一種檢測柯薩奇病毒a2、a5型的熒光定量試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種檢測柯薩奇病毒A2、A5型的熒光定量試劑盒，由定量RT-PCR反應(yīng)液、酶混合液、引物探針混合液、CVA2和CVA5標(biāo)準(zhǔn)品、CVA2和CVA5強陽性對照品、CVA2和CVA5弱陽性對照品、陰性對照品組成。本發(fā)明運用一步法實時熒光定量RT-PCR技術(shù)，采用CVA2、CVA5高度特異的引物和熒光標(biāo)記探針，從糞便標(biāo)本中同時檢測出是否有CVA2、CVA5的存在，比單重?zé)晒舛縋CR方法更便捷迅速、節(jié)約成本。檢測實時、準(zhǔn)確定量，為臨床提供早期診斷，為臨床治療方案的制定提供參考依據(jù)；可應(yīng)用于柯薩奇病毒A2、A5型引起暴發(fā)疫情的實驗室應(yīng)急診斷、快速篩查、臨床診斷及手足口病的流行病學(xué)的研究。
【專利說明】一種檢測柯薩奇病毒A2、A5型的熒光定量試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，具體涉及一種一步法雙重實時突光定量RT-PCR在同一個反應(yīng)管內(nèi)檢測患者糞便標(biāo)本中柯薩奇病毒A2、A5型的核酸檢測方法，可應(yīng)用于柯薩奇病毒A2、A5型引起暴發(fā)疫情的實驗室應(yīng)急診斷、快速篩查、臨床診斷及手足口病的流行病學(xué)的研究。
【背景技術(shù)】
[0002]手足口病(hand,footand mouth disease,HFM))是由人類腸道病毒(human enterovirus,HEV)引起的，以手、足、口、臀部出現(xiàn)皮疹癥狀為主要臨床癥狀的常見傳染病，主要以輕癥為主,但重癥及死亡病例也時有報道。人類腸道病毒分為A、B、C、D 4個組，目前共有90多種基因型，其中最主要的病原體是HEV-A組中的腸道病毒71型(EV71)和柯薩奇病毒A16型(Coxsackie virus A16，CVA16)。但越來越多的研究表明，HEV中的一些其他血清型，如CVA6、CVAlO, CVA2、CVA5 型等也可引起 HFMD。
[0003]導(dǎo)致手足口疾病的致病病原的變異變遷必須引起足夠的重視。比如，近年來在歐洲及我國周邊部分國家爆發(fā)的手足口病疫情中，柯薩奇病毒A6型等已經(jīng)替代EV71和CVA16被作為主要致病病原體檢出。2010年，臺灣地區(qū)的手足口致病病原調(diào)查中，柯薩奇病毒A2型和柯薩奇病毒A5型有一定比例的檢出。2012年，香港地區(qū)報道2例柯薩奇病毒A2型引起的兒童死亡。而近年來，在我國的廣東深圳和山東臨沂等地區(qū)的手足口病原中也有柯薩奇病毒A2型和柯薩奇病毒A5型檢出的報道。在我們實驗室開展的2013年部分月份手足口病原調(diào)查中，柯薩奇病毒A2型和A5型也占到了一定的比例。目前我國的手足口病病原診斷市場，仍然以檢測腸道病毒通用型或腸道病毒71型和柯薩奇病毒A16型為主，導(dǎo)致手足口病病原體檢測不明確或漏檢等，造成患者治療的延誤及診斷試劑的浪費等。因而開發(fā)一種針對柯薩奇病毒A2型和柯薩奇病毒A5型病原檢測的診斷試劑對明確致病病原有極大的幫助。
[0004]實時熒光定量PCR技術(shù)以其全封閉單管擴增、簡便快捷、重復(fù)性好、實時定量、污染少等優(yōu)勢，克服了以往臨床診斷的缺陷，具有高度的特異性和敏感性，為臨床診斷提供了準(zhǔn)確可靠的實驗室依據(jù)，可作為一種臨床病原診斷的有效、快速的檢測手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種檢測柯薩奇病毒A2、A5型的熒光定量試劑盒，是一種用柯薩奇病毒A2型和柯薩奇病毒A5型檢測的一步法雙重?zé)晒舛縍T-PCR檢測試劑盒。本試劑盒包含定量RT-PCR反應(yīng)液、酶混合液、引物探針混合液、標(biāo)準(zhǔn)品(CVA2、CVA5)、強陽性對照品(CVA2、CVA5 )、弱陽性對照品(CVA2、CVA5 )、陰性對照品。
[0006]其中定量RT-PCR反應(yīng)液包含有PCR反應(yīng)緩沖液(含氯化鎂和三磷酸脫氧核糖核苷酸混合物等)，酶混合液含耐 熱Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制劑和MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶，引物探針混合液包含CVA2、CVA5兩組引物和相應(yīng)的CVA2、CVA5兩種不同熒光標(biāo)記的探針，陰性對照為高溫高壓滅菌的DEPC(焦碳酸二乙酯)處理水，CVA2、CVA5強陽性對照品和CVA2、CVA5弱陽性對照品為包含CVA2、CVA5的保守區(qū)基因序列的陽性質(zhì)粒樣品。
[0007]引物探針混合液需保存于棕色管。
[0008]雙重?zé)晒舛縍T-PCR檢測用上游引物和下游引物以及相應(yīng)的特異性探針序列如下:
上游引物 CVA2-F: 5 ’ - AGTCGRCCAGTGTCTCAYTCA-3，，
下游引物 CVA2-R:5’ -TACACGCCCRGTCTCAATGG-3’，
特異性探針 CVA2-P: 5’ -FAM- AACAGCTGCWAACACCCAGGTRAGCC-BHQ1-3’，
上游引物 CVA5-F: 5 ’ _ AAGCGGCGGAGACAGGAG-3，，
下游引物 CVA5-R: 5’- CCATGCCTGTTGACCACACA-3’，
特異性探針 CVA5-P: 5’-HEX- CAAAYGCCACCGAYGARAGCATGA-BHQ1-3’，
其中CVA2、CVA5的特異性探針分別采用FAM、HEX兩種不同熒光標(biāo)記。
[0009]上述CVA2、CVA5標(biāo)準(zhǔn)品的保守區(qū)基因序列如下:
CVA2標(biāo)準(zhǔn)品序列 為:
AATGCTACGATAGACAGGGTGTTGAGTCGGCCAGTGTCTCATTCACCAACAGCTGCTAACACCCAGGTGAGCCAGCACTCCATTGAGACTGGGCGTGTACCTGCACTACAAGCTGCTGAAACG ；
CVA5標(biāo)準(zhǔn)品序列為:
ACAGGGCAGGTACCAGCTCTGCAAGCGGCGGAGACAGGAGCGACCTCAAACGCCACCGATGAAAGCATGATTG
AAACCAGGTGTGTGGTCAACAGGCATGGGGTTATGGAAACAAGTGTTGAGo
[0010]本發(fā)明提供的熒光定量試劑盒需于-20°c儲存，盡量減少反復(fù)凍融；引物探針混合液需避光條件保存。
[0011]本發(fā)明的另一個目的是提供上述的一步法雙重?zé)晒舛縍T-PCR檢測試劑盒，應(yīng)用于柯薩奇病毒A2型和柯薩奇病毒A5型的核酸檢測。
[0012]本發(fā)明試劑盒的使用方法:在每次標(biāo)本檢測中均應(yīng)設(shè)立陽性對照和陰性對照。標(biāo)準(zhǔn)品用 TaKaRa 公司的 Easy Dilution (貨號:9160)稀釋為 I X IO2-1 X 107copies/ml。
[0013]糞便樣本核酸的提取:取約0.2g糞便樣本加到EP管中，加入1.5ml的生理鹽水，震蕩混勻3次，每次10s，然后室溫靜置lOmin，以8000r/min離心5min。吸取200 ml上清加入到EP管中，進行核酸提取。核酸提取采用Geneaid公司的Viral Nucleic Acidextraction KitII 或 QIAGEN 公司的 QIAamp Viral RNA Mini Kit,按照試劑盒說明書進行提取，取5ul已抽提的待測樣品核酸作為模板。
[0014]核酸的檢測:取5ul已抽提的待測樣品核酸作為模板。反應(yīng)總體積為2。μ?其中定量RT-PCR反應(yīng)液12.5μ1酶混合液I μ?，引物探針混合液(20 μ mol/Ι，包含兩組特異性引物和相應(yīng)的兩種熒光探針)共3 μι模板9 μ?加水補足至25 μ?在ΑΒΙ7500熒光定量PCR儀(或者其他雙色熒光及以上的PCR儀)上進行檢測，反應(yīng)參數(shù)為:反轉(zhuǎn)錄50°C，30min ；95°C5min熱啟動，然后95°C 15s，55°C 45s，在55°C進行雙重?zé)晒鈾z測，共進行40個循環(huán)。
[0015]突光定量結(jié)果報告:①柯薩奇病毒A2型、柯薩奇病毒A5型檢測的各自Ct值對應(yīng)相應(yīng)的熒光標(biāo)記的病毒，檢測樣本Ct值為40、0和無數(shù)值時，報告為陰性。②檢測樣本Ct值< 35時,報告為相應(yīng)病毒陽性。③檢測樣本Ct值> 35且小于40的樣本,建議復(fù)檢,復(fù)檢結(jié)果(^值< 38者，依據(jù)②的判斷標(biāo)準(zhǔn)報告為相應(yīng)病毒陽性。根據(jù)所獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算待測標(biāo)本柯薩奇病毒A2型或者柯薩奇病毒A5型的病毒量(copies/ml)。
[0016]本研究針對柯薩奇病毒高度保守且型間存在較大差異的VPl蛋白分別設(shè)計柯薩奇病毒A2型和柯薩奇病毒A5型高特異性的引物探針。采用單管一步法雙重實時熒光定量RT-PCR，能夠單管內(nèi)一次反應(yīng)同時檢測出柯薩奇病毒A2型或/和柯薩奇病毒A5型，不僅極大的節(jié)省了試劑耗材，縮短了檢測時間，并且依然具有極高的特異性和靈敏性。
[0017]本發(fā)明運用一步法實時熒光定量RT-PCR技術(shù)，采用柯薩奇病毒A2型和柯薩奇病毒A5型高度特異的引物和熒光標(biāo)記探針，研制用于柯薩奇病毒A2型和柯薩奇病毒A5型檢測的雙重?zé)晒舛縍T-PCR檢測試劑盒。該發(fā)明是通過一個PCR反應(yīng)，可以從糞便標(biāo)本中同時檢測出是否有柯薩奇病毒A2型和柯薩奇病毒A5型的存在，比單重?zé)晒舛縋CR方法更便捷迅速、節(jié)約成本。同時，對檢測的病毒進行實時準(zhǔn)確定量，根據(jù)病毒感染的滴度，為臨床上患者提供早期診斷，為臨床治療方案的制定提供參考依據(jù)；可應(yīng)用于柯薩奇病毒A2、A5型引起暴發(fā)疫情的實驗室應(yīng)急診斷、快速篩查、臨床診斷及手足口病的流行病學(xué)的研究。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為本試劑盒檢測柯薩奇病毒A2型的靈敏度，從左到右(1-6)依次為107、106、ΙΟ5、ΙΟ4、103、102copies/ml。
[0019]圖2為本試劑盒柯薩奇病毒A2型標(biāo)準(zhǔn)品實時熒光定量RT-PCR產(chǎn)物凝膠電泳示意圖，電泳條帶大小約77bp,其中Lane M為DL2000 Marker , Lane 1-6分別為柯薩奇病毒A2型標(biāo)準(zhǔn)品(107COpieS/ml)十倍梯度稀釋后實時熒光定量RT-PCR產(chǎn)物，Lane 7為陰性對照。
[0020]圖3為本試劑盒柯薩奇病毒A2型標(biāo)準(zhǔn)品實時熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。 [0021]圖4為本試劑盒檢測柯薩奇病毒A5型的靈敏度，從左到右(1-6)依次為107、106、ΙΟ5、ΙΟ4、103、IO2 copies/ml。
[0022]圖5為本試劑盒柯薩奇病毒A5型標(biāo)準(zhǔn)品實時熒光定量RT-PCR產(chǎn)物凝膠電泳示意圖，電泳條帶大小約81bp,其中Lane M為DL2000 Marker, Lane 1-6分別為柯薩奇病毒A5型標(biāo)準(zhǔn)品(107COpieS/ml)十倍梯度稀釋后實時熒光定量RT-PCR產(chǎn)物，Lane 7為陰性對照。
[0023]圖6為本試劑盒柯薩奇病毒A5型標(biāo)準(zhǔn)品實時熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實施方式】
[0024]下面具體實施例結(jié)合附圖對本發(fā)明進行進一步闡述本發(fā)明，但這些實施例僅限于說明本發(fā)明而不限制本發(fā)明的范圍。
[0025]實施例1
一種檢測柯薩奇病毒A2、A5型的雙重實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，包含:定量RT-PCR反應(yīng)液、酶混合液、引物探針混合液、標(biāo)準(zhǔn)品(CVA2、CVA5 )、強陽性對照品(CVA2、CVA5 )、弱陽性對照品(CVA2、CVA5 )、陰性對照品。其中定量RT-PCR反應(yīng)液包含有PCR反應(yīng)緩沖液(含氯化鎂和三磷酸脫氧核糖核苷酸混合物等)，酶混合液含耐熱Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制劑和MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶，引物探針混合液包含CVA2、CVA5兩組引物和相應(yīng)的CVA2、CVA5兩種不同熒光標(biāo)記的探針，陰性對照為高溫高壓滅菌的DEPC (焦碳酸二乙酯)處理水，陽性對照為CVA2、CVA5的陽性質(zhì)粒樣品。其中強陽性對照品質(zhì)粒濃度為106COpieS/ml，弱陽性對照品質(zhì)粒濃度為103COpieS/ml。引物探針混合液管需存放于棕色管。[0026]雙重?zé)晒舛縍T-PCR檢測用上游引物和下游引物以及相應(yīng)的特異性探針序列如下:
上游引物 CVA2-F: 5 ’ - AGTCGRCCAGTGTCTCAYTCA-3，，
下游引物 CVA2-R:5’ -TACACGCCCRGTCTCAATGG-3’，
特異性探針 CVA2-P: 5’ -FAM- AACAGCTGCWAACACCCAGGTRAGCC-BHQ1-3’，
上游引物 CVA5-F: 5 ’ _ AAGCGGCGGAGACAGGAG-3，，
下游引物 CVA5-R: 5’- CCATGCCTGTTGACCACACA-3’，
特異性探針 CVA5-P: 5’-HEX- CAAAYGCCACCGAYGARAGCATGA-BHQ1-3’。
[0027]其中CVA2、CVA5的特異性探針分別采用FAM、HEX兩種不同熒光標(biāo)記。
[0028]上述標(biāo)準(zhǔn)品包括CVA2、CVA5標(biāo)準(zhǔn)品，其保守區(qū)基因序列如下:
CVA2標(biāo)準(zhǔn)品序列為:
AATGCTACGATAGACAGGGTGTTGAGTCGGCCAGTGTCTCATTCACCAACAGCTGCTAACACCCAGGTGAGCCAGCACTCCATTGAGACTGGGCGTGTACCTGCACTACAAGCTGCTGAAACG ；
CVA5標(biāo)準(zhǔn)品序列為:
ACAGGGCAGGTACCAGCTCTGCAAGCGGCGGAGACAGGAGCGACCTCAAACGCCACCGATGAAAGCATGATTG
AAACCAGGTGTGTGGTCAACAGGCATGGGGTTATGGAAACAAGTGTTGAGo
[0029]本發(fā)明提供的熒光定量試劑盒需于_20°C儲存，盡量減少反復(fù)凍融；引物探針混合液需避光條件保存。
[0030]實施例2
I材料與方法
1.1臨床標(biāo)本與病毒核酸:
柯薩奇病毒A2、A5型的臨床樣本來源于浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院及浙江省內(nèi)其他幾家醫(yī)院手足口病確診患者及疑似患者的糞便標(biāo)本，樣本采集后運送至實驗室。另外，其他腸道病毒如腸道病毒71型、柯薩奇病毒A16型、柯薩奇病毒A5型、柯薩奇病毒AlO型、柯薩奇病毒BI型、柯薩奇病毒B3型、?？瞬《?0型，及甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒、博卡病毒的陽性核酸由傳染病診治國家重點實驗室提供。
[0031]1.2引物與探針
從NCBI基因庫下載了涵蓋國內(nèi)外柯薩奇病毒A2、A5型的多條基因序列。利用DNAman軟件對其進行同源性比較，確定以上病毒基因組的保守區(qū)。使用Primer Express 3.0軟件在其保守區(qū)設(shè)計高度特異性的引物與Taqman探針，引物和探針序列均通過Blast驗證，具有較好特異性。引物和探針序列如下:
上游引物 CVA2-F: 5 ’ - AGTCGRCCAGTGTCTCAYTCA-3，，
下游引物 CVA2-R:5’ -TACACGCCCRGTCTCAATGG-3’，
特異性探針 CVA2-P: 5’ -FAM- AACAGCTGCWAACACCCAGGTRAGCC-BHQ1-3’，
上游引物 CVA5-F: 5 ’ _ AAGCGGCGGAGACAGGAG-3，，
下游引物 CVA5-R: 5’- CCATGCCTGTTGACCACACA-3’，
特異性探針 CVA5-P: 5’-HEX- CAAAYGCCACCGAYGARAGCATGA-BHQ1-3’，
以上引物和探針委托生工生物工程(上海)有限公司合成。
[0032]1.3病毒核酸的提取與標(biāo)準(zhǔn)品定量標(biāo)準(zhǔn):取約0.2g糞便樣本加到EP管中，加入1.5ml的生理鹽水，震蕩混勻3次，每次10s，然后室溫靜置IOmin,以8000r/min離心5min。吸取200 μ?上清加入到EP管中，采用Geneaid公司的 Viral Nucleic Acid extraction KitII 或 QIAGEN 公司的 Rneasy Mini Kit,按照試劑盒說明書進行提取，取5ul已抽提的待測樣品核酸作為模板。
[0033]合成各基因標(biāo)準(zhǔn)品片段，將其連接到質(zhì)粒載體pMD?19_T Simple Vector (TaKaRa公司)。轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)。鑒定后提取質(zhì)粒DNA,利用NanoDrop ND-2000 Spectrophotometer測量質(zhì)粒DNA的濃度，確定DNA的拷貝數(shù)作為標(biāo)準(zhǔn)品定量母液。根據(jù)實驗需要，將標(biāo)準(zhǔn)品定量母液稀釋至所需最高濃度，并做十倍稀釋至最低濃度，低溫保存?zhèn)溆谩?br> [0034]1.4雙重實時熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化:
反應(yīng)總體積為A μ?其中定量RT-PCR反應(yīng)液12.5 μ?,酶混合液I μ?，引物探針混合液(20 μ mol/1，包含兩種病毒的特異性引物和相應(yīng)的兩種熒光探針)共3.0 μ?,模板5 μ?, DEPC水補足至25μ1在ΑΒΙ7500熒光定量PCR儀上進行檢測，反應(yīng)參數(shù)為:反轉(zhuǎn)錄5(TC，30min ;95°C 5min熱啟動，然后95°C 15s，55°C 45s，在55°C進行雙重?zé)晒鈾z測，共進行40個循環(huán)。結(jié)果判斷:選擇熒光檢測模式FAM、HEX熒光基線調(diào)整取3-15個循環(huán)的熒光信號平均值，閾值設(shè)定以閾值線剛好超過陰性對照品的最高點，樣本呈典型的擴增曲線，判斷為陽性。無典型的擴增曲線，判斷為陰性。體系的優(yōu)化試驗，在以相同濃度陽性核酸為模板的反應(yīng)體系中，引物濃度從I~20 μ M，探針濃度從I~20 μ Μ，采用矩陣法優(yōu)選引物和探針的最佳濃度，根據(jù)最低Ct值和最高熒光強度增加值(ARn)選擇最佳引物和探針濃度。
[0035]1.5雙重實時熒光定量RT-PCR特異性、敏感性和重復(fù)性試驗
分別選擇柯薩奇病毒Α2型和柯薩奇病毒Α5型的陽性核酸(均通過基因測序鑒定)和其他腸道病毒如腸道病毒71型、柯薩奇病毒Α16型、柯薩奇病毒Α2型、柯薩奇病毒Α5型、柯薩奇病毒BI型、柯薩奇病毒Β3型、?？瞬《?0型，及甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒、博卡病毒的陽性核酸，用雙重實時熒光定量RT-PCR驗證本方法的特異性；對已標(biāo)定拷貝數(shù)(copies/ml)的柯薩奇病毒A2型合成片段(107copies/ml)和柯薩奇病毒A5型合成片段(107copies/ml)分別稀釋后，平行進行熒光PCR反應(yīng)，比較其靈敏度。此外，對每一個指定濃度的陽性核酸稀釋液作3次重復(fù)檢測，得到的Ct值計算其標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，驗證該方法的重復(fù)性。
[0036]1.6雙重實時熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
將已標(biāo)定拷貝數(shù)(copies/ml)的柯薩奇病毒A2型標(biāo)準(zhǔn)品(107COpieS/ml)、柯薩奇病毒A5型標(biāo)準(zhǔn)品(107copies/ml)分別十倍梯度稀釋至102copies/ml。分別以此為模板用本試劑盒進行實時熒光定量PCR擴增后，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)值為X軸，循環(huán)數(shù)為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0037]2 結(jié)果
2.1雙重實時熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系及條件
該方法的反應(yīng)總體積為μ?其中定量RT-PCR反應(yīng)液12.3 μ?酶混合液I μ?,引物探針混合液(20 μ mol/1，包含兩組特異性引物和相應(yīng)的兩種熒光探針)共3μ1,模板5pl,DEPC水補足至Αμ?在ΑΒΙ7500熒光定量PCR儀上進行檢測，反應(yīng)參數(shù)為:反轉(zhuǎn)錄50°C，30min ;95°C 5min熱啟動，然后95°C 15s，55°C 45s，在55°C進行三重?zé)晒鈾z測，共進行40個循環(huán)?？色@得最低Ct值和最高熒光強度。[0038]2.2特異性試驗
本發(fā)明建立的一步法雙重?zé)晒舛縍T-PCR方法對柯薩奇病毒A2型和柯薩奇病毒A5型具有極好的特異性，能完全檢出近期采集的臨床陽性標(biāo)本。本發(fā)明中的雙重引物探針與其他腸道病毒如腸道病毒71型、柯薩奇病毒A16型、柯薩奇病毒A6型、柯薩奇病毒AlO型、柯薩奇病毒BI型、柯薩奇病毒B3型、?？瞬《?0型，及甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒、博卡病毒的陽性核酸均無交叉反應(yīng)。
[0039]2.3敏感性試驗
對柯薩奇病毒A2型和柯薩奇病毒A5型敏感性檢測試驗，將已標(biāo)定拷貝數(shù)(copies/ml)的柯薩奇病毒A2型合成片段(107copies/ml)、柯薩奇病毒A5型合成片段(IO7Copies/ml)分別十倍梯度稀釋后，用本試劑盒進行檢測，結(jié)果該方法檢測敏感性分別達到102、102copies/ml。結(jié)果參見圖1、圖4。取實時熒光定量RT-PCR產(chǎn)物:! μ? 120V恒壓電泳20min，凝膠成像系統(tǒng)拍照。結(jié)果參見圖2、圖5。其中Lane M為DL2000 Marker7Lane 1-6分別為片段(108COpieS/ml)十倍梯度稀釋后實時熒光定量RT-PCR產(chǎn)物，Lane 7為陰性對照。，電泳條帶單一，亮度梯度分明，說明本試劑盒特異性好，定量結(jié)果相對準(zhǔn)確。
[0040]2.4重復(fù)性試驗
分別取柯薩奇病毒A2型合成片段(終濃度為106COpieS/ml )、柯薩奇病毒A5型合成片段(106copies/ml)按10倍梯度稀釋成4個不同的濃度，對每一個濃度的樣本作3個重復(fù)檢測，結(jié)果不同核酸濃度各自的檢測Ct值標(biāo)準(zhǔn)差在0.187~0.320之間，變異系數(shù)均低于
1.49%，具有較好的重復(fù)性(結(jié)果見表1)。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測柯薩奇病毒A2、A5型的熒光定量試劑盒，其特征在于，本試劑盒由定量RT-PCR反應(yīng)液、酶混合液、引物探針混合液、CVA2標(biāo)準(zhǔn)品、CVA5標(biāo)準(zhǔn)品、CVA2強陽性對照品、CVA5強陽性對照品、CVA2弱陽性對照品、CVA5弱陽性對照品、陰性對照品組成，其中定量RT-PCR反應(yīng)液包含PCR反應(yīng)緩沖液、氯化鎂和三磷酸脫氧核糖核苷酸混合物，酶混合液含耐熱Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制劑和MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶，引物探針混合液包含CVA2、CVA5兩組特異性引物和相應(yīng)的CVA2、CVA5兩種熒光標(biāo)記的特異性探針，陰性對照為高溫高壓滅菌的焦碳酸二乙酯處理水，CVA2、CVA5強陽性對照品和CVA2、CVA5弱陽性對照品為包含CVA2、CVA5的保守區(qū)基因序列的陽性質(zhì)粒樣品； CVA2、CVA5兩組特異性引物和CVA2、CVA5兩種熒光標(biāo)記的特異性探針序列如下: 上游引物 CVA2-F: 5 ’ - AGTCGRCCAGTGTCTCAYTCA-3，，
下游引物 CVA2-R:5’ -TACACGCCCRGTCTCAATGG-3’， 特異性探針 CVA2-P: 5’ -FAM- AACAGCTGCWAACACCCAGGTRAGCC-BHQ1-3’，
上游引物 CVA5-F: 5 ’ _ AAGCGGCGGAGACAGGAG-3，， 下游引物 CVA5-R: 5’- CCATGCCTGTTGACCACACA-3’， 特異性探針 CVA5-P: 5’-HEX- CAAAYGCCACCGAYGARAGCATGA-BHQ1-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測柯薩奇病毒A2、A5型的熒光定量試劑盒，其特征在于，CVA2、CVA5的特異性探針分別采用FAM、HEX兩種熒光標(biāo)記。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測柯薩奇病毒A2、A5型的熒光定量試劑盒，其特征在于，所述CVA2、CVA5標(biāo)準(zhǔn)品的保守區(qū)基因序列如下: CVA2標(biāo)準(zhǔn)品序列為:
AATGCTACGATAGACAGGGTGTTGAGTCGGCCAGTGTCTCATTCACCAACAGCTGCTAACACCCAGGTGAGCCAGCACTCCATTGAGACTGGGCGTGTACCTGCACTACAAGCTGCTGAAACG ； CVA5標(biāo)準(zhǔn)品序列為:
ACAGGGCAGGTACCAGCTCTGCAAGCGGCGGAGACAGGAGCGACCTCAAACGCCACCGATGAAAGCATGATTGAAACCAGGTGTGTGGTCAACAGGCATGGGGTTATGGAAACAAGTGTTGAGo
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測柯薩奇病毒A2、A5型的熒光定量試劑盒，其特征在于，引物探針混合液保存于棕色管。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測柯薩奇病毒A2、A5型的熒光定量試劑盒，其特征在于，所述試劑盒于-20°C儲存，減少反復(fù)凍融。
【文檔編號】C12Q1/68GK103789450SQ201410012003
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月12日
【發(fā)明者】陳瑜, 李蘭娟, 謝國良, 崔大偉 申請人:浙江大學(xué)