與植物脂肪酸和油脂代謝相關(guān)的油菜轉(zhuǎn)錄因子BnFUS3及其編碼基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及與植物脂肪酸和油脂代謝相關(guān)的油菜轉(zhuǎn)錄因子 BnFUS3及其編碼基因與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物中的脂肪酸又被稱為植物油，它廣泛存在于植物的種子中。植物油用途廣泛， 運(yùn)用生物技術(shù)改良植物體內(nèi)脂肪酸的組分和含量具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。其中，遺傳工程技 術(shù)所選用的操作基因必需是植物體內(nèi)脂肪酸生物合成過(guò)程中的關(guān)鍵基因，但是目前人們對(duì) 于植物脂肪酸生物合成的分子調(diào)控機(jī)制還不甚了解，因此，利用遺傳工程技術(shù)提高油料作 物含油量的工作目前進(jìn)展緩慢。以雙子葉模式植物擬南芥為例，植物的胚胎發(fā)生主要分為 兩個(gè)階段：早期形態(tài)發(fā)生過(guò)程和晚期成熟過(guò)程。整個(gè)胚胎發(fā)育過(guò)程中伴隨著淀粉、蛋白質(zhì) 和脂肪酸等貯藏物質(zhì)的積累。在胚胎發(fā)育早期，主要是淀粉的大量積累，在組織和器官形成 以后，淀粉被轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)和脂肪酸。在發(fā)育的種子中，碳水化合物通過(guò)糖酵解途徑被分解 成磷酸稀醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP)，PEP被運(yùn)輸?shù)劫|(zhì)體后再轉(zhuǎn)化成丙酮酸 和乙酰CoA，乙酰CoA作為底物參與脂肪酸的合成（見(jiàn)Sari A. Ruuska等，2002, The Plant Cell，Vol. 14,1191-1206)〇
[0003] 近十余年來(lái)，科學(xué)家們對(duì)利用遺傳工程技術(shù)提高植物體內(nèi)，特別是種子中的脂 肪酸含量進(jìn)行了各種有益的探索。Shintani等在煙草中過(guò)量表達(dá)了 ACCase的一個(gè)亞 基-生物素羧化酶（BC亞基），在煙草葉片中BC的表達(dá)水平提高了 3倍，其它三個(gè)亞基 的表達(dá)水平?jīng)]有發(fā)生明顯變化，但脂肪酸的含量和組成也沒(méi)有明顯改變（見(jiàn)Shintani D.等，1997, Plant Physiology, Vol. 114, 881-886)。另一項(xiàng)研宄表明，增加丙酰 CoA 的含 量能夠提高脂肪酸的含量。Roeseler等利用種子特異性表達(dá)啟動(dòng)子在油菜中過(guò)量表達(dá)擬南 芥中的HO-ACCase基因，結(jié)果使ACCase的活性明顯提高，種子中的含油量提高3-5% (見(jiàn) Roesler K.等，1997, Plant Physiology, Vol. 113, 75-81)。Roeseler 等的研宄結(jié)果表明， 丙酰CoA水平能夠提高脂肪酸的含量，但提高幅度較小。Dechesh等將菠菜的KASIII基因 在煙草中過(guò)量表達(dá)，結(jié)果使KASIII的酶活性提高了 100-300倍，但脂肪酸的含量卻降低了 5-10% (見(jiàn) Dehesh 等，2001，Plant Physiology, Vol. ,125, 1103-1114)。上述研宄結(jié)果表 明，植物體內(nèi)的脂肪酸代謝是一個(gè)復(fù)雜和高度協(xié)調(diào)的過(guò)程，通過(guò)對(duì)脂肪酸代謝途徑中的個(gè) 別或單個(gè)基因進(jìn)行遺傳操作并不能夠有效地改變脂肪酸的含量。因此，Girke等人預(yù)言在 脂肪酸的代謝過(guò)程中，很可能存在一種蛋白激酶或其它調(diào)控因子（例如轉(zhuǎn)錄因子）在起調(diào) 控作用（見(jiàn) Girke, T.等，2000, Plant Physiology, Vol. 124, 1570-1581.) 〇
[0004] 油菜與擬南芥同屬十字花科，種子儲(chǔ)存物主要是蛋白和油脂。在擬南芥種子中，儲(chǔ) 存蛋白（SSP蛋白）有兩大類：12S球蛋白和2S白蛋白。SSP蛋白由基因家族編碼：12S蛋 白由CRU1/CRA1、CRB、CRU2和CRU3/CRC基因編碼，2S清蛋白由At2Sl~At2S5基因編碼 (Guerche P.等，1990, The Plant cell, Vol. 2, 469-478 ;Mendes A.等，2013, The Plant cell, Vol. 25, 3104-3116)。在atfus3突變體的種子中，這些貯藏蛋白基因的表達(dá)水平大 大降低（Keith K.等，1994, The Plant cell, Vol. 6, 589-600 ;MeinkeD.W.等，1994, The Plant cell, Vol. 6, 1049-1064)。多種實(shí)驗(yàn)方法已證明AtFUS3與AtSSP基因啟動(dòng)子上的 RYnotif 序列結(jié)合（CATGCA) (Ezcurra I.等，2000, The Plant Journal, Vol. 24, 57-66)。 當(dāng)AtFUS3異位表達(dá)時(shí)，AtSSP基因在幼苗組織中也能表達(dá)，但此過(guò)程完全或部分依賴ΑΒΑ。 另外，雖然AtFUS3蛋白能直接結(jié)合到AtSSP基因的啟動(dòng)子，但是需要由AtFUS3誘導(dǎo)表達(dá)的 次級(jí)調(diào)節(jié)因子的協(xié)助（Kagaya Y.等，2005, Plant&cell physiology, Vol. 46, 399-406)。
[0005] 雖然AtFUS3基因調(diào)控種子蛋白合成的機(jī)制較為清楚，但是由于油脂合成過(guò) 程的復(fù)雜性，對(duì)于AtFUS3基因調(diào)控油脂合成的機(jī)制仍然模糊。鑒于油脂積累和儲(chǔ)藏 蛋白的合成是種子成熟期的主要事件，atfus3突變體種子含油量顯著降低。擬南芥幼 苗中異位表達(dá)AtFUS3芯片數(shù)據(jù)表明，被AtFUS3激活轉(zhuǎn)錄的基因，不僅有參與初級(jí)代 謝的基因，包括參與脂類代謝和光合作用基因，也有參與次級(jí)代謝的基因 （Tiedemann 等，2008, Developmental biology，Vol.317，l-12;Yamamoto 等，2010, Plant and cell physiology, Vol, 51，2031-2046)。然而，這種誘導(dǎo)能否提高植物體油脂含量不得而知。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供與植物脂肪酸和油脂代謝相關(guān)的油菜 轉(zhuǎn)錄因子BnFUS3。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供該轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因。
[0008] 本發(fā)明的又一目的是提供該轉(zhuǎn)錄因子、編碼基因的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明的目的可通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0010] 與植物脂肪酸和油脂代謝相關(guān)的油菜轉(zhuǎn)錄因子BnFUS3,選自如下1)或2)所述的 蛋白質(zhì)：
[0011] 1)由SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，其中自氨基端第93-195位氨 基酸殘基為B3結(jié)構(gòu)域；SEQ ID NO: 1由308個(gè)氨基酸殘基組成，自氨基端（N端）第93-195 位氨基酸殘基為B3結(jié)構(gòu)域。
[0012] 2)將SEQ ID NO. 1的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)1~10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加且與種子脂肪酸合成相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。
[0013] 所述取代和/或缺失和/或添加的一至幾個(gè)氨基酸殘基優(yōu)選1-10個(gè)氨基酸殘基， 可以是非結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基，其改變不會(huì)對(duì)該蛋白的功能產(chǎn)生影響。
[0014] 為了使1)中的BnFUS3蛋白便于純化，可在由SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列組 成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。
[0015] 表1.標(biāo)簽的序列
[0016]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 與植物脂肪酸和油脂代謝相關(guān)的油菜轉(zhuǎn)錄因子BnFUS3,其特征在于選自如下1)或 2)所述的蛋白質(zhì)： 1) 由SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，其中自氨基端第93-195位氨基酸 殘基為B3結(jié)構(gòu)域； 2) 將SEQ ID NO. 1的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)1~10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和 /或添加且與種子脂肪酸合成相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的油菜轉(zhuǎn)錄因子BnFUS3,其特征在于所述的1~10個(gè)氨基酸 殘基的取代和/或缺失和/或添加的為非B3結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基，其改變不影響該蛋白 的功能。
3. 權(quán)利要求1所述的油菜轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因BnFUS3。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的編碼基因BnFUS3,其特征在于選自1)-4)中任一所述的基 因： 1. SEQ ID NO. 2的自Y末端第52-978位脫氧核糖核苷酸所示基因； 2. SEQ ID NO. 2所示基因； 3) 在嚴(yán)格條件下與與1)或2)的基因雜交且編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因； 4) 與1)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的編碼基因BnFUS3,其特征在于3)或4)所述的基因如SEQ ID NO. 3所示。
6. 含有權(quán)利要求3~5中任一項(xiàng)所述的編碼基因BnFUS3的重組誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的所述的重組誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，其特征在于所述的重組誘導(dǎo)表達(dá) 系統(tǒng)為將權(quán)利要求3所述的基因插入XVE誘導(dǎo)表達(dá)載體的Xhol/Spel酶切位點(diǎn)所得。
8. 權(quán)利要求1所述的油菜轉(zhuǎn)錄因子BnFUS3、權(quán)利要求3所述的編碼基因BnFUS3、權(quán)利 要求5所述的重組誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)在培育高含油量植物中的應(yīng)用。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于：所述所述的植物選自雙子葉植物或單子 葉植物；所述的雙子葉植物優(yōu)選擬南芥、油菜、花生、棉花、大豆、向日葵、棕櫚樹(shù)、橄欖樹(shù)、蓖 麻、馬鈴薯或煙草；所述單子葉植物選優(yōu)水稻、玉米、小麥、大麥、燕麥、黑麥、高梁或草坪草。
10. -種培育高含油量的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征在于將權(quán)利要求3所述的的編碼 基因BnFUS3利用權(quán)利要求6所述的重組誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)入目的植物中，所得到的轉(zhuǎn)基因植 物種子通過(guò)誘導(dǎo)能顯著提高轉(zhuǎn)基因植物幼苗中脂肪酸的含量。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了與植物脂肪酸和油脂代謝相關(guān)的油菜轉(zhuǎn)錄因子BnFUS3及其編碼基因與應(yīng)用。與植物脂肪酸和油脂代謝相關(guān)的油菜轉(zhuǎn)錄因子BnFUS3氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其編碼基因如SEQ ID NO.2或3所示。本發(fā)明保護(hù)的基因BnFUS3誘導(dǎo)表達(dá)后可以提高植物體的含油量。轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明基因能顯著提高植物體的油含量，為轉(zhuǎn)基因方法提高植物體的脂肪酸含量提供一條行之有效的途徑。這對(duì)提高植物(特別是油料作物)的脂肪酸含量及相關(guān)性狀的改良具有重要的理論及實(shí)際意義，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用和市場(chǎng)前景。
【IPC分類】C12N15-29, A01H5-00, C12N15-82, C07K14-415
【公開(kāi)號(hào)】CN104877021
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510296964
【發(fā)明人】譚河林, 向小娥
【申請(qǐng)人】南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年9月2日
【申請(qǐng)日】2015年6月2日