, 503, 731中公開(kāi)的纖維蛋白微珠來(lái)分離。 可選的方法除了其他的以外包括在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7, 592, 174、5, 908, 782、5, 486, 359和美國(guó) 專(zhuān)利申請(qǐng)公布號(hào)2010/006819U2009/0124007和2010/0297233中公開(kāi)的那些。
[0213] 用于細(xì)胞富集和/或分離的典型方法包括密度梯度法（例如，F(xiàn)icoll (R)、膠狀二 氧化硅）、淘洗法、離心、通過(guò)低滲休克裂解紅細(xì)胞和此類(lèi)方法的多種組合。例如，從骨髓純 化干細(xì)胞需要移除紅細(xì)胞和粒細(xì)胞，其通常通過(guò)Ficoll (R)密度梯度離心、隨后為通過(guò)傳 統(tǒng)離心的重復(fù)洗滌步驟來(lái)完成。
[0214] 用于細(xì)胞富集和/或分離的方法還可以包括本領(lǐng)域中已知的用于細(xì)胞分離的在 多種類(lèi)型的過(guò)濾器上的過(guò)濾。例如，正切流動(dòng)過(guò)濾（還稱(chēng)為錯(cuò)流過(guò)濾）可以被用于從骨髓 或血液成分的非均勻混合物富集干細(xì)胞，如在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7, 790, 039中公開(kāi)的。
[0215] 從混合物分離多能細(xì)胞還可以并入吸附至合適的基底諸如塑料培養(yǎng)容器的步驟。
[0216] 用于本發(fā)明的分離的多能祖細(xì)胞包括稱(chēng)為"間充質(zhì)干細(xì)胞"（本文還稱(chēng)為"MSC"） 的那些，諸如從骨髓基質(zhì)和臍帶血獲得的那些，其具有在體外分化為不同細(xì)胞類(lèi)型特別是 軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和肌細(xì)胞的能力。體外研究已經(jīng)證實(shí)了 MSC分化為肌細(xì)胞、 神經(jīng)元樣前體、心肌細(xì)胞和可能的其他細(xì)胞類(lèi)型的能力。另外，MSC已經(jīng)被公開(kāi)提供用于造 血干細(xì)胞擴(kuò)增的有效飼養(yǎng)層。
[0217] 在特定的實(shí)施方案中，干細(xì)胞是多能性干細(xì)胞、特別地多能性人胚胎干細(xì)胞。干細(xì) 胞合適地在轉(zhuǎn)移至本發(fā)明的培養(yǎng)基之前被機(jī)械地收獲（例如通過(guò)移液管）。合適地，干細(xì)胞 聚集物被添加至干細(xì)胞培養(yǎng)基。合適地，干細(xì)胞（或干細(xì)胞聚集物）與培養(yǎng)基的體積比在 1:1000和1:5之間、更合適地在1:100和1:10之間、最合適地在1:50和1:20之間。例如， 將約20 μ L的干細(xì)胞聚集物（通常每一個(gè)聚集物大小為20-200 μ m)添加至約600 μ L的培 養(yǎng)基。
[0218] 將干細(xì)朐容納在培養(yǎng)基內(nèi)
[0219] 當(dāng)為凝膠狀形式時(shí)，培養(yǎng)基能夠容納活的干細(xì)胞。此外，培養(yǎng)基中的干細(xì)胞維持其 活力經(jīng)過(guò)延長(zhǎng)的時(shí)間段并且沒(méi)有任何表型改變（除非存在促進(jìn)分化的劑或條件）。
[0220] 合適地，凝膠狀培養(yǎng)基能夠維持干細(xì)胞的活力至少7天、合適地至少14天、更合適 地至少21天、更合適地至少28天、最合適地至少56天。假設(shè)沒(méi)有分化劑（例如生長(zhǎng)因子） 被添加至培養(yǎng)基，容納的干細(xì)胞被維持在未分化的形式，并且保持有活力的。此類(lèi)容納的干 細(xì)胞合適地可以在從培養(yǎng)基提取之后自我更新/復(fù)制。
[0221] 合適地，凝膠狀形式的干細(xì)胞培養(yǎng)基能夠取決于干細(xì)胞是否被儲(chǔ)存、培養(yǎng)和/或 分化而在環(huán)境溫度和/或最佳培養(yǎng)溫度（即30-42Γ )和/或分化溫度下容納活的干細(xì)胞。 合適地，凝膠狀形式的干細(xì)胞培養(yǎng)基能夠在15°C和42°C之間的溫度下容納活的干細(xì)胞。此 類(lèi)干細(xì)胞可以以休眠狀態(tài)或停滯態(tài)（即其中基本上沒(méi)有分化和/或增殖發(fā)生）被儲(chǔ)存。
[0222] 制備干細(xì)朐培養(yǎng)基的方法
[0223] 本發(fā)明提供了制備根據(jù)本發(fā)明第一方面的培養(yǎng)基的方法，所述方法包括將所述合 成的生物相容的熱響應(yīng)共聚物的顆粒分散在水性媒介物中，所述水性媒介物還包含用于維 持干細(xì)胞的活力的營(yíng)養(yǎng)物。
[0224] 可分別制備/提供熱響應(yīng)共聚物的顆粒和水性媒介物并且然后混合在一起。然 后，合成的熱響應(yīng)共聚物的顆粒合適地在所得培養(yǎng)基藉以以其非凝膠狀形式存在的溫度下 分散在水性媒介物中。
[0225] 熱響應(yīng)共聚物的顆粒可以通過(guò)本文描述的方法中的任何一種被提供，特別是通過(guò) 在TO 2011/110841 A2(謝菲爾德大學(xué)，2011年3月8日提交）中公開(kāi)的方法被提供。如 此，所述顆粒合適地通過(guò)受控的自由基聚合諸如RAFT聚合被原位形成。合適地，此類(lèi)顆粒 通過(guò)以下形成：
[0226] ⑴提供溶解在聚合介質(zhì)/溶劑（例如水）中的預(yù)形成的聚合物嵌段（比如，PGMA 的嵌段）；以及
[0227] (ii)從所述預(yù)形成的聚合物嵌段生長(zhǎng)第二聚合物嵌段（例如通過(guò)使用合適的單 體啟動(dòng)另外的聚合例如RAFT聚合），其中所述第二聚合物嵌段致使所得雙嵌段共聚物（基 本上）不可溶于聚合介質(zhì)/溶劑，并且從而原位形成膠體顆粒。
[0228] 熱響應(yīng)共聚物的顆粒合適地在并入干細(xì)胞培養(yǎng)基之前被滅菌。這樣的滅菌可以通 過(guò)超濾來(lái)執(zhí)行。最合適地，顆粒以其非凝膠狀形式被超濾（即當(dāng)相關(guān)膠體顆粒是最小的并 且因此流體粘度被最小化時(shí)）。如此，顆?？梢栽谔峁┓悄z狀形式的顆粒（或其對(duì)應(yīng)的分 散體）的合適溫度下被超濾。
[0229] 合適地，熱響應(yīng)共聚物的顆粒的超濾可通過(guò)0. 01-1 μ m過(guò)濾器、合適地 0. 3-0. 6 μ m過(guò)濾器來(lái)執(zhí)行。在一些實(shí)施方案中，過(guò)濾器可以是0. 22 μ m或0. 45 μ m的過(guò)濾 器。
[0230] 合適地，熱響應(yīng)共聚物的顆粒待分散入其中的水性媒介物在將熱響應(yīng)共聚物的顆 粒分散至其中之前被單獨(dú)地預(yù)形成。然而，水性媒介物可以可選地例如在顆粒已經(jīng)被初始 地分散在部分形成的水性媒介物（例如水）中之后原位制備。在此類(lèi)情況下，相關(guān)的營(yíng)養(yǎng) 物可以在顆粒已經(jīng)合適地分散之后被添加至部分形成的水性媒介物。
[0231] 形成之后，將培養(yǎng)基合適地儲(chǔ)存并與干細(xì)胞一起直接使用。
[0232] 干細(xì)朐組合物
[0233] 本發(fā)明提供了干細(xì)胞組合物，所述干細(xì)胞組合物包含分散在如本文定義的干細(xì)胞 培養(yǎng)基內(nèi)的一種或更多種干細(xì)胞。
[0234] 水性媒介物，特別是其中的干細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)物，可以容易地分散遍及凝膠狀形式的培 養(yǎng)基。合適地，取決于干細(xì)胞培養(yǎng)基和/或水性媒介物的含量，水性媒介物和/或其中包 含的營(yíng)養(yǎng)物容易的分散遍及凝膠狀形式的干細(xì)胞基質(zhì)允許包封在其中的干細(xì)胞被儲(chǔ)存、保 存、培養(yǎng)和/或分化。
[0235] 干細(xì)胞組合物基質(zhì)可以包含直至10% v/v的干細(xì)胞。干細(xì)胞基質(zhì)可以包含至少 0. 5% v/v的干細(xì)胞。
[0236] 形成干細(xì)朐組合物的方法
[0237] 本發(fā)明還提供了制備根據(jù)本發(fā)明第二方面的干細(xì)胞組合物的方法，所述方法包 括：
[0238] (i)使非凝膠狀形式的根據(jù)本發(fā)明第一方面的培養(yǎng)基與一種或更多種干細(xì)胞接觸 以產(chǎn)生流體干細(xì)胞組合物（即干細(xì)胞在培養(yǎng)基中的流體分散體）；以及
[0239] (ii)任選地改變培養(yǎng)基的溫度使得培養(yǎng)基從非凝膠狀形式改變?yōu)槟z狀形式，從 而產(chǎn)生膠凝的干細(xì)胞組合物，其中干細(xì)胞分散在膠凝的培養(yǎng)基中。
[0240] 合適地，在啟動(dòng)干細(xì)胞組合物的凝膠化之前，將流體干細(xì)胞組合物充分?jǐn)嚢瑁线m 地以提供具有一種或更多種干細(xì)胞以（基本上）均勻的模式分散的流體干細(xì)胞組合物。
[0241] 優(yōu)選地，然后通過(guò)使培養(yǎng)基從非凝膠狀形式改變?yōu)槟z狀形式使干細(xì)胞組合物膠 凝，并且從而產(chǎn)生膠凝的干細(xì)胞組合物。
[0242] 儲(chǔ)存和/或保存干細(xì)朐的方法
[0243] 本發(fā)明提供了儲(chǔ)存或保存一種或更多種干細(xì)胞的方法，所述方法包括：
[0244] (i)使非凝膠狀形式的根據(jù)本發(fā)明第一方面的培養(yǎng)基與一種或更多種干細(xì)胞接觸 以產(chǎn)生流體干細(xì)胞組合物；
[0245] (ii)改變培養(yǎng)基的溫度使得培養(yǎng)基從非凝膠狀形式改變?yōu)槟z狀形式并且從而 產(chǎn)生膠凝的干細(xì)胞組合物；以及
[0246] (iii)儲(chǔ)存膠凝的干細(xì)胞組合物。
[0247] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，以上方法的步驟（i)合適地在10°C或低于10°C、合適地在 5°C或低于5°C的溫度下用干細(xì)胞培養(yǎng)基來(lái)執(zhí)行。
[0248] 改變溫度可以包括取決于培養(yǎng)基的膠凝特性和與其相關(guān)的熱響應(yīng)共聚物，分別增 加或降低溫度高于或低于膠凝溫度。
[0249] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，干細(xì)胞培養(yǎng)基低于膠凝溫度為非凝膠狀且高于膠凝溫度為 凝膠狀。如此，以上方法的步驟（ii)合適地包括從最初低于膠凝溫度升高干細(xì)胞組合物的 溫度，直至或高于膠凝溫度。最合適地，步驟（ii)包括調(diào)整干細(xì)胞基質(zhì)的溫度從在l〇°C或 低于l〇°C直至或高于18°C、合適地直至或高于35°C、最合適地直至約37°C。
[0250] 然后可以將干細(xì)胞儲(chǔ)存在膠凝的干細(xì)胞組合物中持續(xù)合適的時(shí)間段。特別地，可 以將干細(xì)胞成功儲(chǔ)存在基質(zhì)內(nèi)持續(xù)至少7天、合適地至少14天、合適地至少21天、合適地 至少28天、合適地至少56天。然而，從業(yè)者可以選擇將所述干細(xì)胞儲(chǔ)存持續(xù)更少的時(shí)間。 合適地，在18°C或高于18°C、合適地在35°C或高于35°C、最合適地在約37°C的溫度下存儲(chǔ) 干細(xì)胞。
[0251] 干細(xì)胞儲(chǔ)存于其中的膠凝的干細(xì)胞組合物自身可以合適地被包含于合適地容器 內(nèi)、最合適地密封的容器內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，將干細(xì)胞基質(zhì)儲(chǔ)存在包括至少1% v/v的 C02、合適地至少3% v/v的C02、更合適地至少4. 5% v/v的032的密封的大氣內(nèi)。合適地， 密封的大氣包括不多于8%的C02、合適地不多于6%的C0 2。密封的大氣合適地具有至少 80%的濕度、合適地至少90%的濕度、合適地約95%的濕度。密封的大氣合適地具有至多 100%的濕度、合適地至多98%的濕度。
[0252] 在將干細(xì)胞儲(chǔ)存在本發(fā)明的培養(yǎng)基內(nèi)期間，可以用營(yíng)養(yǎng)物培養(yǎng)基覆蓋膠凝的培養(yǎng) 基，營(yíng)養(yǎng)物培養(yǎng)基諸如本文描述的干細(xì)胞培養(yǎng)基，特別是人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基。可以將此類(lèi) 營(yíng)養(yǎng)物培養(yǎng)基定期替換和/或補(bǔ)充（例如至少每?jī)商欤?。該過(guò)程可有助于維持干細(xì)胞的活 力。
[0253] 除了捕獲和儲(chǔ)存干細(xì)胞之外，以上的方法可以包括隨后釋放干細(xì)胞的步驟。通常 這包括使得培養(yǎng)基恢復(fù)至其非凝膠狀形式以提供流體干細(xì)胞組合物（例如通過(guò)將溫度調(diào) 整至在10°C或低于10°C，或在5°C或低于5°C )，并且還可包括從該流體干細(xì)胞組合物提取 干細(xì)胞。干細(xì)胞可以被機(jī)械地提取，例如通過(guò)移液管。此類(lèi)干細(xì)胞可以被提取為聚集物，合 適地在引入本發(fā)明的培養(yǎng)基之前以相同方式將其收獲。然后干細(xì)胞可以以任何合適的方式 被隨后使用。
[0254] 在儲(chǔ)存于本發(fā)明的培養(yǎng)基期間特別地持續(xù)21天或更少的儲(chǔ)存時(shí)間期間，所述培 養(yǎng)基合適地延遲和/或阻止干細(xì)胞分化和/或增殖（特別地相比于儲(chǔ)存在標(biāo)準(zhǔn)干細(xì)胞培養(yǎng) 基中）。增殖狀態(tài)或減少可以通過(guò)視覺(jué)檢查，例如通過(guò)顯微鏡來(lái)判斷。分化狀態(tài)或減少可以 通過(guò)檢查細(xì)胞形態(tài)和經(jīng)由用特定的標(biāo)志物單克隆抗體通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選術(shù)（FACS)的 分析來(lái)判斷。
[0255] 培養(yǎng)干細(xì)朐的方法
[0256] 本發(fā)明提供了培養(yǎng)干細(xì)胞的方法，所述方法包括：
[0257] (i)使非凝膠狀形式的根據(jù)本發(fā)明第一方面的培養(yǎng)基與一種或更多種干細(xì)胞接觸 以產(chǎn)生流體干細(xì)胞組合物；
[0258] (ii)改變培養(yǎng)基的溫度使得培養(yǎng)基從非凝膠狀形式改變?yōu)槟z狀形式并且從而 產(chǎn)生膠凝的干細(xì)胞組合物；以及
[0259] (iii)在膠凝的干細(xì)胞組合物內(nèi)培養(yǎng)干細(xì)胞。
[0260] 膠凝的干細(xì)胞組合物提供了用于培養(yǎng)干細(xì)胞的3D凝膠網(wǎng)絡(luò)。這不同于標(biāo)準(zhǔn)的2D 細(xì)胞培養(yǎng)方法。
[0261] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在30°C和45°C之間、優(yōu)選地在35°C至40°C、最優(yōu)選地37°C 的溫度下用干細(xì)胞基質(zhì)進(jìn)行培養(yǎng)。
[0262] 培養(yǎng)基可以是水性媒介物自身。在一些實(shí)施方案中，水性媒介物被初始地制備為 培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方案中，可以將另外的成分添加至水性媒介物以產(chǎn)生培養(yǎng)基，例如然后 儲(chǔ)存、保存或分化干細(xì)胞。
[0263] 培養(yǎng)基可以合適地包括促進(jìn)干細(xì)胞生長(zhǎng)的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)物。此類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基可以 包括HES培養(yǎng)基和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞。此類(lèi)培養(yǎng)基合適地不同于儲(chǔ)存干細(xì)胞期 間在本發(fā)明的培養(yǎng)基內(nèi)使用的任何干細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)物/培養(yǎng)基。
[0264] 本文中培養(yǎng)干細(xì)胞的方法預(yù)期包括培養(yǎng)任何分化后的干細(xì)胞。
[0265] 培養(yǎng)的方法可以在培養(yǎng)之前或之后另外地包括儲(chǔ)存和/或保存。
[0266] 與儲(chǔ)存或保存干細(xì)胞的方法相同，該培養(yǎng)干細(xì)胞的方法可以包括隨后的釋放干細(xì) 胞的步驟。通常這包括使得干細(xì)胞培養(yǎng)基變?yōu)榉悄z狀以形成流體干細(xì)胞基質(zhì)，并且還可 以包括從流體干細(xì)胞基質(zhì)提取干細(xì)胞。然后干細(xì)胞可以以任何合適的方式被使用，包括用 于本文描述的任何應(yīng)用。
[0267] 分化干細(xì)朐的方法
[0268] 本發(fā)明提供了分化干細(xì)胞的方法，所述方法包括：
[0269] (i)使非凝膠狀形式的根據(jù)本發(fā)明第一方面的培養(yǎng)基與一種或更多種干細(xì)胞接觸 以產(chǎn)生流體干細(xì)胞組合物；
[0270] (ii)改變培養(yǎng)基的溫度使得培養(yǎng)基從非凝膠狀形式改變?yōu)槟z狀形式并且從而 產(chǎn)生膠凝的干細(xì)胞組合物；以及
[0271] (iii)在促進(jìn)干細(xì)胞的分化的條件下培養(yǎng)干細(xì)胞。
[0272] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在30°C和45°C之間、優(yōu)選地35°C至40°C、最優(yōu)選地37°C的 溫度下用干細(xì)胞基質(zhì)實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)。
[0273] 促進(jìn)干細(xì)胞分化的合適的劑可以從一開(kāi)始就存在于培養(yǎng)基中或可選地，可以在培 養(yǎng)期間（例如，在儲(chǔ)存、保存或甚至培養(yǎng)干細(xì)胞之后）被加至膠凝的干細(xì)胞組合物。
[0274] 所述方法可以包括在干細(xì)胞分化之前或之后的細(xì)胞培養(yǎng)。在一些實(shí)施方案中，此 類(lèi)分化和培養(yǎng)可以在原位進(jìn)行，但是合適地是順序地而不是同時(shí)地進(jìn)行。
[0275] 分化的方法可以另外地包括在干細(xì)胞分化之前或之后儲(chǔ)存和/或保存細(xì)胞。
[0276] 與儲(chǔ)存或保存干細(xì)胞的方法相同，該分化干細(xì)胞的方法可以包括隨后的釋放干細(xì) 胞的步驟。通常這包括使得干細(xì)胞培養(yǎng)基變?yōu)榉悄z狀以形成流體干細(xì)胞基質(zhì)，并且還可 以包括從流體干細(xì)胞基質(zhì)提取干細(xì)胞。然后干細(xì)胞可以以任何合適的方式被使用，包括用 于本文描述的任何應(yīng)用。
[0277] 用于儲(chǔ)存、保存、培養(yǎng)和/或分化干細(xì)朐的試劑倉(cāng)
[0278] 本發(fā)明提供了用于制備根據(jù)本發(fā)明第一方面的培養(yǎng)基的試劑盒，所述試劑盒包 括：
[0279] ⑴如本文定義的合成的熱響應(yīng)共聚物的顆粒；以及
[0280] (ii)水性媒介物，所述水性媒介物任選地還包含用于維持干細(xì)胞的活力的營(yíng)養(yǎng) 物。
[0281] 在混合水性媒介物之前可以在水性媒介物（例如水）中預(yù)形成顆粒?？蛇x地，可 以將共聚物提供為分散在水性媒介物中的固體，從而其自發(fā)地形成合適的膠體顆粒。
[0282] 合適地，水性媒介物還包括用于干細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)物，但是在某些實(shí)施方案中這些可 以被分別添加并且形成試劑盒的不同組分。
[0283] 細(xì)朐治療和藥物組合物
[0284] 本發(fā)明還提供了藥物組合物，所述藥物組合物包含根據(jù)本發(fā)明第二方面的干細(xì)胞 組合物和任選地一種或更多種藥學(xué)上可接受的賦形劑。
[0285] 本領(lǐng)域中已知的任何合適的藥物賦形劑可以被使用。設(shè)想本發(fā)明的大多數(shù)藥物組 合物將是包含本發(fā)明的干細(xì)胞組合物的注射劑、輸注劑或植入物。
[0286] 根據(jù)本發(fā)明的第十一方面，提供了如本文定義的藥物組合物，用于在治療中使用。
[0287] 根據(jù)本發(fā)明的第十一方面，提供了如本文定義的藥物組合物，用于在干細(xì)胞治療 中使用。
[0288] 根據(jù)本發(fā)明的第十二方面，提供了如本文定義的培養(yǎng)基用于儲(chǔ)存、保存、培養(yǎng)和/ 或分化一種或更多種干細(xì)胞的用途。
[0289] 當(dāng)將如上文定義的細(xì)胞或干細(xì)胞基質(zhì)以合適的劑量范圍施用時(shí)，預(yù)期沒(méi)有不利的 毒物學(xué)作用。
[0290] 用于在治療中使用的本發(fā)明的細(xì)胞或干細(xì)胞組合物的有效量是足以緩解研究的 身體狀況的癥狀、減慢所述身體狀況的進(jìn)展、或降低具有身體狀況的患者（例如人）中的癥 狀?lèi)夯娘L(fēng)險(xiǎn)的量。
[0291] 根據(jù)熟知的醫(yī)學(xué)原則，本發(fā)明的細(xì)胞或干細(xì)胞組合物的用于治療或預(yù)防目的的劑 量大小將根據(jù)狀況的性質(zhì)和嚴(yán)重度、動(dòng)物或患者的年齡和性別以及施用途徑自然地變化。
[0292] 本文定義的細(xì)胞和干細(xì)胞組合物可以被用于的治療最合適地是細(xì)胞治療，尤其是 干細(xì)胞治療。預(yù)期接受此類(lèi)治療的受試者合適地是人或動(dòng)物受試者。治療可以包括用于以 下的治療：細(xì)胞缺損（例如組織缺損、軟骨缺損、骨缺損、骨疾?。?、骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥、 脊髓損傷、牙周病、心肌梗死、癌癥、帕金森氏病、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥、多發(fā)性硬化癥、 肌肉退行性紊亂和肌肉損傷。例如，治療可以包括骨髓移植以治療白血病。本發(fā)明的細(xì)胞 和干細(xì)胞基質(zhì)可以被用于組織和/或器官的恢復(fù)、重建和/或更換。
[0293] 本發(fā)明的培養(yǎng)基還可以被用以維持從在某些治療過(guò)程期間的患者獲得的干細(xì)胞， 諸如維持從在密集的癌癥化學(xué)治療或放射治療過(guò)程期間的患者的骨髓獲得的干細(xì)胞。然 后，在醫(yī)學(xué)治療后，可以將干細(xì)胞重新引入至患者。 實(shí)施例
[0294] 材料和方法
[0295] 所有試劑購(gòu)自Sigma-Aldrich并且直接使用，除非另外注明。GMA單體由GE0 Specialty Chemicals (Hythe, UK)提供并且 HPMA 單體購(gòu)自 Alfa-Aesar (Heysham, UK) 〇
[0296] 使用DMF作為洗脫液通過(guò)凝膠滲透色譜法（GPC)評(píng)價(jià)分子量分布。GPC裝置包括 兩個(gè)Polymer Laboratories PL凝膠5 μ m混合C柱和一個(gè)維持在60°C的PL極性凝膠5 μ m 保護(hù)柱，與Varian 390LC折光率檢測(cè)器聯(lián)用。DMF流動(dòng)相包含10mM LiBr并且流速是1. OmL min ^十種近似單分散的聚（甲基丙烯酸甲酯）標(biāo)準(zhǔn)物（Mp= 625 - 618, 000g mol 4被用 于校準(zhǔn)。使用近似單分散的聚（甲基丙烯酸甲酯）校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)物從GPC曲線(xiàn)計(jì)算數(shù)均分子量 (Mn)和 Mw/Mn。
[0297] 使用Bruker AVl-400MHz分光儀在d4-甲醇中記錄1H NMR光譜。
[0298] 使用在100kV下運(yùn)行的配備Gatan lk CCD相機(jī)的Philips CM 100設(shè)備實(shí)施透射 電子顯微術(shù)（TEM)研究。碳包被的銅載網(wǎng)被輝光放電20-30秒以創(chuàng)建親水性表面。然后將 載網(wǎng)浸入水性嵌段共聚物分散體（0. 5w/w% )中l(wèi)min并且然后浸入甲酸鈾酰溶液（0. 75% w/v)中20s用于負(fù)染色。然后用濾紙將每一個(gè)載網(wǎng)印跡并且使用真空管干燥。
[0299] 實(shí)施例1 :通討在磷酸鹽緩沖鹽水中的RAFT水件分散體聚合合成聚（單甲基丙燔 酸甘油醅）-聚（甲基丙燔酸2-羥基丙醅）（PGMA-PHPMA)蠕蟲(chóng)凝膠伸用2-氰丙基二硫代 苯甲酸醅（CPDB)合成聚（單甲基丙燔酸甘油醅）macro-CTA
[0300] 將 CPDB(0.576g，80%純度，0.00208mol)和 GMA(20.00g，125.0mol，60 當(dāng)量）稱(chēng)重 進(jìn)入 250ml 圓底燒瓶并且用 N2凈化 20min。添加 ACVA(0. 117g，0. 416mmol，[CPDB]/[ACVA] =5. 0)并且將燒瓶脫氣持續(xù)另外的5min。添加脫氣的無(wú)水乙醇（30ml)并且將燒瓶脫氣持 續(xù)另外的5min，然后浸入設(shè)定在70°C的油浴。在115min之后，粗產(chǎn)物的 1H NMR分析表明 單體轉(zhuǎn)化率為71%。通過(guò)從甲醇重復(fù)沉淀入過(guò)量二氯甲烷兩次，將獲得的？6獻(xiàn)!^(^〇-〇^ 純化，然后溶解在水中并且冷凍干燥過(guò)夜以產(chǎn)生粉紅色粉末，其通過(guò) 1H NMR光譜法被鑒定 為純度>99%。
[0301] 通過(guò)1H NMR確定的平均聚合度為45 (參見(jiàn)圖1)。
[0302] DMF GPC 分析（相對(duì) ΡΜΜΑ 標(biāo)準(zhǔn)物）：Mn= 13,800g mol 1 Mw/Mn= 1. 13〇
[0303] 合成PGMA^ - PHPMA^雙嵌段共聚物蠕蟲(chóng)
[0304] 將 PGMA45(4. 904g，0. 63mmol)和 ΗΡΜΑ(1(λ 0g，69. 4mmol)稱(chēng)重進(jìn)入 50ml 圓底燒瓶 并且用N2凈化20min。添加 ACVA(59. 0mg，0. 21mmol)并且將燒瓶脫氣持續(xù)另外的5min。 然后添加預(yù)先用隊(duì)凈化30min的磷酸鹽緩沖鹽水溶液（59ml)并且將溶液脫氣持續(xù)另外的 5min，然后將燒瓶浸入設(shè)定在70°C的油浴。在3h之后，基于5. 5ppm和6. 5ppm之間的乙稀 基信號(hào)的消失，粗產(chǎn)物的1H NMR分析表明HPMA單體轉(zhuǎn)化率>99%。將獲得的雙嵌段共聚物 對(duì)磷酸鹽緩沖鹽水溶液透析過(guò)夜以產(chǎn)生無(wú)單體的20% w/w共聚物分散體，其在室溫形成無(wú) 需支撐的凝膠。通過(guò)4 NMR和DMF GPC分析干燥的共聚物樣品。
[0305] 通過(guò)1H NMR光譜法確定的雙嵌段組成為PGMA45-PHPMAn。（參見(jiàn)圖1)。
[0306] DMF GPC 分析（相對(duì) PMMA 標(biāo)準(zhǔn)物）：Mn= 31，600g mol 1 Mw/Mn= 1. 09。
[0307] 流變學(xué)測(cè)量表明臨界凝膠化溫度（CGT)為17°C (參見(jiàn)圖2)。
[0308] 實(shí)施例2 :通討在磷酸鹽緩沖鹽水中的RAFT水件分散體聚合合成聚（單甲基 丙燔酸甘油醅）-嵌段-聚（甲基丙燔酸2-羥基丙醅-stat-甲基丙燔酸二甘醇醅） (PGMA-P(HPMA-DEGMA))蠕蟲(chóng)凝膠
[0309] 合成 PGMA^jnacro-CTA
[0310] 根據(jù)以上方案合成PGMA macro-CTA。在本實(shí)施例中，在2h后實(shí)現(xiàn)了 88%的GMA 轉(zhuǎn)化率并且通過(guò)1H NMR計(jì)算出平均聚合度（DP)為55。
[0311] DMF GPC 分析（相對(duì) ΡΜΜΑ 標(biāo)準(zhǔn)物）：Μη= 15, 700g mol 1 Mw/Mn= 1. 17〇
[0312] 合成 PGMA= - P (HPMA^-stat-DEGMA^)雙嵌段共聚物
[0313] 將 PGMA55 (0. 750g，0. 085mmol)、ΗΡΜΑ(1· 028g，7. 14mmol)、DEGMA(0. 576g， 3. 06mmol)和ACVA(8. 0mg，0. 028mmol)稱(chēng)重進(jìn)入50ml圓底燒瓶。添加用隊(duì)預(yù)先凈化30min 的磷酸鹽緩沖鹽水溶液（20ml)然后用N2凈化溶液持續(xù)另外的lh，然后將燒瓶浸入設(shè)定在 70°C的油浴。3h之后，基于4 NMR光譜中5. 5ppm和6. 5之間的單體乙烯基信號(hào)的消失，粗 產(chǎn)物的4 NMR分析表明總單體轉(zhuǎn)化率>99% (參見(jiàn)圖3)。將獲得的雙嵌段共聚物對(duì)磷酸 鹽緩沖鹽水溶液透析過(guò)夜以產(chǎn)生10% w/w共聚物分散體。通過(guò)4 NMR和DMF GPC分析干 燥的樣品。
[0314] 通過(guò)1H NMR 確定的雙嵌段組成=PGMA55 - P (HPMAS4-stat-DEGMA36)。
[0315] DMF GPC 分析（相對(duì) PMMA 標(biāo)準(zhǔn)物）：Mn= 36, 000g mol 1 Mw/Mn= 1. 18〇
[0316] 流變學(xué)測(cè)量表明臨界凝膠化溫度為26°C (參見(jiàn)圖4)。
[0317] 實(shí)施例3 :制備可膠凝的干細(xì)朐培養(yǎng)基
[0318] 在4°C使用預(yù)洗滌的Spectra/Por透析膜（分子量截留=1000)將來(lái)源于實(shí)施 例1的10ml 10% w/w蠕蟲(chóng)凝膠（在磷酸鹽緩沖鹽水中）對(duì)100ml的人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基 (K0-DMEM培養(yǎng)基，Invitrogen)透析24h，并且然后使用預(yù)先在冰上冷卻的0. 22 μ m過(guò)濾裝 置（Sartorius Minsart)過(guò)濾滅菌。將凝膠混合物用K0-DMEM培養(yǎng)基按50:50稀釋?zhuān)ㄗ罱K 5% w/w)并且用移液管吸入在冰床上冷卻的12孔培養(yǎng)板（Nunc)的孔中(600 μ 1/孔）并 且搖動(dòng)板以允許混合物的均勻涂布。
[0319] 然后孔內(nèi)的可膠凝的干細(xì)胞培養(yǎng)基被用于隨后的實(shí)驗(yàn)。
[0320] 實(shí)施例4 :捕獲、儲(chǔ)存和恢復(fù)干細(xì)朐
[0321 ] 將胚胎干細(xì)胞（Shef 1、11和RPE1細(xì)胞系）通過(guò)移液管機(jī)械地收獲并且使用塑料 Pasteur移液管將50-100聚集物（50-100 μ m直徑）以小體積（~20 μ 1)轉(zhuǎn)移至實(shí)施例3 中描述的凝膠孔或具有單獨(dú)的細(xì)胞培養(yǎng)基（對(duì)照）的平板的孔。搖動(dòng)平板以分布細(xì)胞聚集 物并且直接轉(zhuǎn)移至37°C、空氣中5% 0)2和95%濕度的培養(yǎng)箱。5min之后，將在溫度引起 的干細(xì)胞培養(yǎng)基的相變之后形成的凝膠用100 μ 1的細(xì)胞培養(yǎng)基覆蓋并放回至培養(yǎng)箱。將 覆蓋凝膠的培養(yǎng)基每2天更換并且通過(guò)顯微術(shù)檢查孔。
[0322] 在恢復(fù)和隨后的測(cè)試之前，將干細(xì)胞儲(chǔ)存4、7、14和21天。
[0323] 實(shí)施例5 :測(cè)試儲(chǔ)存的/恢復(fù)的干細(xì)朐
[0324] 在4、7、14和21天時(shí)，從在冰床上冷卻的孔板恢復(fù)干細(xì)胞聚集物，在所述時(shí)間點(diǎn)使 干細(xì)胞培養(yǎng)基經(jīng)受相變回到流體形式并且轉(zhuǎn)移至具有標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件（hES培養(yǎng)基和小鼠胚 胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞）的孔板以觀察細(xì)胞活力和自發(fā)的細(xì)胞分化。
[0325] 觀察封裝在具有細(xì)胞和凝膠之間的小間隙的凝膠中的干細(xì)胞的聚集物是可能的 (參見(jiàn)圖5)。如通過(guò)相差顯微鏡檢查判斷的，在培養(yǎng)中隨著時(shí)間的推移每一個(gè)細(xì)胞聚集物 的擴(kuò)展表現(xiàn)出很少的或沒(méi)有增加。當(dāng)細(xì)胞聚集物在以上指定的時(shí)間段之后進(jìn)行恢復(fù)時(shí)（圖 6)，它們顯示出如由單層增殖表明的活力、以及由細(xì)胞形態(tài)和由用特定標(biāo)志物單克隆抗體 的熒光激活細(xì)胞分選術(shù)（FACS)的分析表明的細(xì)胞分化的多能性（圖7-9)。
[0326] 平鋪至單獨(dú)的細(xì)胞培養(yǎng)基的對(duì)照干細(xì)胞聚集物表現(xiàn)出如通過(guò)形態(tài)觀察和FACS分 析表明的直接分化（圖10)。
[0327] 總之，胚胎干細(xì)胞聚集物在膠凝的干細(xì)胞培養(yǎng)基組合物中的孵育導(dǎo)致相比于標(biāo)準(zhǔn) 干細(xì)胞培養(yǎng)物超過(guò)21天的干細(xì)胞分化和增殖兩者的停滯。
[0328] 實(shí)施例6 :NTERA2克降D1懷胎癌干細(xì)朐的包封
[0329] 本實(shí)施例描述了與聚（單甲基丙烯酸甘油酯）（PGMA) -起共聚合的甲基丙烯酸 2_羥基丙酯（HPMA)作為用于細(xì)胞包封的3D支架的用途。該共聚物可以在室溫下自組裝為 蠕蟲(chóng)狀膠束。這些膠束能夠彼此相互作用以產(chǎn)生3D凝膠基質(zhì)。細(xì)胞分化和多能性標(biāo)志物 的評(píng)價(jià)在將NTERA2克隆D1細(xì)胞包封進(jìn)入聚合物凝膠中之后被評(píng)價(jià)。
[0330] 實(shí)驗(yàn)過(guò)程
[0331] 共聚物 3D 懦蟲(chóng)凝膠如之前由 Armes 等人（Adam Blanazs, Jeppe Madsen, Giuseppe Battaglia, Anthony J. Ryan 和 Steven P.Armes J. Am. Chem. Soc.，2011，133, 16581)描述 的被制備。然后使用0.2 μπι注射器式過(guò)濾器將共聚物凝膠過(guò)濾滅菌。然后將NTERA2克隆 D1胚胎癌干細(xì)胞脫離并且然后在4°C包封在凝膠內(nèi)。作為參考，它們還被平鋪入2D形式的 多孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。
[0332] 在24h之后，將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為含有視黃酸的分化培養(yǎng)基。在不同時(shí)間點(diǎn)測(cè) 定3D (凝膠）和2D (組織培養(yǎng)塑制品）系統(tǒng)的MTS和標(biāo)志物表達(dá)（例如TUJ1、TRA1-60和 Vin2Pb22)〇
[0333] 結(jié)果
[0334] 在將細(xì)胞包封在凝膠內(nèi)之后（圖11)，它們被保持培養(yǎng)持續(xù)七天。MTS測(cè)定（圖 12)顯示蠕蟲(chóng)凝膠對(duì)于這種類(lèi)型的細(xì)胞培養(yǎng)物是無(wú)毒的。此外，細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白-DAPI染色 顯示它們可以在僅72h之后分裂、增殖并形成3D球體（圖13)。在七天之后，球體形成隨著 大的細(xì)胞集群的形成變得更明顯（圖13)。
[0335] 熟知的多能性干細(xì)胞標(biāo)志物TRA1-60被用以染色細(xì)胞。圖14顯示相比于在組織培 養(yǎng)塑制品上培養(yǎng)的細(xì)胞，包封的細(xì)胞在14和21天之后依然表達(dá)這種標(biāo)志物。諸如Vin2Pb22 的分化標(biāo)志物的分析顯示了其中在2D系統(tǒng)（組織培養(yǎng)塑制品）中直至21天才檢測(cè)到表達(dá) 的單一情形。
[0336] 免疫熒光測(cè)定數(shù)據(jù)通過(guò)使用qPCR來(lái)定量標(biāo)志物表達(dá)中的實(shí)時(shí)差異被證實(shí)。圖 15顯示了兩種多能性標(biāo)志物Nanog和0CT-04的表達(dá)，其當(dāng)與分化標(biāo)志物β 3微管蛋白和 h-ASHl相比時(shí)明顯不同。
[0337] 結(jié)果顯示PGMA-PHPMA蠕蟲(chóng)凝膠對(duì)NTERA2克隆D1 EC細(xì)胞是無(wú)毒的。此外，細(xì)胞 增殖并且形成球體，如由肌動(dòng)蛋白/DAPI染色鑒定的。這使得蠕蟲(chóng)凝膠是用于在模擬3D細(xì) 胞環(huán)境的系統(tǒng)內(nèi)研究分化過(guò)程和細(xì)胞發(fā)育的良好的候選物。表達(dá)的標(biāo)志物的研究表明，細(xì) 胞在視黃酸中培養(yǎng)超過(guò)21天保持未分化。qPCR結(jié)果證實(shí)可能因?yàn)榕cPGMA-HPMA蠕蟲(chóng)凝膠 的低的相互作用，在具有視黃酸的情況下細(xì)胞沒(méi)有分化。這些觀察結(jié)果表明，干細(xì)胞分化更 加依賴(lài)于細(xì)胞和支架之間的機(jī)械傳導(dǎo)力而不是來(lái)自生物活性分子的刺激。
[0338] 實(shí)施例7 TGMAfPHPMA^雙嵌段共聚物蠕蟲(chóng)直接在細(xì)朐培養(yǎng)基中制備蠕蟲(chóng)凝膠 的用涂
[0339] 伸用2-氰丙基二硫代苯甲酸醅（CPDB)合成PGMAtmacro-CTA
[0340] 將 CPDB(0. 80g，3. 6mmol)和單甲基丙烯酸甘油酯（GMA，40. 59g，0. 25mol)稱(chēng)重進(jìn) 入250ml圓底燒瓶并且用N2凈化20min。添加 ACVA(202. 9mg，0. 72mmol)并且將溶液脫氣 持續(xù)另外的5min。添加脫氣的無(wú)水乙醇（61ml，1.04mol)并且將溶液再次脫氣持續(xù)另外的 5min，然后浸入設(shè)定在70°C的油浴中。2h之后，在⑶ 30D中記錄的1H NMR光譜表明GMA單 體轉(zhuǎn)化率為約80%。通過(guò)從甲醇重復(fù)沉淀入過(guò)量二氯甲烷兩次以移除未反應(yīng)的單體，將 獲得的聚合物純化。在第二次沉淀之后，將純化的聚合物過(guò)濾并且將獲得的固體溶解在水 (200mL)中。使用設(shè)定在30°C的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀使殘留的二氯甲烷蒸發(fā)。在所有的痕量溶劑 被去除之后，將水溶液冷凍干燥過(guò)夜以提供粉紅色粉末。溶解在CD 30D中的純聚合物的1Η NMR光譜法研究表明平均聚合度為55。DMF GPC分析（相對(duì)聚（甲基丙烯酸甲酯）校準(zhǔn)標(biāo) 準(zhǔn)物）給出 14, 100g mol 1的 Μ "和 1. 09 的 M W/Mn。
[0341] 在0. 15M PBS中以20% w/v固體合成PGMAf - PHPMA^雙嵌段共聚物蠕蟲(chóng)
[0342] 將 PGMA55 (3. 023g，0· 33mmol)和 HPMA (6. 240g，41. 62mmol)稱(chēng)重進(jìn)入 100ml 圓底燒 瓶并且用N2凈化20min。添加 ACVA(31. 0mg，0. llmmol)并且將燒瓶脫氣持續(xù)另外的5min。 然后添加磷酸鹽緩沖鹽水（PBS)溶液（Dulbecco A，0xoid，Basingstoke，37ml，150mM，預(yù)先 用N2凈化30min)并且將溶液脫氣持續(xù)另外的5min，然后將反應(yīng)燒瓶浸入設(shè)定在70°C的油 浴2h，之后，在⑶ 30D中記錄的1H NMR光譜表明HPMA轉(zhuǎn)化率為幾乎100% (在5. 6ppm和 6. 2ppm的乙烯基信號(hào)的消失）。對(duì)于獲得的PGMA55-PHPMA135雙嵌段共聚物，DMF GPC分析 (相對(duì)聚（甲基丙烯酸甲酯）校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)物）給出35, 900g mol 1的MJP Mw/Mn= 1. 10。
[0343] 對(duì)于細(xì)胞生物學(xué)研究，評(píng)價(jià)了用于純化并制備PGMA55-PHPMA135蠕蟲(chóng)凝膠的三種方 案，參見(jiàn)以下。
[0344] 方案 1
[0345] 將合成的20 % w/v水性PGMA55-PHPMA135蠕蟲(chóng)凝膠在4°C對(duì)PBS透析2天，透析液 (PBS)每12h更換（MWC0 = 1，000)。將獲得的冷的自由流動(dòng)共聚物分散體在合適的細(xì)胞培 養(yǎng)基中（DMEM或Nutristem ;在混合之前預(yù)冷至4°C )稀釋至期望的濃度（通常6% w/v或 者10% w/v共聚物）并且在使用之前在該溫度下過(guò)濾滅菌，如以下描述的。
[0346] 方案 2
[0347] 將合成的20 % w/v PGMA55_PHPMA135凝膠在4 °C對(duì)PBS透析7天，透析液每12h 更換（MWC0 = 1，000)。將獲得的冷的自由流動(dòng)分散體在合適的細(xì)胞培養(yǎng)基中（DMEM或 Nutristem ;在混合之前預(yù)冷至4°C )稀釋至期望的濃度（通常6% w/v或者10% w/v共聚 物）并且在使用之前在該溫度下過(guò)濾滅菌，如以下描述的。
[0348] 方案 3
[0349] 將合成的20 % w/v PGMA55-PHPMA135凝膠在4°C對(duì)純水透析7天，透析液每12h更 換（MWC0= 1，000)。將獲得的凝膠冷凍干燥以產(chǎn)生干燥的共聚物蠕蟲(chóng)的精細(xì)粉末。將該粉 末再分散在合適的細(xì)胞培養(yǎng)基中（DMEM、EB (擬胚體培養(yǎng)基）或Nutristem ;在混合之前預(yù) 冷至4°C )以提供6% w/v或者10% w/v的共聚物分散體。使用冰浴將溫度維持在約4°C 并且磁力攪拌持續(xù)至少20min直到實(shí)現(xiàn)完全分散。在使用之前將獲得的液體過(guò)濾滅菌，如 以下描述的。
[0350] 滅菌橾作
[0351] 將分散在期望的細(xì)胞培養(yǎng)基中的6% w/v PGMA55-PHPMA135共聚物蠕蟲(chóng)凝膠冷卻至 4°C以引起蠕蟲(chóng)至球形的轉(zhuǎn)換，并且因此經(jīng)受去凝膠化以提供自由流動(dòng)的共聚物球體分散 體。然后使用無(wú)菌〇. 20 μ m注射器式過(guò)濾器將該冷的低粘度流體超濾入置于超凈工作臺(tái)內(nèi) 的無(wú)菌容器中。在超濾之前將注射器和過(guò)濾器儲(chǔ)存在_20°C持續(xù)至少lh以防止在接觸時(shí)的 凝膠化。然后將獲得的滅菌的共聚物分散體直接用于細(xì)胞集落包封實(shí)驗(yàn)，或儲(chǔ)存在4°C或 者-20°C用于將來(lái)使用（取決于細(xì)胞培養(yǎng)基的規(guī)格）。
[0352] 與PGMA^-PHPMA^蠕蟲(chóng)凝膠直接接觸中的細(xì)朐活力
[0353] 細(xì)胞活力測(cè)定使用原代人真皮成纖維細(xì)胞（HDF)來(lái)執(zhí)行。
[0354] 原代人真皮成纖維細(xì)胞（HDF)從ATCC (LGC Standards，UK)分批獲得。它們主要提 取自乳房縮小術(shù)和新生兒包皮。使用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基（DMB1補(bǔ)充以10% FCS、2x 10 3 mol dm3 L_谷氨酰胺、0. 625 μ g/ml兩性霉素 B、100IU/ml青霉素和100 μ g/ml鏈霉素）在T75燒瓶 中常規(guī)地培養(yǎng)成纖維細(xì)胞。在傳代4次和9次之間的成纖維細(xì)胞被用于測(cè)試。
[0355] 使用MTT測(cè)定對(duì)人真皮成纖維細(xì)胞（HDF)的細(xì)胞活力進(jìn)行測(cè)定
[0356] 將HDF以3xl04個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在24孔板中，并且生長(zhǎng)直到80%匯合（通 常48h)。在與細(xì)胞的直接接觸和另外地非直接接觸兩者中評(píng)價(jià)凝膠（轉(zhuǎn)籃法）。將非接觸 的ThinCert (Greiner Bio-One, UK)裝置用以鑒定可能存在于懦蟲(chóng)凝膠中的任何毒性低分 子量化合物（比如，未處理的HPMA單體）。ThinCert是組織培養(yǎng)塑制品的小籃樣結(jié)構(gòu)，具 有安裝在24孔板上的聚碳酸酯膜底部。因此將細(xì)胞通過(guò)24孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)基暴露至凝 膠，但不是通過(guò)直接接觸。該裝置區(qū)分蠕蟲(chóng)凝膠的直接接觸對(duì)細(xì)胞的影響和殘留的小分子 雜質(zhì)的影響。
[0357] 對(duì)于非直接接觸的裝置，將250 μ 1的10%共聚物凝膠加至每一個(gè)ThinCer籃。將 細(xì)胞置于每一個(gè)籃下并且浸入合適的細(xì)胞培養(yǎng)基（500 μ 1)中。對(duì)于直接接觸的裝置，將細(xì) 胞培養(yǎng)基從孔移出并且將凝膠（通常500 μ 1)直接施加至細(xì)胞單層上。將凝膠批次在80% 匯合的HDF細(xì)胞上測(cè)試超過(guò)24h。然后通過(guò)ΜΤΤ測(cè)定（3-(4, 5-二甲基噻唑-2-基）-2, 5-二 苯基溴化四氮唑）（Sigma-Aldrich，St Louis，M0)來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞活力。將細(xì)胞在4°C用冷的 PBS洗滌，然后與MTT溶液（20°C下的PBS中的0. 5mg/ml MTT，lml/24孔板的孔）一起在 37°C在增濕的培養(yǎng)箱（5%C02/95%空氣）中孵育lh。對(duì)于健康的有活力的細(xì)胞，MTT通過(guò) 線(xiàn)粒體酶、琥珀酸脫氫酶被還原為紫色甲臜鹽，其允許細(xì)胞活力的光譜定量。lh之后，將溶 液抽出并且通過(guò)加入酸化的異丙醇（0. 30ml/24孔板的孔），隨后孵育10min，將不可溶的細(xì) 胞內(nèi)甲臜產(chǎn)物溶解并且從細(xì)胞移出。然后使用讀取板的可見(jiàn)吸收分光光度計(jì)確定在540nm 處的吸光度，在630nm處的吸光度被用作參照。將平均活力數(shù)據(jù)和SEM針對(duì)陰性對(duì)照（未 處理，100%活力）歸一化并且表示為活力百分比土SEM。實(shí)驗(yàn)在一式兩份的孔的樣品中執(zhí) 行，η = 3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。對(duì)于統(tǒng)計(jì)分析，學(xué)生配對(duì)t檢驗(yàn)被用于原始數(shù)據(jù)以評(píng)價(jià)樣品和對(duì)照 組之間的差異顯著性。
[0358] 結(jié)果
[0359] 使用聚合誘導(dǎo)自組裝（PISA)構(gòu)想，（Blanazs等人，J Am Chem Soc，2012 年，134, 9741-9748) PGMA-PHPMA雙嵌段共聚物蠕蟲(chóng)凝膠可以在純水中或者在生理緩沖液 諸如PBS中直接合成。原則上，PBS應(yīng)促進(jìn)細(xì)胞生物相容性，因此初始構(gòu)想（參見(jiàn)以上方案 1)包括在PBS中以20% w/v固體合成PGMA55-PHPMA135蠕蟲(chóng)凝膠，隨后在4°C以其非膠凝的 形式對(duì)PBS透析2天（以確保完全去除任何低分子量雜質(zhì)），然后用期望的細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋 以提供6% w/v蠕蟲(chóng)凝膠。然而，對(duì)人真皮成纖維細(xì)胞（HDF)的細(xì)胞活力測(cè)定表明，該方案 不允許實(shí)現(xiàn)最佳的細(xì)胞活力（圖16)。事實(shí)上，直接接觸和間接接觸ThinCert測(cè)定二者均 表明細(xì)胞活力的明顯降低（P〈〇. 01)，參見(jiàn)圖16。因此新的方法（參見(jiàn)以上方案2)被開(kāi)發(fā)， 其中使PGMA55-PHPMA135共聚物分散體經(jīng)受持續(xù)7天而不是2天的透析。細(xì)胞活力測(cè)定證實(shí) 了性能的改進(jìn)，ThinCert測(cè)定顯示相比于未處理的對(duì)照組沒(méi)有顯著差異（參見(jiàn)圖16)。然 而，直接接觸測(cè)定仍然表明次佳的細(xì)胞活力（P〈〇. 05)。這不是出乎意料的，因?yàn)楫?dāng)制備此類(lèi) 蠕蟲(chóng)凝膠時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)基用PBS稀釋兩倍并且因此未處于其最佳濃度。為進(jìn)一步優(yōu)化細(xì)胞活 力，設(shè)計(jì)了第三方案（參見(jiàn)以上方案3)，其中在PBS中以20% w/v制備PGMA55-PHPMA135共 聚物蠕蟲(chóng)，對(duì)純水透析7天并且冷凍干燥過(guò)夜以提供干燥粉末，其可以被再分散在100 %細(xì) 胞培養(yǎng)基中以重新形成無(wú)需支撐的透明水性蠕蟲(chóng)凝膠。該后面的方案產(chǎn)生表現(xiàn)出非常高的 細(xì)胞活力（圖16)，同時(shí)維持細(xì)胞生物學(xué)應(yīng)用期望的熱可逆凝膠化行為的水凝膠。
[0360] 實(shí)施例8 :將hES細(xì)朐集落于37°C長(zhǎng)期潯入PGMAfPHPMA^禱蟲(chóng)凝膠中、隨后通討 在4°C去凝膠化收獲細(xì)朐之后，伸用存活/死亡測(cè)宙宙量hES細(xì)朐集落的存活
[0361] 集落恢復(fù)％實(shí)驗(yàn)
[0362] 除非另外聲明，hES細(xì)胞通常使用Nutristem細(xì)胞培養(yǎng)基（Stemgent, UK)和用 Cellstart 包被的 t25 容器（Life Technologies, UK)在無(wú)異種成分（xeno-free)的條件 下生長(zhǎng)。將細(xì)胞培養(yǎng)物維持在37°C在增濕的培養(yǎng)箱中（5% C02/95%空氣）并且將培養(yǎng)基 每天更新。當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到最佳的細(xì)胞密度（通常60-70%表面覆蓋）時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)基再 度補(bǔ)滿(mǎn)并且將集落在光學(xué)顯微鏡的輔助下機(jī)械地收獲。將集群從細(xì)胞培養(yǎng)基恢復(fù)并且置于 35mm皮氏培養(yǎng)皿上，為凝膠接種做好準(zhǔn)備。將ibidi 8孔載玻片置于冰上并且將500 μ 1冷 的6% PGMA55-PHPMA135共聚物分散體（其在~4°C是自由流動(dòng)的液體）加至每一個(gè)孔。使 用配備有'超細(xì)'吸頭的無(wú)菌塑料巴斯德吸管，將個(gè)體集落置于每一個(gè)ibidi孔的中心并且 溫和地?cái)嚢枰栽试S混合。通過(guò)將ibidi孔置于設(shè)定在37°C的增濕的培養(yǎng)箱（5% C02/95% 空氣）中來(lái)直接引發(fā)凝膠化（圖17)。將細(xì)胞集落孵育期望的時(shí)間段（即7、14或21天）， 然后收獲。使用光學(xué)顯微鏡確定每一個(gè)膠凝的孔中的集落的數(shù)目（通常3-15個(gè)）。通過(guò)將 每一個(gè)ibidi載玻片置于冰上約5min來(lái)引發(fā)凝膠化（圖17)并且將獲得的冷的自由流動(dòng) 的含有細(xì)胞集落的共聚物分散體在Cellstart處理的含有Nutristem(5. 0ml)的6孔板中 稀釋約10倍。這導(dǎo)致集落釋放入培養(yǎng)基。使用光學(xué)顯微鏡檢查ibidi孔并且記錄保持在 孔中的集落（或集落損耗）的數(shù)目。將6孔板在增濕的培養(yǎng)箱（5% C02/95%空氣）中儲(chǔ) 存約3h以允許有活力的細(xì)胞集落粘附至Cellstart基質(zhì)。隨后，將培養(yǎng)基每天再度補(bǔ)滿(mǎn)并 且持續(xù)直至7天監(jiān)控集落，記錄旺盛生長(zhǎng)的集落的數(shù)目。將集落恢復(fù)％計(jì)算為針對(duì)去凝膠 化之前的初始集落數(shù)目歸一化的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的平均集落恢復(fù)土SEM。集落損耗％也被相似 地評(píng)價(jià)。將內(nèi)部對(duì)照組包括在本研究?jī)?nèi)，其中將細(xì)胞集落浸入蠕蟲(chóng)凝膠中僅lOmin，并且然 后直接收獲。這使得集落分離和集落轉(zhuǎn)移方案的效率能夠被評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)在一式三份的孔中 執(zhí)行，η = 3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。
[0363] 存活/死亡測(cè)定
[0364] 使用熟知的商業(yè)化的存活/死亡測(cè)定（Life Technologies, UK)評(píng)價(jià)浸入在 PGMA55-PHPMA13蠕蟲(chóng)凝膠內(nèi)的hES細(xì)胞集落的活力。該測(cè)定使用細(xì)胞可滲透的SYTO? 9 綠色熒光核酸染料（激發(fā)光480nm，發(fā)射光500nm)和不可滲透的紅色熒光核酸染料，碘化丙 啶（PI，激發(fā)光490nm，發(fā)射光635nm)的二元混合物。具有受損的（即滲漏的）膜的細(xì)胞被 染成紅色（PI)并且被指定為死的或?qū)⑺赖?，然而具有完整膜的?xì)胞被染成綠色（Syto-9) 并且指定為活的。當(dāng)單獨(dú)使用時(shí)，PI染料通常標(biāo)記所有細(xì)胞；但當(dāng)兩種染料均存在時(shí)，PI滲 透損壞的膜并且由于Syto 9而猝滅熒光，使得其綠色信號(hào)不被檢測(cè)到。簡(jiǎn)而言之，將膠凝 的集落冷卻至約4°C持續(xù)5min以引發(fā)去凝膠化并且然后允許在重力下沉淀。將自由流動(dòng)的 水性共聚物分散體上清液部分地移出并且用預(yù)冷至4°C的細(xì)胞培養(yǎng)基將集落洗滌一次。然 后將水性流體移出并且將溫的（37°C )細(xì)胞培養(yǎng)基加至含有Syto 9(15 μ M)和PI (60 μ M) 的每一個(gè)孔。將細(xì)胞在增濕的培養(yǎng)箱（5% C02/95%空氣）中孵育25min以允許染料攝取 發(fā)生。然后將細(xì)胞核用Hoechst 33342 (Life Technologies, UK)復(fù)染另外的5min。最終， 將集落用PBS(預(yù)冷至4°C )洗滌并且加入另外的培養(yǎng)基（取決于容器，通常對(duì)于6孔板為 3ml并且對(duì)于ibidi成像板為500 μ 1)，然后使用用于活細(xì)胞研究的配備有Okolab環(huán)境控 制室的Nikon A1共聚焦顯微鏡檢測(cè)。
[0365] MM.
[0366] 基于熒光染料保留與共聚焦顯微術(shù)組合的存活/死亡細(xì)胞測(cè)定使能夠在細(xì)胞浸 入蠕蟲(chóng)凝膠內(nèi)的同時(shí)監(jiān)測(cè)其活力（參見(jiàn)圖18)。在7天之后，所有細(xì)胞集落表現(xiàn)出高的活 力，具有非常少的碘化丙啶（PI，其選擇性將死細(xì)胞染成紅色）染色的證據(jù)并且觀察到主要 的綠色熒光標(biāo)志物（Syto 9)。在浸入14天之后，一些集落包含無(wú)活力的PI染色的細(xì)胞區(qū) 域（估計(jì)為〈總區(qū)域的10% )，但是集落中的大多數(shù)細(xì)胞表現(xiàn)出良好的活力，如通過(guò)由于 Syto 9的綠色熒光指示的（圖18)。在浸入蠕蟲(chóng)凝膠內(nèi)21天之后，顯著比例的細(xì)胞集落仍 然表現(xiàn)出至少一些有活力的細(xì)胞（參見(jiàn)圖18)。
[0367] 為進(jìn)一步評(píng)價(jià)這些蠕蟲(chóng)凝膠內(nèi)的細(xì)胞集落的活力，確定了去凝膠化之后恢復(fù)的有 活力的集落的比例（圖19)。已知集落脫離的力學(xué)可損害PSC活力（Heng等人，Biotechnol Appl Biochem. 2007, 47, 33-37)，因此實(shí)施對(duì)照實(shí)驗(yàn)（參見(jiàn)圖19,0周），其中將細(xì)胞集落浸 入蠕蟲(chóng)凝膠內(nèi)僅10分鐘，然后通過(guò)冷離心再次移出。約70±3%的收獲的細(xì)胞集落能夠粘 附至Cellstart并且增殖。在7天和14天之后，分別恢復(fù)了 57±10%和59±5%的有活力 的集落。
[0368] 因?yàn)榻臃N用于集落恢復(fù)％實(shí)驗(yàn)的集落被機(jī)械地解聚，所以難以實(shí)現(xiàn)均一的集落大 小分布。人們發(fā)現(xiàn)在從蠕蟲(chóng)凝膠分離之后，初始集落大小對(duì)結(jié)果具有明顯影響。如果集落 大小小于100μπι直徑，在分離之后極少的集落粘附至CellStart并增殖并且該小的群體 完全分化或不會(huì)旺盛生長(zhǎng)（圖20A和20B)。對(duì)于超過(guò)100 μ m的集落大小觀察到較好的 恢復(fù)率（圖20C、20B)，具有在100μπι和200 μπι之間范圍的集落表現(xiàn)出典型的ES細(xì)胞形 態(tài)（圖20D)。當(dāng)使用液體培養(yǎng)基時(shí)，集落大小對(duì)細(xì)胞活力的相似影響已經(jīng)被其他工作者在 7??? (Thomson, J. A. , Itskovitz-Eldor, J. , Shapiro, S. S. , ffaknitz, M. A. , Swiergiel, J. J.，Marshall, V. S.和 Jones, J. M. Science, 1998, 282, 1145-1147 ;Reubinoff 等人，Nature Biotechnology 2000, 18, 399-404)。有趣地，當(dāng)將相對(duì)大（》200 μ m)的集落浸入蠕蟲(chóng)凝膠 中時(shí)（圖20E)，它們?cè)陧敳棵黠@變得密集，而不是平展。此外，此類(lèi)集落的邊緣往往表現(xiàn)出 一定程度的神經(jīng)元分化，如通過(guò)光學(xué)顯微術(shù)判斷的。對(duì)于分散在液體培養(yǎng)基中的高密度集 落，報(bào)道了相似的觀察結(jié)果（Reubinoff 等人，Nature Biotechnology, 2000, 18, 399-404) 〇
[0369] 實(shí)施例9 :非增葙件停滯（假死狀杰）的實(shí)驗(yàn)證據(jù)
[0370] DNA 提取
[0371] 將集落從t25燒瓶機(jī)械地回收并且在使用之前置于35mm皮氏培養(yǎng)皿上。用固定 體積（500 μ 1)的細(xì)胞集落接種每一個(gè)ibidi孔。該懸浮液允許沉淀5min并且然后將液體 培養(yǎng)基小心地移出。然后將6% PGMA-PHPMA共聚物分散體（500 μ 1 ;預(yù)冷至4°C )加至每一 個(gè)孔并且溫和攪拌以允許混合。通過(guò)將ibidi孔在37°C置于增濕的培養(yǎng)箱（5% C02/95% 空氣）中直接引發(fā)凝膠化。然后將細(xì)胞集落孵育7、14或21天。當(dāng)需要時(shí)，通過(guò)將每一個(gè) ibidi載玻片置于冰上約5min引發(fā)去凝膠化。然后將每一個(gè)孔的內(nèi)容物置于含有冰冷的 PBS(l.Oml)的標(biāo)記的1.5ml Eppendorf管中。在4°C持續(xù)5min兩次離心樣品（1000rcf)。 使用100 μ 1的消化緩沖液（包含TE緩沖液（10mM Tris pH 8和ImM EDTA)加0· 2% SDS) 將細(xì)胞沉淀物在37°C孵育4h。在此之后，將包含用TE緩沖液飽和的25:24:1的苯酚：氯 仿：異戊醇（100 μ 1)的溶劑混合物加至每一個(gè)Eppendorf管并且通過(guò)禍旋完全混合。將樣 品在20°C離心5min(14, OOOrcf)。然后將水性上清液輕輕倒出并且與冰冷的乙醇（450 μ 1) 和3Μ乙酸鈉（50 μ 1)混合。通過(guò)在20°C離心5min(14, OOOrcf)使DNA沉淀。將上清液小 心地輕輕倒出并且將DNA沉淀物在37°C烘箱中干燥。將干燥的沉淀物重懸在TE緩沖液 (20 μ 1)中。使用Nanodrop分光光度計(jì)通過(guò)確定在260nm處的吸光度來(lái)計(jì)算DNA濃度。將 數(shù)據(jù)相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照組歸一化，在內(nèi)部對(duì)照組中細(xì)胞集落膠凝持續(xù)約l〇min并且然后直接 收獲（第〇天）。實(shí)驗(yàn)在一式兩份的孔中執(zhí)行，η = 3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。
[0372] ki67 免痔標(biāo)iP,
[0373] 對(duì)膠凝的集落和恢復(fù)的集落（即在熱誘導(dǎo)的去凝膠化之后）執(zhí)行針對(duì)ki67的免 疫標(biāo)記測(cè)定。將平鋪的恢復(fù)的集落用PBS直接洗滌兩次并且使用PBS中的4%甲醛的水 溶液（750 μ 1)固定30min。通過(guò)在冰上孵育約5min以誘導(dǎo)去凝膠化來(lái)從蠕蟲(chóng)凝膠分離 集落。然后將每一個(gè)孔收集到含有冰冷的PBS(lml)的1.5ml Eppendorf管中。將集落 在4°C持續(xù)5min(1000rcf)洗滌兩次并且然后使用PBS(100 μ 1)中的4%甲醛的水溶液固 定30min。然后在PBS中將所有樣品洗滌三次并且使用0. 1 % Triton X100PBS溶液滲透 20min (lmL/6孔板中的孔并且100 μ Ι/Eppendorf管）。然后將集落在PBS中洗滌三次并且 在20°C于5% BSA-PBS中封閉2h，然后在溫和搖動(dòng)下與一抗溶液（1:1000兔抗人ki67單 克隆抗體（Abeam)+PBS中的1% BSA) -起在4°C孵育過(guò)夜。然后將這些抗體標(biāo)記的集落在 PBS中洗滌三次并且在溫和搖動(dòng)下與二抗溶液（1:1000山羊抗兔Cy3 IgG (abeam)+PBS中的 1% BSA) -起在20°C孵育lh。用PBS洗滌集落三次并且將細(xì)胞核用Hoechst 33342(Life Technologies，UK)復(fù)染5min。最后，使用PBS將每一個(gè)樣品洗滌三次，然后使用EV0S熒光 顯微成像系統(tǒng)檢查。
[0374] MS
[0375] hES集落隨時(shí)間推移的光學(xué)顯微術(shù)研究顯示，集落大小或數(shù)目幾乎沒(méi)有變化（參 見(jiàn)圖21)。然而，存活/死亡成像和集落恢復(fù)數(shù)據(jù)表明，在集落長(zhǎng)期儲(chǔ)存于蠕蟲(chóng)凝膠中之后， 其相對(duì)高的比例保持有活力的（圖18)。為評(píng)價(jià)蠕蟲(chóng)凝膠內(nèi)的細(xì)胞增殖的程度，收獲集落并 且隨時(shí)間推移確定從細(xì)胞核提取的DNA的歸一化的量（相對(duì)于第0天）（參見(jiàn)圖21)。檢測(cè) 到 DNA的總量沒(méi)有明顯變化，表明在細(xì)胞集落儲(chǔ)存在蠕蟲(chóng)凝膠中期間其可忽略的增殖。免 疫標(biāo)記實(shí)驗(yàn)（參見(jiàn)圖22)表明浸入蠕蟲(chóng)凝膠中之后，hES細(xì)胞經(jīng)歷細(xì)胞周期在G1/S檢查點(diǎn) 的停滯。ki-67的存在是細(xì)胞增殖的熟知的標(biāo)志物并且該蛋白質(zhì)存在于細(xì)胞周期的每一個(gè) 階段期間（Scholzen和 Gerdes J Cell Physiol. 2000, 182, 311-322)。膠凝的集落中 ki-67 的不存在通過(guò)在調(diào)查的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的選擇性染色實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)，其暗示了 hES細(xì)胞在GJ月退 出細(xì)胞周期并且進(jìn)入其休眠狀態(tài)或停滯態(tài)（參見(jiàn)圖22)。與此相反，經(jīng)由去凝膠化然后粘 附至合適的ECM基質(zhì)（即，Cellstart)的收獲使集落能夠重新進(jìn)入細(xì)胞周期（如通過(guò)陽(yáng) 性ki-67染色判斷的）并且重新恢復(fù)其增殖狀態(tài)（參見(jiàn)圖22)。PGMA 55-PHPMA135雙嵌段共 聚物蠕蟲(chóng)凝膠不包含特異性結(jié)合基序以促進(jìn)細(xì)胞粘附。事實(shí)上，它的多個(gè)羥基的功能被已 知為減少細(xì)胞粘附（Faucheux 等人，Biomaterials, 2004, 25, 2721 - 2730 ;Arima 等人，J. Mater. Chem.，2007, 17, 4079-4087)。最近，已報(bào)道hES細(xì)胞利用失巢凋亡作為（i)在細(xì)胞粘 附不存在時(shí)的細(xì)胞死亡機(jī)制（Watanabe 等人，Nature Biotechnology, 2007, 25, 681-686) 和（ii)在分化期間典型的生理事件（Coucouvanis 和 Martin Cell, 1995, 83, 279 - 287)。 因此，將hES細(xì)胞浸入如此生物惰性的、非相互作用的3D基質(zhì)中是不明顯的，因?yàn)檫@些蠕蟲(chóng) 凝膠應(yīng)導(dǎo)致停滯而不是失巢凋亡。
[0376] 實(shí)施例10 :運(yùn)輸數(shù)據(jù)
[0377] 最近，胚胎干細(xì)胞庫(kù)已經(jīng)在全世界范圍建立。這些庫(kù)在將用于研究團(tuán)體的高質(zhì) 量的人和動(dòng)物ES細(xì)胞存檔和提供高質(zhì)量的人和動(dòng)物ES細(xì)胞中起重要作用。這些細(xì)胞庫(kù) 已經(jīng)有效產(chǎn)生大量冷藏保存的細(xì)胞系和基因工程化的（即報(bào)告物基因）細(xì)胞系并且已經(jīng) 向要求其的研究者供應(yīng)這些株系。冷藏保存對(duì)于儲(chǔ)存和運(yùn)輸人胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）是 關(guān)鍵的步驟（The International Stem cell banking Initiative, Stem Cell Rev and R印，2009, 5, 301 - 314)。有效冷藏保存的方法必須提供高的解凍效率并且維持細(xì)胞的多 能性和分化潛能兩者。然而，冷藏保存的細(xì)胞的運(yùn)輸是相對(duì)昂貴的并且具有許多相關(guān)的 問(wèn)題。例如，接收設(shè)施必須具有特定冷凍和解凍方案所需的合適的技術(shù)人員和設(shè)備并且 最佳的遞送時(shí)間是關(guān)鍵的（Shaw 和 Nakagata Methods Mol Biol, 2002, 180, 207 - 228)。 此外，次佳的冷凍解凍過(guò)程可以對(duì)細(xì)胞造成明顯損傷（Shaw和Nakagata Methods Mo 1 Biol, 2002, 180, 207 - 228)。此外，液氮容器的運(yùn)輸由國(guó)際航空運(yùn)輸協(xié)會(huì)（International Air Transport Association)嚴(yán)格規(guī)定（ΙΑΤΑ0(ΙΑΤΑ危險(xiǎn)物品條例手冊(cè)第54版本（國(guó)際 航空運(yùn)輸協(xié)會(huì)），產(chǎn)品代碼：BK-IATA13, 2013)，所以可選的較便宜的和較安全的運(yùn)輸選擇 是高度期望的。通常，研究機(jī)構(gòu)交換細(xì)胞，將它們?cè)谝砸后w培養(yǎng)基填充的C0 2充氣的細(xì)胞培 養(yǎng)容器中運(yùn)輸。盡管這潛在地是有用的替代選擇，但是培養(yǎng)中的ES細(xì)胞無(wú)法很好地應(yīng)對(duì)低 溫應(yīng)激（Reubinoff等人Hum. Reprod. 2001，16, 2187 - 2194)?？赡芰钊艘馔獾?，非常少的研 究者已專(zhuān)心于此課題，特別是考慮到生長(zhǎng)ES細(xì)胞市場(chǎng)的潛在商業(yè)收益。對(duì)于可局部配送的 產(chǎn)品，其應(yīng)該能夠在運(yùn)輸條件下存活至少24h。如果其存活時(shí)間可以被增加至48h，這應(yīng)該 使能夠洲際間遞送并且存活72h在原則上會(huì)允許在全世界范圍的遞送。
[0378] 調(diào)查了使用Nutristem制備的6% PGMA55-PHPMA135蠕蟲(chóng)凝膠作為持續(xù)24、48和72h 的儲(chǔ)存時(shí)間的潛在運(yùn)輸培養(yǎng)基（圖23)。作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)，Nutristem還以其液體（即非膠凝 的）形式被用作常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)基。在本實(shí)施例中，使細(xì)胞集落粘附至單獨(dú)的Cellstart包被 的35mm ibidi培養(yǎng)皿的底部。將浸入蠕蟲(chóng)凝膠或者液體Nutristem的細(xì)胞集落在37°C的 5 % C02-增濕的培養(yǎng)箱中平衡8h，然后儲(chǔ)存在典型的聚苯乙烯運(yùn)輸盒中。在假設(shè)的儲(chǔ)存時(shí)間 期間，將加熱的（37°C)墊加至儲(chǔ)存盒以最小化隨該時(shí)間段的推移的熱損失。這使得能夠維 持在約18°C至22°C的溫度范圍而不是37°C。在每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)之后，將浸入液體Nutristem 中的細(xì)胞返回至正常細(xì)胞培養(yǎng)條件（即37°C在增濕的培養(yǎng)箱中（5%C02/95%空氣）），而將 蠕蟲(chóng)凝膠內(nèi)的集落通過(guò)去凝膠化（如前述的）分離并且然后允許粘附至單獨(dú)的Cellstart 包被的35mm ibidi培養(yǎng)皿的底部。將粘附的細(xì)胞集落留置在培養(yǎng)箱中過(guò)夜（約16h)以恢 復(fù)并且然后記錄這些集落的光學(xué)圖像（圖23)。在模擬的運(yùn)輸儲(chǔ)存條件下，液體Nutristem 中的細(xì)胞集落良好存活直至24h，大多數(shù)集落表現(xiàn)出典型的hES形態(tài)。相似地，在相同條件 下儲(chǔ)存之后，浸入懦蟲(chóng)凝膠中的集落也良好恢復(fù)。但是，儲(chǔ)存在液體Nutristem中的細(xì)胞在 48h之后表現(xiàn)出應(yīng)激跡象。集落表現(xiàn)出'聚集'并且脫離的碎片的量增加，盡管一些集落仍 然保持粘附。（圖23)。相反，在蠕蟲(chóng)凝膠內(nèi)儲(chǔ)存的細(xì)胞集落在48h之后恢復(fù)相對(duì)良好并且 保留其特征性形態(tài)，但是相比于在24h之后分離的那些，顯著較少的有活力的集落被恢復(fù)。 在72h之后沒(méi)有有活力的集落可以從液體Nutristem被恢復(fù)；所有集落表現(xiàn)出脫離和聚集 (圖23)。然而，在蠕蟲(chóng)凝膠內(nèi)儲(chǔ)存72h之后，一些有活力的細(xì)胞集落仍然可以被恢復(fù)（圖 23) 〇
[0379] 實(shí)施例11 :在蠕蟲(chóng)凝膠內(nèi)儲(chǔ)存?zhèn)€體hES細(xì)朐
[0380] 研究了蠕蟲(chóng)凝膠保存?zhèn)€體hES細(xì)胞的懸浮液（而不是hES集落）的用途。培養(yǎng)個(gè) 體hES細(xì)胞的懸浮液并且然后在使用3i培養(yǎng)基制備的6% PGMA55-PHPMA135蠕蟲(chóng)凝膠中膠 凝。該特定的培養(yǎng)基包含有利于個(gè)體hES細(xì)胞培養(yǎng)物的特定失巢凋亡抑制劑（Gafni等人， Nature. 2013, 504(7479)，282-286)。簡(jiǎn)言之，用PBS將含有培養(yǎng)中的hES細(xì)胞的每一個(gè)t25 容器洗滌一次并且然后加入細(xì)胞解離液（1. 50ml，Sigma-Aldrich)。在37°C于增濕的培養(yǎng) 箱（5% C02/95%空氣）中孵育3min之后，通過(guò)加入3i細(xì)胞培養(yǎng)基（1.51111)、隨后于201€ 在lOOOrcf離心5min收獲個(gè)體細(xì)胞的懸浮液。將沉淀物在~4°C重懸在液體3i細(xì)胞培養(yǎng) 基（1. 5ml)中或者冷的自由流動(dòng)的共聚物分散體中（使用3i培養(yǎng)基制備的），其在加熱至 37°C后快速形成蠕蟲(chóng)凝膠。在Cellstart包被的6孔板上培養(yǎng)液體3i培養(yǎng)基中的細(xì)胞，而 蠕蟲(chóng)凝膠加3i培養(yǎng)基中儲(chǔ)存的細(xì)胞在37°C于增濕的培養(yǎng)箱（5% C02/95%空氣）中24h之 后，通過(guò)去凝膠化分離并且然后允許粘附在Cellstart包被的6孔板上。在16h之后，通過(guò) 光學(xué)顯微術(shù)檢查細(xì)胞（圖24)。從液體3i培養(yǎng)基以及蠕蟲(chóng)凝膠加3i培養(yǎng)基回收的細(xì)胞，在 其恢復(fù)之后表現(xiàn)出相似的大小、形態(tài)和表面覆蓋率。因此，6% PGMA55-PHPMA135蠕蟲(chóng)凝膠可 以被用以?xún)?chǔ)存?zhèn)€體hES細(xì)胞的懸浮液而沒(méi)有任何可辨別的有害影響。
[0381] 實(shí)施例11 :流奪學(xué)研究
[0382] 使用配備有可變溫度Peltier板和40mm 2°鋁錐體的AR-G2流變儀（TA儀器）對(duì) 多種水性培養(yǎng)基中的6% w/v PGMA55-PHPMA135共聚物蠕蟲(chóng)凝膠進(jìn)行流變學(xué)研究。
[0383] 對(duì)于三種類(lèi)型的細(xì)胞培養(yǎng)基（例如PBS、EB(擬胚體培養(yǎng)基， Millipore)、NS(Nutristem 培養(yǎng)基，Stemgent)或 3i 培養(yǎng)基（Gafni 等人， Nature. 2013, 504 (7479)，282-286)，在凝膠強(qiáng)度（G，~lOta)或者臨界凝膠化溫度（CGT~ 18°C )方面沒(méi)有觀察到顯著差異。使用PBS制備的蠕蟲(chóng)凝膠的CGT是略低的（17°C )，但其 熱可逆行為卻是廣泛地類(lèi)似的。在所有情況中，每種凝膠的應(yīng)變掃描（圖25b)產(chǎn)生可比較 的G'值（9Pa至13Pa)，具有以約60%應(yīng)用的應(yīng)變存在的從線(xiàn)性粘彈區(qū)的偏離。角頻率掃 描（圖25c)也是廣泛可比較的；表明改變細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)蠕蟲(chóng)凝膠流變學(xué)僅具有相對(duì)緩和的 影響。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于干細(xì)胞的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包含分散在水性媒介物中的合成的熱響應(yīng)共 聚物的顆粒； 其中所述培養(yǎng)基能夠響應(yīng)溫度變化經(jīng)受非凝膠狀形式和凝膠狀形式之間的變化，并且 在所述非凝膠狀形式中，所述培養(yǎng)基包含所述合成的熱響應(yīng)共聚物的顆粒的膠狀穩(wěn)定的水 性分散體，并且在所述凝膠狀形式中，所述培養(yǎng)基是提供能夠容納干細(xì)胞的支架或基質(zhì)的 凝膠形式； 并且其中所述水性媒介物還包含用于維持干細(xì)胞的活力的營(yíng)養(yǎng)物； 并且其中所述熱響應(yīng)共聚物由式B來(lái)定義：其中P1表示源自單體M i的聚合物組分并且P 2表示源自水溶性單體M 2的基本上水不溶 性的聚合物組分。2. 如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基能夠響應(yīng)溫度變化經(jīng)受所述非凝膠狀 形式和所述凝膠狀形式之間的可逆變化。3. 如任一前述權(quán)利要求所述的培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基在低于膠凝溫度的溫度下以 所述非凝膠狀形式存在，并且在高于所述培養(yǎng)基的所述膠凝溫度的溫度下以凝膠狀形式存 在，并且所述培養(yǎng)基在大于或等于20°C的溫度下是所述凝膠狀形式。4. 如任一前述權(quán)利要求所述的培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基以所述凝膠狀形式是透明的。5. 如任一前述權(quán)利要求所述的培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基（任何干細(xì)胞/分化后的細(xì)胞 除外）不含動(dòng)物來(lái)源的產(chǎn)品。6. 如任一前述權(quán)利要求所述的培養(yǎng)基，其中當(dāng)所述培養(yǎng)基是所述非凝膠狀形式時(shí)，所 述合成的熱響應(yīng)共聚物的顆粒基本上是球形（例如，球體或類(lèi)球體顆粒），并且當(dāng)所述培養(yǎng) 基是凝膠狀形式時(shí)，所述合成的熱響應(yīng)共聚物的顆?；旧鲜歉飨虍愋缘?蠕蟲(chóng)"或"蠕蟲(chóng) 狀"顆粒。7. 如任一前述權(quán)利要求所述的培養(yǎng)基，其中所述熱響應(yīng)共聚物包含至少一種親水性聚 合物嵌段和至少一種疏水性聚合物嵌段。8. 如任一前述權(quán)利要求所述的培養(yǎng)基，其中： 每個(gè)單體M1選自式M 1A、Mib和/或M i。的單體：其中R1、Rw和R 11表示允許P i是至少部分水溶性的M 1A或M 1C的取代基， R2表示 H、CH 3或 CN， Rs表示有效允許P i是至少部分水溶性的芳環(huán)的一個(gè)或更多個(gè)取代基，并且 每個(gè)單體M2選自式M 2A和/或M 2B的單體：其中R3是允許P 2是基本上水不溶性的M 2的取代基，并且R4和R6獨(dú)立地表示H或甲 基； 或P1是包含單體M i與單體M 2的共聚物，條件是所述聚合物P i保持水溶性。9. 如任一前述權(quán)利要求所述的培養(yǎng)基，其中P i自身是包含單甲基丙烯酸甘油酯（GM) 單體單元的聚合物或共聚物，并且P2g身是包含甲基丙烯酸2-羥基丙酯（HPM)單體單元 的聚合物或共聚物。10. 如任一前述權(quán)利要求所述的培養(yǎng)基，其中所述熱響應(yīng)共聚物是選自包括以下的組 的式B [P1-P2]的嵌段共聚物： -PGMA-PHPMA，其中所述PGM嵌段具有在20和200之間的聚合度；并且所述PHPM嵌 段具有在50和300之間的聚合度； -PGM-P (GM-HPM)，其中所述PGM嵌段具有10至120的聚合度（DP)，并且所述 P(GM-HPM)嵌段可以合適地具有在20和200之間的聚合度（DP);以及 -PGM-P (DEGM-HPM)，其中所述PGM嵌段具有在20和200之間的聚合度；所述 P(DEGM-HPM)嵌段具有在20和200之間的聚合度（DP);并且所述P (DEGM-HPM)嵌段中 DEGMA與HPMA單體單元的摩爾比位于10:1和1:10之間。11. 如任一前述權(quán)利要求所述的培養(yǎng)基，其中所述水性媒介物包括磷酸鹽緩沖鹽水。12. 如任一前述權(quán)利要求所述的培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基包含： -1-30% w/w合成的熱響應(yīng)共聚物的顆粒； -70-99% w/w水性媒介物。13. -種用于制備根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基的試劑盒，所述試劑盒 包括： (i) 如權(quán)利要求1至12任一項(xiàng)中定義的合成的熱響應(yīng)共聚物的顆粒；以及 (ii) 如權(quán)利要求1至12任一項(xiàng)中定義的水性媒介物。14. 一種形成根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基的方法，所述方法包括將所 述合成的熱響應(yīng)共聚物的顆粒分散在所述水性媒介物中。15. 如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述方法包括在所述熱響應(yīng)共聚物的顆粒在所述 水性媒介物中的分散之前，將其預(yù)滅菌；所述預(yù)滅菌包括所述熱響應(yīng)共聚物的顆粒的超濾。16. -種儲(chǔ)存或保存一種或更多種干細(xì)胞的方法，所述方法包括： (i) 使非凝膠狀形式的根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基與一種或更多種干 細(xì)胞接觸以產(chǎn)生流體干細(xì)胞組合物； (ii) 改變所述培養(yǎng)基的溫度使得所述培養(yǎng)基從所述非凝膠狀形式改變?yōu)樗瞿z狀 形式并且從而產(chǎn)生膠凝的干細(xì)胞組合物；以及 (iii) 儲(chǔ)存所述膠凝的干細(xì)胞組合物。17. 如權(quán)利要求16所述的方法，其中步驟（i)在KTC或低于KTC的溫度下用所述干細(xì) 胞培養(yǎng)基來(lái)執(zhí)行；并且步驟（ii)包括將所述干細(xì)胞基質(zhì)的溫度從在l〇°C或低于KTC調(diào)整 直至18°C或高于18°C。18. 如權(quán)利要求16至17中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟（iii)包括將所述膠凝的干細(xì) 胞組合物儲(chǔ)存至少7天。19. 一種干細(xì)胞組合物，所述干細(xì)胞組合物包含分散在根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng) 所述的培養(yǎng)基中的一種或更多種干細(xì)胞。20. -種從膠凝的干細(xì)胞組合物釋放一種或更多種干細(xì)胞的方法，所述方法包括： (i) 提供膠凝的干細(xì)胞組合物，所述膠凝的干細(xì)胞組合物包含分散在凝膠狀形式的根 據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基內(nèi)的一種或更多種干細(xì)胞； (ii) 改變所述干細(xì)胞培養(yǎng)基的溫度使得所述培養(yǎng)基從所述凝膠狀形式改變?yōu)樗龇?凝膠狀形式，從而產(chǎn)生流體干細(xì)胞組合物；以及 (iii) 任選地其后從所述流體干細(xì)胞組合物分離所述干細(xì)胞。21. 如權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基用于儲(chǔ)存、保存、培養(yǎng)和/或分化一種或 更多種干細(xì)胞的用途。22. -種藥物組合物，所述藥物組合物包含根據(jù)權(quán)利要求19所述的干細(xì)胞組合物，以 及任選地一種或更多種藥學(xué)上可接受的賦形劑。23. -種如權(quán)利要求22所述的藥物組合物，用于在治療中使用。24. -種如權(quán)利要求22所述的藥物組合物，用于在干細(xì)胞治療中使用。25. 如任一前述權(quán)利要求所述的培養(yǎng)基、試劑盒、方法、干細(xì)胞組合物、用途或藥物組合 物，其中所述干細(xì)胞是哺乳動(dòng)物干細(xì)胞。26. 如任一前述權(quán)利要求所述的培養(yǎng)基、試劑盒、方法、干細(xì)胞組合物、用途或藥物組合 物，其中所述干細(xì)胞是除了通過(guò)包括破壞人胚胎和/或人胚胎干細(xì)胞的方法產(chǎn)生或獲得的 那些之外的干細(xì)胞。27. 如任一前述權(quán)利要求所述的培養(yǎng)基、試劑盒、方法、干細(xì)胞組合物、用途或藥物組合 物，其中所述干細(xì)胞是未分化的。28. 如上文參考所附的實(shí)施例和附圖大體上描述的培養(yǎng)基、試劑盒、方法、干細(xì)胞組合 物、用途或藥物組合物。
【文檔編號(hào)】C12N5/00GK105899656SQ201480009328
【公開(kāi)日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2014年2月21日
【發(fā)明人】艾倫·坎頓, 史蒂文·彼得·阿姆斯, 尼古拉斯·約翰·沃倫, 哈里·摩爾, 朱塞佩·巴塔利亞, 丹尼斯·賽欽
【申請(qǐng)人】謝菲爾德大學(xué)