一種木薯胚性愈傷組織離體保存培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一種木薯胚性愈傷組織離體保存的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 木薯（manihot esculenta Crantz)是大戟科（Euphorbiaceae)木薯屬（Manihot) 的灌木狀植物，別名南洋薯、木蕃薯和樹(shù)薯，起源于南美洲，是熱帶地區(qū)最重要的塊根食物， 是世界三大薯類作物之一，素有"地下糧倉(cāng)"、"淀粉之王"等之美稱，廣泛栽培于熱帶和亞熱 帶地區(qū)，在我國(guó)廣為栽培，木薯的栽培及加工利用在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要的地位。
[0003] 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究通過(guò)對(duì)國(guó)內(nèi)木薯種質(zhì)資源的考察，已 經(jīng)收集了一批國(guó)內(nèi)外的木薯種質(zhì)資源，成為我國(guó)唯一的國(guó)家級(jí)木薯種質(zhì)資源圃，同時(shí)也建 立了木薯種質(zhì)資源離體保存庫(kù)。然而，圃地活體的保存易遭受病蟲(chóng)害的侵襲和極端環(huán)境的 威脅；試管苗保存，長(zhǎng)期離體培養(yǎng)需定期繼代，且可能會(huì)引起遺傳變異；低溫或超低溫離體 保存設(shè)備成本高、耗能高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，提供一種適宜木薯胚性組織離體保 存的培養(yǎng)基，其能夠最大限度的延長(zhǎng)木薯胚性愈傷組織保存時(shí)間，同時(shí)保持胚性愈傷組織 的細(xì)胞活力。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0006] -種木薯胚性愈傷組織離體保存培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包括：
[0007] 大量元素：Ca(N03)2 · 2H20 210-250mg/L ;KC1 65-75mg/L ;KH2P04 3 00-400mg/L ;
[0008] KN03 1 000-1200mg/L ；MgS04 1 7-20mg/L ；NH4N03 1 000-1200mg/L ；
[0009] 微量元素：CaCl2 · 6H20 0· 025-0. 050mg/L ;CuS04 · 5H20 0· 025-0. 050mg/L ; FeNaEDTA37-40mg/L ；H3B03 0. 3〇-〇. 50mg/L ；KI 0. 80-1. OOmg/L ；MnS04 · H20 1. 00-1. 50mg/ L ;Na2Mo04 · 2H20 0· 025-0. 030mg/L ;ZnS04 · 7H20 0· 30-0. 50 ;
[0010] 生長(zhǎng)抑制劑：三碘苯甲酸（TIBA)6-8mg/L ;
[0011] 植物激素：2, 4-D 0· 6-0. 8mg/L
[0012] 其他：蔗糖 20-25g/L ;脂瓊 6· 0-6. 5g/L，pH 值 5· 5 ~6· 0。
[0013] 作為技術(shù)方案的進(jìn)一步優(yōu)選，木薯胚性愈傷組織離體保存培養(yǎng)基包括：
[0014] 大量元素：Ca(N03)2 · 2H20 230mg/L ;KC1 70mg/L ;ΚΗ2Ρ04 3 50mg/L ;
[0015] KN〇3 llOOmg/L ；MgS04 18mg/L ；NH4N03 llOOmg/L ；
[0016] 微量元素：CaCl2 · 6H20 0· 037mg/L ;CuS04 · 5H20 0· 037mg/L ;FeNaEDTA 38. 5mg/L ; H3B03 0 . 40mg/L；KI 0. 90mg/L ；MnS04 *H20 1. 25mg/L ；Na2Mo04 *2H20 0. 027mg/L ；ZnS04 *7H20 0. 40mg/L ；
[0017] 生長(zhǎng)抑制劑：三碘苯甲酸（TIBA)6mg/L-7mg/ ;
[0018] 植物激素：2, 4-D 0· 7mg/L ;
[0019] 其他：鹿糖 22g/L ;脂瓊 6. 5g/L ;水；pH 值 5· 8。
[0020] 本發(fā)明的培養(yǎng)基對(duì)木薯胚性愈傷組織離體保存條件為在13~17°C培養(yǎng)，光照度 1000 ~1200Lx，光照時(shí)間 16 ~18h/d。
[0021] 三碘苯甲酸（TIBA)是一種植物生長(zhǎng)延緩劑，具有很強(qiáng)的抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的生理活 性，其主要是通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的條件，使愈傷組織細(xì)胞吸水困難，減弱新陳代謝活動(dòng)，延緩 愈傷組織的細(xì)胞衰老，從而延長(zhǎng)繼代時(shí)間。
[0022] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明通過(guò)改良⑶培養(yǎng)基中添加一定濃度的生長(zhǎng)抑制劑進(jìn) 行木薯胚性愈傷組織離體保存，解決了其他培養(yǎng)基配方不適宜木薯胚性愈傷組織離體保存 的問(wèn)題，使用本發(fā)明的培養(yǎng)基可以提高木薯胚性愈傷組織的細(xì)胞活力，是對(duì)照（不添加生 長(zhǎng)抑制劑的培養(yǎng)基）的2~4倍，愈傷增殖量是對(duì)照（不添加生長(zhǎng)抑制劑的培養(yǎng)基）的 1. 0~1. 2倍，繼代保存時(shí)間延長(zhǎng)120d，是一種適宜的木薯愈傷組織中短期保存的方法。利 用本發(fā)明方法進(jìn)行木薯胚性愈傷組織離體保存，為木薯種質(zhì)資源保存提供基礎(chǔ)。
[0023] 采用本發(fā)明的培養(yǎng)基對(duì)木薯胚性愈傷組織進(jìn)行離體培養(yǎng)，保持了母體良好的性 狀，減免了遺傳變異的可能。 具體實(shí)施例
[0024] 實(shí)施例1
[0025] 配制改良⑶培養(yǎng)基，其中每升該培養(yǎng)基的組分及各組分的含量如下：
[0026] 1、大量元素：Ca(N03)2 · 2H20 230mg/L ;KC1 70mg/L ;KH2P04 3 50mg/L ;
[0027] KN03 llOOmg/L ；MgS04 18mg/L ；NH4N03 llOOmg/L ；
[0028] 2、微量元素：CaCl2 ·冊(cè)20 0· 〇37mg/L ;CuS04 ·冊(cè)20 0· 〇37mg/L ;FeNaEDTA 38· 5mg/ L ；H3B03 0. 40mg/L ；KI 0. 90mg/L ；MnS04 · H20 1. 25mg/L ；Na2Mo04 · 2Hz0 0. 027mg/L ； ZnS04 · 7H20 0. 40mg/L ；
[0029] 3、生長(zhǎng)抑制劑：TIBA6mg/L-8mg/ ;
[0030] 4、植物激素：2, 4-D 0· 7mg/L ;
[0031] 5、其他：鹿糖 22g/L ;脂瓊 6. 5g/L ;水；pH 值 5· 8
[0032] 6、培養(yǎng)基配制：按各組分含量分別添加，次序?yàn)榇罅吭匾晃⒘吭匾恢参锛に?-鹿糖一已經(jīng)煮沸的瓊脂和水的混合物一加水定容一調(diào)節(jié)pH值5. 8 -分裝至培養(yǎng)皿中并 密封好一高壓鍋滅菌溫度121°C 21分鐘。
[0033] 7、接種方法：在超凈工作臺(tái)上取已接至培養(yǎng)皿中的顆粒狀木薯胚性愈傷組織，將 其平均分成6堆共2. 0g接至已配制好并經(jīng)過(guò)高壓滅菌過(guò)的培養(yǎng)基中。接種完畢后放于恒 溫15°C，光照度1000~1200Lx，光照時(shí)間16h/d的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0034] 8、增殖過(guò)程：在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10d左右，開(kāi)始出現(xiàn)新的胚性愈傷組織，25d左 右達(dá)到增殖目的。
[0035] 9、離體保存試驗(yàn)
[0036] 9. 1試驗(yàn)設(shè)計(jì)：試驗(yàn)以改良⑶培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加生長(zhǎng)抑制劑TIBA或 2, 4-D激素，TIBA濃度分別為T(mén)IBA6mg/L、7mg/L、8mg/L，2, 4-D濃度為0· 7mg/L，以不添加生 長(zhǎng)抑制劑的GD培養(yǎng)基為CK。共得4種培養(yǎng)基，分別為：
[0037] (1)改良⑶培養(yǎng)基 +2, 4-DO. 7mg/L+TIBA6mg/L ;
[0038] (? 改良⑶培養(yǎng)基 +2, 4-DO. 7mg/L+TIBA7mg/L ;
[0039] (3)改良⑶培養(yǎng)基 +2, 4-DO. 7mg/L+TIBA8mg/L ;
[0040] (4)改良⑶培養(yǎng)基 +2, 4-DO. 7mg/L (CK)。
[0041] 接種方法，每個(gè)處理為9個(gè)培養(yǎng)皿，每皿接種2g，分別于40d、80d、120d后采用TTC 法測(cè)定細(xì)胞活力，并比較不同保存時(shí)間的愈傷組織生長(zhǎng)量。
[0042] 9. 2實(shí)施的結(jié)果對(duì)比
[0043] 從對(duì)比試驗(yàn)可知，采用添加生長(zhǎng)抑制劑三碘苯甲酸（TIBA)的⑶培養(yǎng)基