科羅索酸的生物催化合成方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種科羅索酸的生物催化合成方法，包括將底物烏蘇酸和微生物酶催化劑在適當培養(yǎng)基及適當?shù)臈l件下共培養(yǎng)發(fā)酵，經(jīng)分離純化得到科羅索酸，其中所述微生物酶催化劑為菌株Streptomyces?griseus?subsp.griseus；反應式為：<img file="DDA0000453715520000011.TIF" wi="1504" he="502" />與目前已公開的技術相比，本發(fā)明方法采用的原料及催化劑便宜、易得，反應條件溫和、易控，環(huán)境友好、無污染，能很好地滿足綠色化學和可持續(xù)發(fā)展化學的發(fā)展，及其對現(xiàn)代環(huán)境保護和低碳經(jīng)濟的需求。
【專利說明】科羅索酸的生物催化合成方法
【技術領域】 [0001]本發(fā)明屬于制藥領域，涉及科羅索酸(Corosolic acid, CAS N0.為4547-24-4)的生物催化合成方法；科羅索酸為一種降血糖藥物。
【背景技術】
[0002]糖尿病是全球前五大致死疾病，MS預計未來10-20年糖尿病患病人數(shù)將居所有疾病之首，尤其是亞洲地區(qū)，糖尿病患者人數(shù)和復合增速將快速上升。來自最新的全球糖尿病患病報告顯示，2011年，全球糖尿病患者達到3.66億人，預計2030將達到5.52億人。更令人擔憂的是，我國近十年來糖尿病患病率增長迅猛，患病人數(shù)逼近I億大關。MS預測到2020年中國糖尿病患者人數(shù)將高達1.5億，為全球糖尿病患者最多的國家，糖尿病及其并發(fā)癥正在給社會帶來沉重負擔。2010年全球糖尿病藥物市場規(guī)模高達344.3億，近五年復合增長率為12.7%，顯著高于其他疾病用藥市場同期增速。
[0003]科羅索酸(corosolic acid)是存在于大葉紫薇、枇杷、對萼獼猴桃等植物中的一種三萜類天然產(chǎn)物。研究發(fā)現(xiàn)，科羅索酸具有抗炎、降血糖、降血脂和抗癌等多種生物活性，其中，人們最為關注的是科羅索酸的降血糖的功能。體內外實驗結果表明，科羅索酸通過增加葡萄糖的轉運，促進細胞對葡萄糖的吸收和利用，從而實現(xiàn)降血糖功效?？屏_索酸對葡萄糖轉運的增加作用類似于胰島素，因此，科羅索酸也被稱為“植物胰島素”(phyto-1nsulin或botanical insulin)。據(jù)報道，科羅索酸對正常大鼠和遺傳性糖尿病小鼠均有顯著的降血糖作用?？屏_索酸還有減肥作用，臨床研究發(fā)現(xiàn)服用該藥后能夠調節(jié)體內胰島素和血糖含量，具有明顯的減肥趨勢(月平均減重0.908-1.816kg)，該過程比較緩且無需節(jié)食。目前，該天然產(chǎn)物已在美國作為營養(yǎng)補充劑上市，同時進行治療糖尿病的三期臨床試驗，近期將通過FDA認證。其用于治療糖尿病的作用效果與注射胰島素相比較，具有口服效果顯著、毒副作用小、使用方便等優(yōu)點，作用效果與注射胰島素相當?？屏_索酸作為純天然植物活性成分，既可以作為降血糖保健品，也可作為降血糖藥物對抗糖尿病和肥胖癥進行治療。
[0004]目前科羅索酸的制備方法主要有以下幾種:一種是從植物中提取，由于科羅索酸在植物中的含量很低，含量最高的當屬大葉紫薇葉子，其熱水濃縮提取物中，科羅索酸的含量僅為0.01%左右，而在大葉紫薇葉子的醇提取的濃縮物中，科羅索酸的含量也僅為1%左右。美國研究學者通過改進方法從植物大葉紫薇葉子和枇杷葉子中分別制備了科羅索酸并分別申請了專利。在植物體內，科羅索酸常常與其同分異構體山楂酸共同存在，二者的結構和化學性質均相似，所以給分離、純化帶來很大困難。這也是從植物中提取科羅索酸不能滿足當前市場和研究需要的主要原因。第二種方法是用有機合成方法來合成科羅索酸。孫宏斌等采用化學法合成了科羅索酸。將3-羰基熊果酸酯經(jīng)硫酸、濃鹽酸、磷酸、高氯酸等酸催化的烯醇化酯化反應制得2-烯-3-乙酰氧基熊果酸酯，將2-烯-3-乙酰氧基熊果酸酯經(jīng)硼氫化氧化反應分別制得科羅索酸酯；科羅索酸酯經(jīng)催化氫解反應或采用碘化鋰進行鹵解反應分別制得科羅索酸。可見化學合成方法步驟比較繁瑣，條件苛刻，所以限制了化學合成法的廣泛應用。此外，2012年Kim等人還首次利用植物細胞的懸浮培養(yǎng)物來制備科羅索酸。相對于從植物中提取和化學合成法，此方法相對簡單，但是該方法的產(chǎn)率低、產(chǎn)量不穩(wěn)定，篩選并確立植物懸浮細胞系是一項非常費時的過程，這些都限制了此方法的進一步推廣。
[0005]然而，科羅索酸作為防治II型糖尿病和肥胖癥的植物新藥和功能性天然保健食品醫(yī)藥原料，已經(jīng)成為市場的熱門產(chǎn)品，產(chǎn)品供不應求。但是目前的制備方法都因為其方法本身的缺點限制了其進一步推廣和應用。因此，探索科羅索酸的高效、經(jīng)濟的合成新方法是一個凾待解決的關鍵科學問題，尋求科羅索酸的高效、經(jīng)濟的制備方法迫在眉睫。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種新型、經(jīng)濟、簡便、符合綠色化生產(chǎn)科羅索酸的生物催化合成方法。
[0007]基于以上目的，本發(fā)明選擇自然界廉價、易得的天然產(chǎn)物烏蘇酸(又稱熊果酸)為底物，采用條件溫和、環(huán)境友好、立體選擇性和區(qū)域選擇性都很強的微生物酶為催化劑，采用生物催化方法只需一步反應即可制備科羅索酸。
[0008]一方面，本發(fā)明提供了一種科羅索酸的生物催化合成方法，包括將烏蘇酸和微生物酶催化劑在適當培養(yǎng)基及適當?shù)臈l件下共培養(yǎng)發(fā)酵，經(jīng)分離純化得到科羅索酸，其中所述微生物酶催化劑為菌株Streptomyces griseus subsp.griseus ;反應式為:
[0009]
【權利要求】
1.一種科羅索酸的生物催化合成方法，包括將底物烏蘇酸和微生物酶催化劑在適當培養(yǎng)基及適當?shù)臈l件下共培養(yǎng)發(fā)酵，經(jīng)分離純化得到科羅索酸，其中所述微生物酶催化劑為菌株 Streptomyces griseus subsp.griseus ;反應式為:
2.如權利要求1所述生物催化合成方法，其特征在于，所述菌株Streptomycesgriseus subsp.griseus在中國普通微生物菌種保藏管理中心的保藏號為CGMCC4.18。
3.如權利要求1所述生物催化合成方法，其特征在于，所述適當培養(yǎng)基選自YM培養(yǎng)基。
4.如權利要求3所述生物催化合成方法，其特征在于，所述YM培養(yǎng)基通過以下步驟制得:按照1000mL算，加酵母提取物3.0-6.0g,優(yōu)選4.0g ;麥芽提取物5.0-20.0g,優(yōu)選10.0g ;葡萄糖 4.0-10.0g,優(yōu)選 4.0g ;調節(jié) ρΗ6.5-8.0,優(yōu)選 7.3 ;在 121±5°C，高溫滅菌20_30min。
5.如權利要求1所述生物催化合成方法，其特征在于，溶解所述底物的溶劑為:無水乙醇、丙酮、甲醇、DMS0，以及混合溶劑；優(yōu)選體積比為1:1的無水乙醇:二甲亞砜混合溶劑。
6.如權利要求1所述生物催化合成方法，其特征在于，所述微生物菌株培養(yǎng)及催化反應溫度為25-37°C，優(yōu)選28°C。
7.如權利要求1所述生物催化合成方法，其特征在于，所述底物濃度0.2-5mg/mL，優(yōu)選0.5-1.5mg/mL。
8.如權利要求1所述生物催化合成方法，其特征在于，所述發(fā)酵時間5-10天。
9.如權利要求1所述生物催化合成方法，其特征在于，所述發(fā)酵規(guī)模為5mL至2000mL。
10.如權利要求1所述生物催化合成方法，其特征在于，所述分離純化選自硅膠柱色譜、凝膠色譜及重結晶中的一種或多種結合。
【文檔編號】C12R1/545GK103725743SQ201410006092
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2014年1月6日 優(yōu)先權日:2014年1月6日
【發(fā)明者】付少彬, 孫迪安, 孟慶峰, 趙長闊 申請人:遵義醫(yī)學院