專利名稱：柯薩奇病毒a16型病毒樣顆粒疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和生物醫(yī)藥領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及柯薩奇病毒A16型病毒樣顆粒疫苗。
背景技術(shù)：
手足口病是兒童的常見疫病，目前仍無有效的疫苗和治療藥物?？滤_奇病毒 A16(CVA16)和人腸道病毒71(EV71)是手足口病的兩個最主要病原，屬于小核糖核酸病毒科腸道病毒屬，單鏈正義RNA病毒，基因組約7400bp (Xu, J.，Y. Qian, S. Wang，J. Μ. Serrano, W. Li, Ζ. Huang, and S. Lu. 2010. EV71 :anemerging infectious disease vaccine target in the Far East Vaccine28 :3516-21 禾口 Zhang, Y. , D.Wang, D. Yan, S. Zhu, J. Liu, H. Wang, S. Zhao, D. Yu, L. Nan, J. An, L. Chen, H. An, A. Xu, and W. Xu. 2010. Molecular evidence of persistentepidemic and evolution of subgenotype Bl coxsackievirus A16_associated hand, foot, and mouth disease in China. J Clin Microbiol 48 619-22)。腸道病毒屬基因組編碼單股長鏈多肽，由結(jié)構(gòu)蛋白Pl和非結(jié)構(gòu)蛋白P2、P3組成。病毒蛋白酶將Pl切割為VP0、VPl和VP3，三者組裝形成病毒衣殼(Ranganathan， S. , S. Singh, C. L. Poh, and V. Τ. Chow. 2002. The hand, foot and mouth disease virus capsid :sequence analysis and prediction of antigenic sites from homology modelling. ApplBioinformatics 1 :43-52)。其中的一些腸道病毒，如脊髓灰質(zhì)炎病毒，VPO 蛋白被進(jìn)一步切割為 VP2 和 VP4 (Kitamura, N.，B. L. Semler, P. G. Rothberg, G. R. Larsen, C. J. Adler, A. J. Dorner, E. A. Emini, R. Hanecak, J. J. Lee, S. van derfferf, C. W. Anderson, and Ε. ffimmer. 1981. Primary structure, gene organizationand polypeptide expression of poliovirus RNA. Nature 291 :547-53)。過去的幾年，手足口病在遠(yuǎn)東地區(qū)的很多國家和地區(qū)流行，包括中國、香港、日本、 新加坡和臺灣。在今年的一月一日到九月三十日期間，中國報道了 1，567，2M例手足口病，其中8 例死亡。EV71被發(fā)現(xiàn)與手足口病重癥和死亡病例相關(guān)聯(lián)，因此已有的和正在進(jìn)行的病毒學(xué)調(diào)查和手足口病疫苗的研發(fā)主要集中在EV71。但最近的臨床病例研究表明， 中國最近爆發(fā)的手足口病與 CVA16 和 EV71 有關(guān)(Zhang, Y.，X. J. Tan, H. Y. Wang，D. Μ. Yan, S. L. Zhu, D. Y. Wang, F. Ji, Χ. J. Wang, Y. J. Gao, L. Chen, H. Q. An, D. X. Li, S. W. Wang, A. Q. Xu, Z. J. Wang, and W. B. Xu. 2009. An outbreak of hand,foot, and mouth diseaseassociated with subgenotype C4 of human enterovirus 71 in Shandong, China. JClin Virol 44 262-7 禾口 Zhang, Y. , D. Wang, D. Yan, S. Zhu, J. Liu, H. Wang, S. Zhao, D. Yu, L. Nan, J. An, L. Chen, H. An, A. Xu, and W. Xu. 2010. Molecularevidence of persistent epidemic and evolution of subgenotype Bl coxsackievirusA16-associated hand, foot, and mouth disease in China. J Clin Microbiol48 :619-22)，患者有可能共感染 EV71 和 CVA16，并在體內(nèi)同時存在這兩種病毒，因而導(dǎo)致CVA16和EV71發(fā)生重組，導(dǎo)致EV71新亞型D的出現(xiàn)。 CVA16單獨感染也可能引起了兒童的死亡。這些研究表明，開發(fā)兼抗CVA16和EV71的多價廣譜疫苗，才能有效預(yù)防和控制手足口病。很多病毒的病毒結(jié)構(gòu)蛋白重組表達(dá)后可以自發(fā)組裝成病毒樣顆粒 (virus-likeparticle, VLP)，其結(jié)構(gòu)和抗原性與真病毒沒有區(qū)別，但缺少病毒核酸，是沒有感染性的。病毒樣顆粒已經(jīng)成為開發(fā)安全有效的病毒性疾病疫苗的一個有效策略，例如，基于病毒樣顆粒的乙型肝炎和人類皰疹病毒疫苗已經(jīng)獲得審批。針對EV71的病毒樣顆粒已在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)，它能產(chǎn)生中和活性的抗體，從而保護(hù)致死劑量病毒攻擊的小鼠。然而，目前本領(lǐng)域還沒有一種有效的針對柯薩奇病毒的理想疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種柯薩奇病毒A16型病毒樣顆粒疫苗。在本發(fā)明的第一方面，提供一種表達(dá)載體，其包括至少一個表達(dá)盒1 (如1、2或3個)，所述的表達(dá)盒1含有柯薩奇病毒A16型病毒 (CVA16)的Pl蛋白的編碼序列；和至少一個表達(dá)盒2(如1、2或3個)，所述的表達(dá)盒2含有柯薩奇病毒A16型病毒的3CD蛋白的編碼序列。在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)載體是PFastBacTM Dual (pFBD)載體。在本發(fā)明的另一方面，提供一種重組桿狀病毒，所述桿狀病毒的基因組中包括至少一個表達(dá)盒(如1、2或3個)，所述的表達(dá)盒1含有柯薩奇病毒A16型病毒 (CVA16)的Pl蛋白的編碼序列；和至少一個表達(dá)盒(如1、2或3個)，所述的表達(dá)盒2含有柯薩奇病毒A16型病毒的 3⑶蛋白的編碼序列。在另一優(yōu)選例中，所述的重組桿狀病毒用于感染昆蟲細(xì)胞而獲得重組蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述桿狀病毒通過以下步驟制備(A)將柯薩奇病毒A16型病毒(CVA16)的Pl蛋白的編碼序列和柯薩奇病毒A16型病毒的3⑶蛋白的編碼序列克隆入桿粒中，獲得重組的桿粒；(B)將(A)獲得的重組的桿粒轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的昆蟲細(xì)胞；和(C)收獲重組的桿狀病毒。在另一優(yōu)選例中，所述的桿粒是Bac-mid桿粒。更優(yōu)選的，所述的Bacmid來源于大腸桿菌DHlOBac。在另一優(yōu)選例中，所述的昆蟲細(xì)胞是sf9昆蟲細(xì)胞。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的表達(dá)載體或的所述的重組桿狀病毒的用途，用于制備病毒樣顆粒。在本發(fā)明的另一方面，提供一種產(chǎn)生病毒樣顆粒的系統(tǒng)，包括(1)所述的重組桿狀病毒；和(2)昆蟲細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的昆蟲細(xì)胞是sf9昆蟲細(xì)胞。在本發(fā)明的另一方面，提供一種制備病毒樣顆粒的方法，包括(a)將所述的重組桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞；(b)從昆蟲細(xì)胞的裂解物中分離獲得病毒樣顆粒。
在另一優(yōu)選例中，通過蔗糖密度梯度離心分離病毒樣顆粒。在本發(fā)明的另一方面，提供一種具有免疫原性的病毒樣顆粒，其由所述的方法產(chǎn)生，其平均直徑為20-30nm。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的病毒樣顆粒的用途，用于制備預(yù)防柯薩奇病毒 A16型病毒感染相關(guān)疾病的組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的疾病是手足口病(Hand，foot and mouth disease, HFffl))。在本發(fā)明的另一方面，提供一種具有免疫原性的組合物，所述的組合物包含(a)所述的具有免疫原性的病毒樣顆粒；和(b)藥學(xué)上可接受的載體。在本發(fā)明的另一方面，提供一種制備預(yù)防柯薩奇病毒A16型病毒感染相關(guān)疾病的方法，所述方法包括給予需要預(yù)防的對象有效量的所述的具有免疫原性的病毒樣顆粒，或所述的具有免疫原性的組合物。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1、各桿狀病毒表達(dá)載體Tn7內(nèi)片段結(jié)構(gòu)示意圖。圖2、用桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)CVPl和CV3⑶。Sf9昆蟲細(xì)胞用重組桿狀病毒感染，2 天后收集細(xì)胞用抗VPO抗體進(jìn)行(A)免疫熒光；(B)ELISA ；(C)Western blot 分析。圖3、VLP的蔗糖密度梯度離心分析。細(xì)胞裂解物被鋪在10-50%的蔗糖梯度上進(jìn)行超速離心后，從上到下收集10個組分進(jìn)行分析。(A)用抗VPO抗體進(jìn)行ELISA分析；(B)用抗 VPO 抗體進(jìn)行 Wfestern blot 分析；(C)用抗 VP3 抗體進(jìn)行 Wfestern blot 分析；(D)用抗 VPl 抗體進(jìn)行 Wfestern blot 分析。圖4、CVA16病毒樣顆粒的電鏡分析。圖5、免疫小鼠血清中CVA16衣殼亞單位蛋白特異性IgG抗體反應(yīng)。血清稀釋度為 1 100。Y軸數(shù)值為450nm的吸光度。圖6、免疫小鼠血清對CVA16活病毒的中和效價。Sf9免疫血清在檢測最小稀釋度 1 32時沒有中和作用，因此被賦予一個虛擬中和效價1 16進(jìn)行計算。
具體實施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，意外地發(fā)現(xiàn)采用桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞來表達(dá) CVA16的Pl蛋白和CVA16的3⑶蛋白，可獲得具有比較好的空間構(gòu)型且經(jīng)適當(dāng)切割的蛋白， 所述蛋白可自動組裝為病毒樣顆粒，所述病毒樣顆粒具有高的免疫原性。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。桿狀病毒本發(fā)明提供了一種重組的桿狀病毒，其可用于感染昆蟲細(xì)胞而獲得經(jīng)適當(dāng)切割的蛋白。所述的桿狀病毒的基因組中含有至少一個含有柯薩奇病毒A16型病毒的Pl蛋白的編碼序列的表達(dá)盒1 ；和至少一個含有柯薩奇病毒A16型病毒的3CD蛋白的編碼序列的表達(dá)盒2。所述的重組的桿狀病毒可以穩(wěn)定傳代，零下70°C可以長期保存并具有高的滴度。 利用該病毒感染昆蟲細(xì)胞后1-2天后可以得到重組蛋白，且表達(dá)穩(wěn)定。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述桿狀病毒通過以下步驟制備(A)將柯薩奇病毒A16型病毒的Pl蛋白的編碼序列和的柯薩奇病毒A16型病毒的 3⑶蛋白的編碼序列克隆入桿粒中，獲得重組的桿粒；(B)將㈧獲得的重組的桿粒轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的昆蟲細(xì)胞；和(C)收獲重組的桿狀病毒。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的桿粒是Bac-mid桿粒。更優(yōu)選的，所述的Bac-mid 來源于大腸桿菌DHlOBac。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的昆蟲細(xì)胞選自sf9昆蟲細(xì)胞，HighFive昆蟲細(xì)胞； 最優(yōu)選的，所述昆蟲細(xì)胞是sf9昆蟲細(xì)胞。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，將柯薩奇病毒A16型病毒的Pl蛋白的編碼序列和的柯薩奇病毒A16型病毒的3⑶蛋白的編碼序列及其兩端重組序列，在轉(zhuǎn)座酶的作用下重組入 Bacmid桿粒的Tn7位點。更優(yōu)選的，所述的轉(zhuǎn)座酶由大腸桿菌DHlOBac中攜帶的輔助質(zhì)粒 (helper)所表達(dá)。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，在步驟(A)中，所述重組的桿粒通過以下步驟獲得(a)將柯薩奇病毒A16型病毒的Pl蛋白的編碼序列和的柯薩奇病毒A16型病毒的3CD蛋白的編碼序列插入穿梭載體(優(yōu)選pFASTBac-Dual載體)的多克隆位點中，獲得插入了外源編碼序列的重組載體；(b)將(a)獲得的重組載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞DHlOBac，獲得轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中含有重組桿粒，所述的重組桿粒攜帶所述的外源編碼序列；和(c)從所述轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中提取重組桿粒。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的柯薩奇病毒A16型病毒的Pl蛋白具有SEQID NO 1所示的氨基酸序列。所述的柯薩奇病毒A16型病毒的CD3蛋白具有SEQ ID NO :2所示的
氨基酸序列。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的外源蛋白(柯薩奇病毒A16型病毒的Pl蛋白或柯薩奇病毒A16型病毒的CD3蛋白)的編碼序列的兩端還含有多克隆位點的編碼序列。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的桿狀病毒是通過將外源基因柯薩奇病毒A16型病毒的Pl蛋白的編碼基因和柯薩奇病毒A16型病毒的CD3蛋白的編碼基因克隆進(jìn)入 PFASTBac的多克隆位點內(nèi)，然后將pFASTBAC轉(zhuǎn)化DHlOBac基因工程菌，在轉(zhuǎn)座酶的作用下發(fā)生重組，獲得桿粒后轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞獲得的。將這種病毒感染昆蟲細(xì)胞后數(shù)小時，病毒即可進(jìn)入昆蟲細(xì)胞，開始復(fù)制病毒，并且轉(zhuǎn)錄病毒重組區(qū)域中蛋白翻譯區(qū)的外源核酸序列，在該段序列中含有所述外源的核酸序列。感染約1-2天后表達(dá)具有病毒重組區(qū)域中蛋白翻譯區(qū)所對應(yīng)的氨基酸序列的蛋白。此外，在所述的桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞并表達(dá)外源蛋白后，還可以通過例如密度梯度離心等方法從培養(yǎng)物中回收重組桿狀病毒，用于下次感染。具有免疫原性的病毒樣顆粒本發(fā)明人提供了一種制備病毒樣顆粒的方法，該方法包括步驟(1)將所述的桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞，培養(yǎng)感染后的昆蟲細(xì)胞，使之表達(dá)所述的外源蛋白(2)從昆蟲細(xì)胞的裂解物中分離獲得病毒樣顆粒。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的昆蟲細(xì)胞選自sf9昆蟲細(xì)胞，HighFive昆蟲細(xì)胞；最優(yōu)選的，所述昆蟲細(xì)胞是sf9昆蟲細(xì)胞。本發(fā)明還提供一種具有免疫原性的病毒樣顆粒，其基本上由上述方法制備獲得。機(jī)體免疫系統(tǒng)的MHC I型和MHC II型對以顆粒狀形式存在的外源性抗原的提呈較對可溶性單體抗原的提呈要強(qiáng)1000或10000倍，即以顆粒狀形式存在的抗原比可溶性單體抗原具有更強(qiáng)的免疫原性，機(jī)體免疫系統(tǒng)的MHC I型和MHC II途徑對以顆粒狀形式存在的外源性抗原的提呈較對可溶性單體抗原的提呈要強(qiáng)1000或10000倍，即以顆粒狀形式存在的抗原比可溶性單體抗原具有更強(qiáng)的免疫原性。本發(fā)明獲得的病毒樣顆粒的平均直徑 (粒徑)為 20-30nm。本發(fā)明還提供所述的具有免疫原性的病毒樣顆粒的用途，用于制備預(yù)防人柯薩奇病毒A16型病毒感染相關(guān)疾病的組合物。所述的疾病例如是手足口病。組合物本發(fā)明還提供一種具有免疫原性的組合物(預(yù)防性或治療性疫苗)，所述的組合物包含有效量的本發(fā)明所述的具有免疫原性的病毒樣顆粒，和藥學(xué)上可接受的載體。如本文所用，“藥學(xué)上可接受的”的成分是適用于人和/或哺乳動物而無過度不良副反應(yīng)(如毒性)的，即具有合理的效益/風(fēng)險比的物質(zhì)。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在 Remington’ s PharmaceuticalSciences (Mack Pub. Co.，N. J. 1991)中可找至Ij 關(guān)于藥學(xué)上可接受的載體的充分說明。在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、 鹽水、甘油和山梨醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如潤滑劑、助流劑、潤濕劑或乳化劑、PH緩沖物質(zhì)和穩(wěn)定劑，如白蛋白等?？蓪⑺龅慕M合物制成各種適合于哺乳動物給藥的劑型，所述劑型包括但不限于注射劑、膠囊劑、片劑、乳劑、栓劑；較佳地為注射劑。動物實驗表明，利用本發(fā)明的具有免疫原性的病毒樣顆粒制成的疫苗免疫動物后，可在動物體內(nèi)產(chǎn)生高效價的抗體。在使用時，是將安全有效量的本發(fā)明所述的具有免疫原性的病毒樣顆粒施用于哺乳動物(如人)，其中該安全有效量通常至少約1微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約10毫克/千克體重，較佳地該劑量是約1微克/千克體重-約1毫克/千克體重。 當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于本發(fā)明首次制備了 CVA16的重組病毒樣顆粒(CVA16-LP)，免疫小鼠后獲得了高中和活性的抗體，表明CVA16-LP是預(yù)防柯薩奇病毒的理想疫苗。下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克隆實驗室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。材料細(xì)胞和病毒RD (人橫紋肌肉瘤細(xì)胞，購自ATCC)細(xì)胞含10 % FBS、100unit/mL青霉素和 100ug/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基37°C，5% CO2培養(yǎng)。病毒CVA16 shzh05-l(基因組序列參見GenBank登錄號EU262658)(參見Wu， Ζ. , Y. Gao, L. Sun, P. Tien, and Q. Jin. 2008. Quick identification of effectivesmall interfering RNAs that inhibit the replication of coxsackievirus A16. AntiviralRes 80 :295-301. Yang, F. ， Q. Jin, Y. He, L. Li, and Y. Hou. 2001. The completegenome of Enterovirus 71 China strain. Sci China C Life Sci 44 :178-83) 在RD細(xì)胞中增殖；微量滴定法測定CVA16病毒滴度，根據(jù)Reed-Muench方法測定半數(shù)組織 ^ (TCID50) (Reed, L. J. Μ. ， H. 1938. A simple method ofestimating 50 percent endpoints. Am J Hyg 27 :493-499)。采用SF90 Oil SFM 培養(yǎng)基(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)于 27°C培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞 Sf9?？贵w抗EV71的鼠單克隆抗體MAB979(與CVA16有交叉反應(yīng))購于 Millipore (Billerica, MA, USA)；豚鼠的抗VP0、VPl或VP3的抗血清通過用大腸桿菌表達(dá) (常規(guī)方法表達(dá))的重組VP0、VPl或VP3免疫(常規(guī)免疫方法)豚鼠三次制備得到。制備重組桿狀病毒CVA16 shzh05-l 感染 RD 細(xì)胞，Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)法提取病毒 RNA，oligo(dT)為引物，M-MLV(Invitrogen，Carlsbad, CA, USA)反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄， 以獲得的第一鏈cDNA為模板擴(kuò)增編碼CVA16的Pl蛋白和3CD蛋白的基因片段，分別命名為 CV Pl和 CV 3CD。采用5，-CACTCTAGAATGGGGTCACAAGTCTCC-3，(SEQID NO 3)為上游引物，5，-CCA AAGCTTTTACAATCTTGTTATCTTGTC-3，(SEQ ID NO 4)為下游引物，擴(kuò)增 CV Pl ；Xba I 和 Hind III雙酶切后，亞克隆到同樣酶切處理的pFBD(piiastBacTM Dual的縮寫(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA))，構(gòu)建 pFBD-CVPl。以 5，-TCACCATGGGACCGAGCTTAGACTT-3，(SEQ ID NO :5)為上游引物，5，-CACATGCATCTAAAATAATTCGAGCCA-3，(SEQ ID NO :6)為下游引物，擴(kuò)增 CV 3CD ；Nco I 禾Π Nsi I 雙酶切后，亞克隆到同樣酶切處理的PFBD，構(gòu)建pFBD-CV3⑶。Xba I和Hind III雙酶切pFBD-CVPl獲得CVP1，亞克隆到同樣酶切的pFBD_CV3CD， 構(gòu)建 PFBD-CVP1/CV3CD。上述三個質(zhì)粒通過Bac-t0-Bac 系統(tǒng) Qnvitrogen, Carlsbad, CA, USA)制備相應(yīng)的桿狀病毒，分別命名為Bac-CVPl、Bac-CV3CD和Bac_CVPl/3CD。按照hvitrogen說明書將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DHlOBac E. coli，鑒定重組質(zhì)粒Bac-mid，Bac-mid轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，篩選擴(kuò)增重組桿狀病毒。按^witrogen說明書指定的MOI用重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞，表達(dá)目的蛋白。感染后48h收集感染的細(xì)胞和上清，準(zhǔn)備做生化分析和電鏡試驗。免疫熒光試驗重組病毒感染Sf9細(xì)胞4 后，PBS洗細(xì)胞兩次，4% (w/v)多聚甲醛室溫固定細(xì)胞20min，PBS洗三次，(v/v)NP40作用室溫lOmin，PBS洗三次，10% (ν/ν)正常羊血清 (NGS) 37 °C 作用 30min，PBS 洗三次，豚鼠抗 CVVPO (1 100) 37°C 作用 30min，PBS 洗三次， FITC標(biāo)記的羊抗豚鼠(1 500) 37°C作用30min，PBS洗三次，DAPI室溫染核5min，PBS洗五次，50% (ν/ν)甘油封片，熒光顯微鏡觀察。ELISA 禾口 Western blot收集桿狀病毒感染的細(xì)胞，預(yù)冷的PBS緩沖液重懸細(xì)胞，F(xiàn)astprepFP120(Biol01, Vista, CA, USA)破碎細(xì)胞，12000rpm 4°C離心15min，收集上清。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，Bradford蛋白分析試劑盒(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)測定上清中可溶性總蛋白的濃度。直接ELSA檢測，PBS為包被液，細(xì)胞裂解物離心后上清50uL/孔，37°C包被96孔 ELISA板 2h，PBST (含 0.05% (ν/ν)吐溫-20 的 1XPBS)漂洗 3 次，5% (w/v)脫脂奶粉 37°C 封閉lh，PBST漂洗3次，一抗為1 2000豚鼠抗CVVPO (大腸桿菌表達(dá)的重組CVA16 VPO 免疫豚鼠三次后的抗血清)37°C作用》!，PBST漂洗3次，二抗為1 5000 HRP標(biāo)記的羊抗豚鼠IgG(sigma)37°C作用lh，PBST漂洗5次，四甲基聯(lián)苯胺(TMB)-過氧化氫系統(tǒng)為底物顯色，IM H3PO4中止，酶標(biāo)儀450nm檢測，同時設(shè)陰性對照和空白對照。Western bloting檢測，制備樣品先進(jìn)行12%凝膠SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)印PVDF 膜，5% (w/v)脫脂奶粉室溫封閉2h，PBST (0. 05% (ν/ν)的吐溫20)漂洗3次，1 1000 稀釋的一抗(豚鼠的抗VP0、VP1或VP3的抗血清，通過用大腸桿菌表達(dá)的重組VP0、VPl或 VP3免疫豚鼠三次制備得到)室溫孵育2h，PBST漂洗3次，HRP標(biāo)記的相應(yīng)二抗(羊抗豚鼠IgG)室溫孵育lh，PBST漂洗5次，加適當(dāng)量的BeyoECL發(fā)光試劑LAS-4000冷光分析儀 (Fujifilm Life Science)顯影。蔗糖密度梯度及部分純化VLP感染細(xì)胞裂解物12000rpm 4°C離心15min，收集上清加到10%-50%的蔗糖梯度上層，Beckman離心機(jī)39000rpm 4°C離心3h，收集10個蔗糖梯度(0. 4mL/梯度)，做ELISA 和Wfestern blot檢測分析。依據(jù)ELISA和^festern blot結(jié)果，收集CV VPO富集的梯度，Centrifugal Filter Units (Millipore, UFC800396, USA)濃縮蛋白樣品，據(jù)已建立的 Western blot方法定量收集的病毒樣顆粒，準(zhǔn)備免疫動物。電鏡分析
0. 5% (w/v)水溶性乙酸雙氧鈾負(fù)染上述部分純化的病毒樣顆粒，飛利浦CM-12S 掃描電鏡分析。小鼠免疫程序和抗體效價檢測將抗原蛋白和鋁佐劑(Pierce，Rockford, IL)按照鋁佐劑自帶操作說明書進(jìn)行混合，腹腔免疫6只雌性Balb/c小鼠(6-8周齡)，Iug/只病毒樣顆粒(據(jù)VPO定量)，同樣處理空白細(xì)胞Sf9，設(shè)立陰性對照組。第3和6周分別進(jìn)行第二和三次免疫，每次免疫前采血，第八周小鼠眼球采血，收集血清，_80°C分裝保存。原核表達(dá)的CVA16的VP0、VP1和VP3各IOOng/孔包板，按照已建立的ELISA方法 (6)測定血清中特異的IgG，以大于相應(yīng)陰性孔(免疫前血清)0. 1個OD值的檢測孔為陰陽性判定，其血清稀釋倍數(shù)的倒數(shù)即為血清ELISA效價。中和試驗通過在RD細(xì)胞上進(jìn)行TCID5tl減數(shù)試驗分析血清的中和滴度，簡述如下RD細(xì)胞接種96孔板，1 X IO4/孔細(xì)胞，過夜培養(yǎng)到細(xì)胞達(dá)70%匯合度時，進(jìn)行中和試驗。2% (v/v)FBS 的DMEM梯度稀釋血清樣品，CVA16病毒稀釋到2TCID5(1/uL，50uL稀釋的血清樣品和50uL稀釋的CVA16病毒(IOOTCID5ci)混合37°C孵育lh，血清病毒混合物加到長有RD細(xì)胞的孔內(nèi) 37°C培養(yǎng)3d，能減少50%細(xì)胞病變(CPE)的血清稀釋度為該血清的中和滴度。
實施例實施例1、桿狀病毒的構(gòu)建CVA16/shzh05的編碼Pl和3⑶的基因片段通過反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA后由PCR擴(kuò)增合成，然后克隆到PFBD載體，分別命名為pFBD-CVP 1和pFBD_CV3CD。CVP1基因通過 pFBD-CVPl中的polyhedrin啟動子調(diào)控，CV3CD基因則由pFBD_CV3CD內(nèi)的plO啟動子直接調(diào)控。同時裝載了兩個基因的PFBD-CVP1/3⑶(圖1)也成功構(gòu)建，其可以在同種細(xì)胞里共同有效表達(dá)兩種蛋白。上述三種結(jié)構(gòu)再隨后構(gòu)建到相應(yīng)的桿狀病毒，分別命名為Bac-CVPl，Bac_3⑶， Bac-CVP1/3CDο實施例2、在昆蟲細(xì)胞內(nèi)表達(dá)CVA16VLPs用Bac-CVPl，Bac_3CD，Bac_CVPl/3CD 分別感染 Sf9 昆蟲細(xì)胞。首先用抗-CVA16VP0 的多抗通過免疫熒光方法來檢測感染昆蟲細(xì)胞中目的蛋白表達(dá)。結(jié)果如圖2A所示， Bac-CVPl和Bac-CVPl/3⑶有明亮綠色熒光；空白組和Bac_3⑶感染組并未檢測到熒光信號。Bac-CVPl在昆蟲細(xì)胞的表達(dá)同時通過ELISA實驗也得到證實抗CVA16 VPO的抗體檢測到Bac-CVPl和Bac-CVPl/3⑶的細(xì)胞裂解的表達(dá)，而空白組和Bac_3⑶感染組并未檢測到信號(圖2B)。其次，抗VPO抗體Wfestern blot分析了 Pl被3CD的剪切過程。如圖2C所示，空白組和Bac-3⑶感染組未檢測到條帶，而Bac-CVPl的裂解物有一分子量約為60KDa的條帶， Bac-CVPl/3CD有兩條分別為39KDa和^KDa的條帶，這些條帶與預(yù)期的VPO和VP2被正確切割所產(chǎn)生的目的條帶大小一致。同樣的條帶形式與在野生型CVA16上已發(fā)現(xiàn)的一致?？傊?，這些結(jié)果證明，在Bac-CVPl/3⑶感染的細(xì)胞中Pl蛋白可以有效產(chǎn)生并被正確切割。Bac-CVPl/3⑶用于下一步的研究。
ELISA*WfeStern blot分析Bac-CVPl/3CD感染細(xì)胞后病毒樣顆粒的構(gòu)成，蔗糖密度梯度離心分離細(xì)胞裂解物，ELISA檢測不同蔗糖梯度CVA16的特異蛋白?？笴VVPO多克隆抗體檢測到目的蛋白主要存在梯度6#(圖3A)，證明病毒樣顆粒的存在。分別利用CVA16 的三個多克隆抗體抗CVVP0、抗CVVPl和抗CVVP3 Western bloting進(jìn)一步分析不同的蔗糖梯度發(fā)現(xiàn)組分#6均出現(xiàn)針對這三個抗體的強(qiáng)烈信號，與ELISA結(jié)果相一致(圖3B、3C和 3D)。更重要的是目的條帶的分子量和已報道的野生毒株亞結(jié)構(gòu)蛋白分子量一致，即VPO大小為39KDa，VP2為^KDa，VPl為33KDa，VP3為^KDa。結(jié)果表明，病毒樣顆粒是由正確切割修飾的衣殼亞結(jié)構(gòu)蛋白形成。為直接確定病毒樣顆粒的形成，梯度6#樣品負(fù)染后，電鏡觀察分析，結(jié)果觀察到直徑約25nm的病毒樣顆粒(圖4)。實施例3、CVA16病毒樣顆粒在小鼠中的免疫原性動物實驗評價CVA16病毒樣顆粒的免疫原性，于第0、3和6周用粗提純的病毒樣顆粒腹腔注射Iug/只小鼠，鋁佐劑為佐劑，同樣處理的未感染的Sf9細(xì)胞作為對照。最后一次免疫后兩周收集小鼠血清，用重組抗原包被ELISA檢測特異的抗體，結(jié)果表明VLP免疫組血清可以和重組的亞單位外殼蛋白反應(yīng)，而對照Sf9血清不反應(yīng)(圖5)。實施例4、VLP免疫血清的中和活性中和試驗評估VLP免疫血清的中和活性，兩倍梯度稀釋的血清與100TCID50的 CVA16病毒混合，加入RD細(xì)胞，據(jù)能引起減少50%細(xì)胞病變(CPE)的血清稀釋度判定血清的中和滴度。結(jié)果表明，Sf9細(xì)胞裂解物免疫小鼠獲得的血清在檢測的最低稀釋度(1 32)沒有中和活性，而病毒樣顆粒免疫小鼠血清的中和效價高達(dá)1 4096(圖6)。這一結(jié)果表明， 重組的CVA16病毒樣顆粒能引起機(jī)體產(chǎn)生較高中和活性的抗體，因而可以作為防治CVA16 的疫苗。討論世界范圍內(nèi)，柯薩奇病毒(CVA16)和腸道病毒71(EV71)病毒是手足口病的最主要病原。最近的研究發(fā)現(xiàn)，CVA16和EV71病毒發(fā)生共感染和重組，這可能是過去幾年中國大陸手足口病大規(guī)模爆發(fā)的主要原因。因此，CVA16和EV71病毒都應(yīng)該是手足口病疫苗研究的靶點，從而廣泛有效地防治手足口病。本發(fā)明首次報道了 CVA16病毒樣顆粒的制備及其誘導(dǎo)高效價中和抗體的能力。利用重組的桿狀病毒在昆蟲細(xì)胞共表達(dá)Pl和3CD制備CVA16的病毒樣顆粒，生化試驗和電鏡分析發(fā)現(xiàn)CVA16病毒樣顆粒為約25nm的球形結(jié)構(gòu)，主要由病毒的衣殼蛋白VP0、VP1、VP3和少量的VP2亞結(jié)構(gòu)蛋白組成。CVA16病毒樣顆粒免疫小鼠后制備的抗血清與衣殼亞單位蛋白有特異的反應(yīng)，更有意義的是，該血清能在體外有效地中和CVA16活病毒，中和效價高達(dá) 1 4096。本發(fā)明說明CVA16病毒樣顆粒誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體對CVA16有強(qiáng)有效的保護(hù)作用， 因此CVA16病毒樣顆?？勺鳛轭A(yù)防CVA16引起的手足口病的疫苗。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種表達(dá)載體，其包括表達(dá)盒1，所述的表達(dá)盒1含有柯薩奇病毒A16型病毒的Pl蛋白的編碼序列；和表達(dá)盒2，所述的表達(dá)盒2含有柯薩奇病毒A16型病毒的3CD蛋白的編碼序列。
2.一種重組桿狀病毒，所述桿狀病毒的基因組中包括表達(dá)盒1，所述的表達(dá)盒1含有柯薩奇病毒A16型病毒的Pl蛋白的編碼序列；和表達(dá)盒2，所述的表達(dá)盒2含有柯薩奇病毒A16型病毒的3CD蛋白的編碼序列。
3.權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體或的權(quán)利要求3所述的重組桿狀病毒的用途，用于制備病毒樣顆粒。
4.一種產(chǎn)生病毒樣顆粒的系統(tǒng)，包括(1)權(quán)利要求2所述的重組桿狀病毒；和(2)昆蟲細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求4所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述的昆蟲細(xì)胞是sf9昆蟲細(xì)胞。
6.一種制備病毒樣顆粒的方法，包括(a)將權(quán)利要求2所述的重組桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞；(b)從昆蟲細(xì)胞的裂解物中分離獲得病毒樣顆粒。
7.一種具有免疫原性的病毒樣顆粒，其由權(quán)利要求6所述的方法產(chǎn)生，其平均直徑為 20-30nm。
8.權(quán)利要求7所述的病毒樣顆粒的用途，用于制備預(yù)防柯薩奇病毒A16型病毒感染相關(guān)疾病的組合物。
9.如權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，所述的疾病是手足口病。
10.一種具有免疫原性的組合物，其特征在于，所述的組合物包含(a)權(quán)利要求8所述的具有免疫原性的病毒樣顆粒；和(b)藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及柯薩奇病毒A16型病毒樣顆粒疫苗。意外地發(fā)現(xiàn)采用桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞來表達(dá)CVA16的P1蛋白和CVA16的3CD蛋白，可獲得具有比較好的空間構(gòu)型且經(jīng)適當(dāng)切割的蛋白，所述蛋白可自動組裝為病毒樣顆粒，所述病毒樣顆粒具有高的免疫原性。
文檔編號A61K39/125GK102465144SQ201010553419
公開日2012年5月23日 申請日期2010年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月19日
發(fā)明者劉慶偉, 蔡一村, 黃忠 申請人:中國科學(xué)院上海巴斯德研究所