一種水生動物dna病毒檢測的基因芯片試劑盒及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于檢測水生動物DNA病毒的基因芯片，包括固相載體和固定在該固相載體上的水生動物DNA病毒分子信標(biāo)探針，所述分子信標(biāo)探針包括SEQIDNO.3-7的核苷酸序列，所述分子信標(biāo)探針SEQIDNO.3-7的核苷酸序列的5'端連接FAM熒光素，3'端連接Dabcyl猝滅基團(tuán)。本發(fā)明還涉及一種用于檢測水生動物DNA病毒的試劑盒及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明制備的水生動物DNA病毒的基因芯片及試劑盒，可以實現(xiàn)對所有感染水生動物的DNA病毒一次性快速檢測，靈敏性增強(qiáng)，減少了單個樣品的檢測費用。
【專利說明】—種水生動物DNA病毒檢測的基因芯片試劑盒及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】的基因芯片試劑盒，具體涉及一種水生動物DNA病毒檢測的基因芯片試劑盒及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]我國是一個養(yǎng)殖業(yè)大國，也是一個水生動物及其產(chǎn)品進(jìn)出口大國和消費大國，同時也是一個疫情疫病高發(fā)、頻發(fā)的國家。隨著可捕撈資源的急劇減少，水產(chǎn)養(yǎng)殖已成為我國為滿足人民群眾日益增長的蛋白質(zhì)需求而不得不采用的重要舉措。但病害損失嚴(yán)重制約著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展，養(yǎng)殖模式、生態(tài)環(huán)境變化以及病原體在多宿主間傳播均影響水生動物疫病的流行，由病毒引起的疾病對現(xiàn)代水產(chǎn)品養(yǎng)殖造成了極大的危害，由于國內(nèi)養(yǎng)殖方式高密度化，水生動物傳染性疾病就像懸在養(yǎng)殖戶頭上的利劍，時時刻刻威脅著我國的漁業(yè)發(fā)展。同時，隨著國際交往和國際貿(mào)易日趨頻繁，水生動物及其產(chǎn)品的進(jìn)出口貿(mào)易日漸增多，水生動物疫病傳染的風(fēng)險也隨之加劇。近年來我國參與國際貿(mào)易活動與日劇增，每天有大量的水產(chǎn)品通關(guān)，有力保障了國內(nèi)市場對海產(chǎn)品的需求、國內(nèi)養(yǎng)殖場的水產(chǎn)品供港和通往國際市場。因此，國家的各個口岸是重要水生動物疫病傳入和傳出的高風(fēng)險地區(qū)，水生動物疾病的檢驗檢疫工作在防控流行病的爆發(fā)中發(fā)揮重要作用。
[0003]目前，世界各國嚴(yán)重關(guān)注的感染魚類的病毒性傳染病主要有13種，其中雙鏈DNA病毒有6種，當(dāng)前，快速和同步檢出所有病毒是水生動物疫病檢測的迫切需求，由于病毒結(jié)構(gòu)的差異，這又是極具挑戰(zhàn)的課題，DNA病毒與RNA病毒結(jié)構(gòu)差異較大，如果同時檢測RNA病毒和DNA兩大類病毒的難 度也較大。但是，經(jīng)研究水生動物DNA病毒在DNA聚合酶基因的結(jié)構(gòu)上有一定共性，可以嘗試作為突破口，進(jìn)行DNA病毒檢測方法的革命。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測水生動物DNA病毒的基因芯片及試劑盒，以實現(xiàn)對所有感染水生動物的DNA病毒一次性快速檢測，靈敏性增強(qiáng)，減少了單個樣品的檢測費用。
[0005]為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下:
[0006]—種用于檢測水生動物DNA病毒的基因芯片,包括固相載體和固定在該固相載體上的水生動物DNA病毒分子信標(biāo)探針，所述分子信標(biāo)探針包括SEQ ID N0.3_7的核苷酸序列:
[0007]CCV-T:5’-CATCTCTCCTGAAACCATCGTGGACA-3’ (SEQ ID N0.3)
[0008]EHNV-T:5’-AGCTGGCTTACAAGGTGTCTGCCAAC-3’ (SEQ ID N0.4)
[0009]GFHNV:5’-CCA ACTCTCACTACGGCGTGAGCCAG-3’ (SEQ ID N0.5)
[0010]KHV-T:5’-TACAAGAACAAGGAGGTCGGCTGGGT-3’ (SEQ ID N0.6)
[0011]RSIV-T:5’-TATACGGGCGCGTATGTGTATGAGCC-3’ (SEQ ID N0.7)；[0012]所述分子信標(biāo)探針SEQ ID N0.3-7的核苷酸序列的5’端連接FAM熒光素，3’端連接Dabcyl粹滅基團(tuán)。
[0013]優(yōu)選的，所述分子信標(biāo)探針SEQ ID N0.3-7的核苷酸序列的5’端和3’端各連接一段互補(bǔ)的4核苷酸序列。
[0014]優(yōu)選的，所述固相載體為經(jīng)過醛基修飾的玻片。
[0015]一種用于檢測水生動物DNA病毒的基因芯片的制備方法，包括步驟:
[0016]a.對斑點叉尾鮰病毒、流行性造血器官壞死病病毒、金魚造血器官壞死病病毒、錦鯉皰疹病毒和真鯛虹彩病毒DNA聚合酶基因的同源性進(jìn)行比較，確定每種病毒雜交探針的選擇范圍，運(yùn)用Primer5.0軟件尋找所有可能的探針序列，篩選符合條件的探針序列，并運(yùn)用BLAST軟件分析探針的特異性，得到SEQ ID N0.3-7的核苷酸序列；
[0017]b.分別對SEQ ID N0.3-7的核苷酸序列的5’和3’端進(jìn)行修飾，獲得分子信標(biāo)探針，利用基因芯片點樣儀，將合成探針DNA分子點涂在經(jīng)過醛基修飾的玻片載體上，進(jìn)行封閉后即得所述水生動物DNA病毒基因芯片。
[0018]一種用于檢測水生動物DNA病毒的試劑盒，包括:
[0019]1.如權(quán)利要求1所述的檢測水生動物DNA病毒的基因芯片；
[0020]i1.PCR擴(kuò)增的引物，所述引物包括SEQ ID N0.1-2所述的核苷酸序列:
[0021]Forward primer:5' -GAYTTYGCNWSNYTNTAYCC-3' (SEQ ID N0.1)
[0022]Reverse primer:5' - TCNGTRTCNCCRTA-3' (SEQ ID N0.2)；
[0023]ii1.雜交液。
[0024]優(yōu)選的，所述引物核苷酸SEQ ID N0.1-2的5’均有熒光標(biāo)記。
[0025]用于檢測水生動物DNA病毒的試劑盒的應(yīng)用。
[0026]本發(fā)明根據(jù)水生動物疫病的病原DNA病毒的特點，發(fā)現(xiàn)所有水生動物DNA病毒的DNA聚合酶基因盡管差異較大，但是仍然具有的同源區(qū)片段，在這些同源區(qū)域設(shè)計引物可以通過PCR將所有這些病毒的DNA聚合酶基因得到擴(kuò)增，然后可以采用多重?zé)晒舛縋CR方法將各種病毒基因擴(kuò)增產(chǎn)物甄別，能夠檢測攜帶上述病原的水生動物疫病。與傳統(tǒng)PCR和普通熒光PCR相比檢測范圍得到擴(kuò)展，靈敏性增強(qiáng)，減少了單個樣品的檢測費用，通過單只反應(yīng)管可以對樣品是否含有上述五種病原情況作出判斷。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1為探針在芯片陣列中的排布不意圖，芯片整體布局為4X6方格,含合成的5種待檢樣品的DNA探針，含F(xiàn)AM和Cy5的內(nèi)參探針，用來矯正檢測信號的背景噪音，含有一個陰性對照，用來矯正檢測時的非特異性反應(yīng)，每個樣品有三個平行對照；
[0028]圖2為DNA樣品與分子信標(biāo)探針結(jié)合示意圖，分子信標(biāo)探針通過片基結(jié)合基團(tuán)鉚釘在芯片的片基上，當(dāng)待檢樣品中沒有目的DNA序列時，探針的生色基團(tuán)和猝滅基團(tuán)彼此靠近，生色基團(tuán)不能發(fā)出熒光信號。當(dāng)待檢樣品中含有能與探針匹配的DNA序列時，由于堿基互補(bǔ)配對，破壞了探針的莖部結(jié)構(gòu)，生色基團(tuán)和猝滅基團(tuán)由于空間位阻效應(yīng)，生色基團(tuán)發(fā)出可以檢測到的熒光；
[0029]圖3為試劑盒制備及使用流程示意圖；
[0030]圖4為520nm激發(fā)光下試劑盒檢測結(jié)果，圖中，I為GFHNV，2為RSIV-T，3為KHV-T，4為EHNV-T，5為CCV-T，經(jīng)檢測，樣品DNA呈陽性。
[0031]圖5為670nm激發(fā)光下試劑盒檢測結(jié)果，圖中，I為CCV-T，2為RSIV-T，3為KHV-T，4為EHNV-T，5為GFHNV，經(jīng)檢測，樣品DNA呈陽性。
【具體實施方式】
[0032]下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0033]實施例1:基因芯片的制備
[0034](一)分子信標(biāo)探針靶序列的選擇
[0035]對斑點叉尾鮰病毒DNA聚合酶靶基因序列(NCBI序列檢索號GenBank N0.:NC_001493.1)、流行性造血器官壞死病病毒DNA聚合酶靶基因序列(NCBI序列檢索號GenBank N0.:FJ433873.1)、金魚造血器官壞死病病毒DNA聚合酶靶基因序列(NCBI序列檢索號GenBank N0.: JQ815364.1 )、錦鯉皰疹病毒DNA聚合酶靶基因序列(NCBI序列檢索號GenBank N0.:AY939862.1)和真鯛虹彩病毒DNA聚合酶靶基因序列(NCBI序列檢索號GenBank N0.:AB007366.1)基因的同源性進(jìn)行比較，確定每種病毒雜交探針的選擇范圍，運(yùn)用Primerf.0軟件尋找所有可能的探針序列，篩選符合條件的探針序列，并運(yùn)用BLAST軟件分析探針的特異性。獲得分子信標(biāo)探針靶序列SEQ ID N0.3-7。
[0036](二)分子信標(biāo)探針的合成及其結(jié)構(gòu)
[0037]分別在分子信標(biāo)探針靶序列SEQ ID N0.3_7的5’端連接FAM熒光素，3’端連接Dabcyl猝滅基團(tuán)，獲得如下表1`分子信標(biāo)探針序列:
[0038]表1、SEQ ID N0.3-7修飾后的分子信標(biāo)探針序列
[0039]
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測水生動物DNA病毒的基因芯片，包括固相載體和固定在該固相載體上的水生動物DNA病毒分子信標(biāo)探針，其特征在于，所述分子信標(biāo)探針包括SEQ ID N0.3_7的核苷酸序列:
CCV-T:5’-CATCTCTCCTGAAACCATCGTGGACA-3’ (SEQ ID N0.3)
EHNV-T:5’-AGCTGGCTTACAAGGTGTCTGCCAAC-3’ (SEQ ID N0.4)
GFHNV:5’-CCAACTCTCACTACGGCGTGAGCCAG-3’ (SEQ ID N0.5)
KHV-T:5’-TACAAGAACAAGGAGGTCGGCTGGGT-3’ (SEQ ID N0.6)
RSIV-T:5’-TATACGGGCGCGTATGTGTATGAGCC-3’ (SEQ IDN0.7)； 所述分子信標(biāo)探針SEQ ID N0.3-7的核苷酸序列的5’端連接FAM熒光素，3’端連接Dabcyl粹滅基團(tuán)。
2.如權(quán)利要求1所述的用于檢測水生動物DNA病毒的基因芯片，其特征在于，所述分子信標(biāo)探針SEQ ID N0.3-7的核苷酸序列的5’端和3’端各連接一段互補(bǔ)的4核苷酸序列。
3.如權(quán)利要求1所述的用于檢測水生動物DNA病毒的基因芯片，其特征在于，所述固相載體為經(jīng)過醛基修飾的玻片。
4.權(quán)利要求1-3任一項所述的用于檢測水生動物DNA病毒的基因芯片的制備方法，包括步驟: a.對斑點叉尾鮰病毒、流行性造血器官壞死病病毒、金魚造血器官壞死病病毒、錦鯉皰疹病毒和真鯛虹彩病毒DNA聚合酶基因的同源性進(jìn)行比較，確定每種病毒雜交探針的選擇范圍，運(yùn)用Primer5.0軟件尋找所有可能的探針序列，篩選符合條件的探針序列，并運(yùn)用BLAST軟件分析探針的特異性，得到SEQ ID N0.3-7的核苷酸序列； b.分別對SEQID N0.3-7的核苷酸序列的5’和3’端進(jìn)行修飾，獲得分子信標(biāo)探針，利用基因芯片點樣儀，將合成探針DNA分子點涂在經(jīng)過醛基修飾的玻片載體上，進(jìn)行封閉后即得所述水生動物DNA病毒基因芯片。
5.一種用于檢測水生動物DNA病毒的試劑盒，其特征在于，包括: 1.如權(quán)利要求1所述的檢測水生動物DNA病毒的基因芯片； i1.PCR擴(kuò)增的引物，所述引物包括SEQ ID N0.1_2所述的核苷酸序列:
Forward primer:5' -GAYTTYGCNWSNYTNTAYCC-3' (SEQ ID N0.1)
Reverse primer:5’-TCNGTRTCNCCRTA-3’ (SEQ ID N0.2)； ii1.雜交液。
6.如權(quán)利要求5所述的用于檢測水生動物DNA病毒的試劑盒，其特征在于，所述引物核苷酸SEQ ID N0.1-2的5’均有熒光標(biāo)記。
7.權(quán)利要求5或6所述的用于檢測水生動物DNA病毒的試劑盒的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/70GK103757133SQ201410002015
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月1日
【發(fā)明者】蘭文升, 劉葒, 王津津, 史秀杰, 鄭曉聰, 賈鵬, 于力, 何俊強(qiáng), 黃佳鳴 申請人:深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術(shù)中心