一種5-氨基乙酰丙酸產(chǎn)生菌株及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種構(gòu)建5-氨基乙酰丙酸生產(chǎn)菌株的方法，即增強所述5-氨基乙酰丙酸生產(chǎn)菌株中輔酶A合成途徑關(guān)鍵酶和/或輔酶A前體合成途徑關(guān)鍵酶的活性。本發(fā)明還公開了利用所述方法構(gòu)建的5-氨基乙酰丙酸高產(chǎn)菌株和利用所述菌株制備5-氨基乙酰丙酸的方法。利用本發(fā)明的菌株可高效、低成本地產(chǎn)生5-氨基乙酰丙酸。
【專利說明】一種5-氨基乙酰丙酸產(chǎn)生菌株及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程和微生物發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】。具體地說，本發(fā)明涉及通過增強5-氨基乙酰丙酸生產(chǎn)菌株中輔酶A的合成來提高5-氨基乙酰丙酸產(chǎn)量的方法和應(yīng)用，以及輔酶A合成途徑關(guān)鍵酶活性增強的生產(chǎn)菌株。
【背景技術(shù)】
[0002]5-氨基乙酰丙酸(5-minolevulinic acid, ALA)是生物體內(nèi)合成血紅素、葉綠素、維生素B12等四吡咯類化合物必需前體物質(zhì)，在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥和化工領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，是極具開發(fā)價值的高附加值生物基化學(xué)品。目前，通過產(chǎn)ALA的細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)ALA已經(jīng)得到了產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，并逐漸替代了傳統(tǒng)的化學(xué)合成法，成為研究和開發(fā)的重點。
[0003]目前用于生產(chǎn)ALA的微生物主要是通過誘變育種或基因工程改造獲得，而現(xiàn)有文獻(xiàn)報道的基因工程改造方面的研究大多集中在強化ALA的合成途徑上，例如增強ALA合成途徑關(guān)鍵酶的表達(dá)，而對ALA合成途徑底物供給及微生物原有代謝途徑改造的研究較少。現(xiàn)有技術(shù)中，對ALA合成底物的胞內(nèi)供應(yīng)進(jìn)行了部分嘗試，但總體效果不好，因此，目前為止對于ALA合成的底物供應(yīng)普遍采用的還是直接外源添加的方式。[0004]輔酶A是一種含有泛酸的輔酶，在生物體內(nèi)作為活化?；d體參與多種生物合成途徑和能量代謝反應(yīng)，并且還作為調(diào)節(jié)因子參與多種代謝反應(yīng)的調(diào)控。然而，由于輔酶A及其衍生物在生物體內(nèi)參與多種代謝反應(yīng)和調(diào)控作用，進(jìn)而影響整個代謝流的分配(例如引起乙酸和琥珀酸積累等)，其在生物體內(nèi)合成的增加或減少對后續(xù)其它產(chǎn)物合成的影響不確定。因此，目前通過提高輔酶A濃度促進(jìn)目的產(chǎn)物積累的研究和應(yīng)用較少。更沒有關(guān)于增加胞內(nèi)輔酶A對ALA合成影響的研究。
[0005]綜上所述，本領(lǐng)域急需開發(fā)從不同途徑改造ALA生產(chǎn)菌株以提高ALA產(chǎn)量的方法，從而能利用所述生產(chǎn)菌株生產(chǎn)ALA。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的主旨是提供5-氨基乙酰丙酸高產(chǎn)菌株的構(gòu)建方法以及5-氨基乙酰丙酸的高產(chǎn)菌株。
[0007]在第一方面，本發(fā)明提供一種5-氨基乙酰丙酸生產(chǎn)菌株的構(gòu)建方法，所述方法包括:
[0008]增強所述5-氨基乙酰丙酸生產(chǎn)菌株中輔酶A合成途徑關(guān)鍵酶和/或輔酶A前體合成途徑關(guān)鍵酶的活性。
[0009]在優(yōu)選的實施方式中，所述輔酶A合成途徑關(guān)鍵酶是泛酸激酶、磷酸泛酰巰基乙胺腺苷?；D(zhuǎn)移酶；優(yōu)選地，所述輔酶A合成途徑關(guān)鍵酶是泛酸激酶；所述輔酶A前體合成途徑關(guān)鍵酶是泛酸合成酶、天冬氨酸脫羧酶、3-甲基-2-氧化丁烷酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶。
[0010]在另一實施方式中，所述輔酶A合成途徑關(guān)鍵酶是泛酸激酶。
[0011]在優(yōu)選的實施方式中，所述增強酶的活性可通過以下方法之一或組合來實現(xiàn):表達(dá)該酶的同源或異源的編碼基因，和/或增加所述編碼基因的拷貝數(shù)，和/或改造所述編碼基因的啟動子以增強轉(zhuǎn)錄啟動速度，和/或修改攜帶有所述編碼基因的信使RNA的翻譯調(diào)控區(qū)以增強翻譯強度。
[0012]在優(yōu)選的實施方式中，所述方法還包括測定所得菌株的5-氨基乙酰丙酸產(chǎn)量。
[0013]在優(yōu)選的實施方式中，所述菌株本身具有5-氨基乙酰丙酸合成能力。
[0014]在優(yōu)選的實施方式中，所述菌株為大腸桿菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、球形紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)等。[0015]在優(yōu)選的實施方式中，所述菌株優(yōu)選埃希氏菌屬細(xì)菌，更優(yōu)選大腸桿菌。
[0016]在第二方面，本發(fā)明提供一種5-氨基乙酰丙酸生產(chǎn)菌株，所述菌株中輔酶A合成途徑關(guān)鍵酶和/或輔酶A前體合成途徑關(guān)鍵酶的活性增強。
[0017]在優(yōu)選的實施方式中，所述輔酶A合成途徑關(guān)鍵酶是泛酸激酶、磷酸泛酰巰基乙胺腺苷酰基轉(zhuǎn)移酶；優(yōu)選地，所述輔酶A合成途徑關(guān)鍵酶是泛酸激酶；所述輔酶A前體合成途徑關(guān)鍵酶是泛酸合成酶、天冬氨酸脫羧酶、3-甲基-2-氧化丁烷酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶。
[0018]在另一實施方式中，所述輔酶A合成途徑關(guān)鍵酶是泛酸激酶。
[0019]在優(yōu)選的實施方式中，所述菌株本身具有5-氨基乙酰丙酸合成能力。
[0020]在另一實施方式中，所述菌株選自大腸桿菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、球形紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)、或沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)。
[0021]在優(yōu)選的實施方式中，所述菌株優(yōu)選埃希氏菌屬細(xì)菌，更優(yōu)選大腸桿菌。
[0022]在優(yōu)選的實施方式中，所述菌株產(chǎn)生5-氨基乙酰丙酸的產(chǎn)量高于4g/L。
[0023]在第三方面，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生5-氨基乙酰丙酸的方法，所述方法包括:
[0024]I)培養(yǎng)本發(fā)明第二方面所述的5-氨基乙酰丙酸生產(chǎn)菌株；和/或，在本發(fā)明第二方面所述的5-氨基乙酰丙酸生產(chǎn)菌株的培養(yǎng)過程中或在普通5-氨基乙酰丙酸生產(chǎn)菌株的培養(yǎng)過程中添加外源性輔酶A合成前體，從而得到5-氨基乙酰丙酸；和
[0025]2)從I)的發(fā)酵培養(yǎng)體系中獲得5-氨基乙酰丙酸。
[0026]在優(yōu)選的實施方式中，所述輔酶A合成前體包括但不限于:泛酸、天冬氨酸、β -丙氨酸、3-甲基-2-氧化丁烷酸、2-脫氫泛解酸、泛解酸；更優(yōu)選地，所述輔酶A合成前體是泛酸。
[0027]在另一實施方式中，所述輔酶A合成前體是泛酸。
[0028]在第四方面，本發(fā)明提供本發(fā)明第二方面所述的5-氨基乙酰丙酸生產(chǎn)菌株的用途，所述菌株用于產(chǎn)生5-氨基乙酰丙酸和/或產(chǎn)生以5-氨基乙酰丙酸為前體的下游產(chǎn)物。
[0029]在優(yōu)選的實施方式中，所述以ALA為前體的下游產(chǎn)物是血紅素或維生素Β12。
[0030]應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
【具體實施方式】
[0031]根據(jù)本領(lǐng)域中現(xiàn)有的知識，發(fā)明人原先的分析預(yù)測顯示增加胞內(nèi)輔酶A/乙酰輔酶A濃度可能引起乙酸和琥珀酸等副產(chǎn)物積累，從而導(dǎo)致合成ALA的碳硫減少。然而，發(fā)明人通過對細(xì)菌代謝過程的長期研究和實踐，出乎意料地發(fā)現(xiàn)增強胞內(nèi)輔酶A合成途徑關(guān)鍵酶的活性和/或輔酶A前體合成途徑關(guān)鍵酶的活性，和/或外源性添加輔酶A的合成前體可以極大提高生產(chǎn)菌株的5-氨基乙酰丙酸產(chǎn)量，在實踐上可用于細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)ALA。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0032]術(shù)語定義
[0033]本文所用的術(shù)語“外源性”是指某體系中包含了原來不存在的物質(zhì)。例如，通過轉(zhuǎn)化等方式在某菌株中引入該菌株中原本不存在的編碼基因，則該基因?qū)τ谠摼晔恰巴庠葱浴钡摹?br> [0034]本文所用的術(shù)語“增強”是指增加、提高、增大或升高某種蛋白，例如酶的活性。鑒于本發(fā)明的教導(dǎo)和現(xiàn)有技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員也不難理解本文所用的“增強”還應(yīng)包括通過表達(dá)酶的異源編碼基因而增強其活性。在具體的實施方式中，增強酶的活性可以通過表達(dá)酶的內(nèi)源或異源性編碼基因，和/或增加所述編碼基因的拷貝數(shù)，和/或改造所述編碼基因的啟動子以增強轉(zhuǎn)錄啟動速度，和/或修改攜帶有所述編碼基因的信使RNA的翻譯調(diào)控區(qū)或稀有密碼子以增強翻譯強度，和/或修改編碼基因本身以增強mRNA穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、解除蛋白質(zhì)的反饋抑制等方法來實現(xiàn)。
[0035]輔酶A
[0036]輔酶A是一種含有泛酸的輔酶，在生物體內(nèi)作為?；d體參與多種生物合成途徑和能量代謝反應(yīng)，并且還作為調(diào)節(jié)因子參與多種代謝反應(yīng)的調(diào)控。微生物中輔酶A及其衍生物乙酰輔酶A、琥珀酰輔酶A和丙二酰輔酶A參與多達(dá)600種代謝反應(yīng)，同時也是合成具有重要應(yīng)用價值的精細(xì)化學(xué)品的前體。例如，乙酰輔酶A是體內(nèi)糖代謝的重要中間代謝產(chǎn)物并參與酯類和脂 質(zhì)等多種化合物的生物合成，其縮合產(chǎn)物乙酰乙酰輔酶A參與合成聚-β -羥丁酸，而其羧化產(chǎn)物丙二酰輔酶A參與萜類化合物的合成。輔酶A是以泛酸為底物通過5步酶促反應(yīng)合成，而催化泛酸磷酸化合成4-磷酸泛酸的泛酸激酶是其限速酶，受終產(chǎn)物輔酶A的反饋調(diào)控。研究表明增強泛酸激酶的表達(dá)并在培養(yǎng)基中添加泛酸可以有效提高胞內(nèi)輔酶A/乙酰輔酶A的含量，并引起胞內(nèi)代謝流的變化導(dǎo)致乙酸積累(Vadali R, et al.Metabolic Engineering2004(6): 133-139)。因此，通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)輔酶A/乙酰輔酶A的濃度或比率可以調(diào)控碳代謝，促進(jìn)胞內(nèi)代謝流的重新分配。Vadali等研究發(fā)現(xiàn)通過表達(dá)泛酸激酶可以提高胞內(nèi)乙酰輔酶A的含量，促進(jìn)乙酸異戊酯的積累(Vadali R, et al.Metabolic Engineering2004 (6): 294-299)。Lin 等研究發(fā)現(xiàn)泛酸激酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶或丙酮酸羧化酶共表達(dá)可以進(jìn)一步提高琥珀酸的產(chǎn)量(Lin.H, etal.Biotechnol.Prog2004:1599-1604)。
[0037]然而，由于生物體內(nèi)的代謝是一復(fù)雜的、動態(tài)平衡的網(wǎng)絡(luò)，輔酶A及其衍生物在生物體內(nèi)參與多種代謝反應(yīng)和調(diào)控作用，進(jìn)而影響整個代謝流的分配(例如引起乙酸和琥珀酸積累等)，其在生物體內(nèi)合成的增加或減少對后續(xù)其它產(chǎn)物合成的影響不確定。例如，其在生物體內(nèi)合成增加對某種后續(xù)產(chǎn)物產(chǎn)生有利的影響，但亦可能對其他產(chǎn)物的合成存在不利影響。因此，目前通過提高輔酶A濃度促進(jìn)目的產(chǎn)物積累的研究和應(yīng)用較少。目前還沒有關(guān)于增加胞內(nèi)輔酶A/乙酰輔酶A濃度對ALA合成影響的研究。
[0038]輔酶A合成途徑關(guān)鍵酶[0039]本文所述的“輔酶A合成途徑關(guān)鍵酶”表示微生物中產(chǎn)生輔酶A的具體途徑中涉及的各種酶，包括但不限于:泛酸激酶、磷酸泛酰巰基乙胺腺苷?；D(zhuǎn)移酶。在優(yōu)選的實施方式中，本文所述的輔酶A合成途徑關(guān)鍵酶是泛酸激酶。類似地，本文所用的術(shù)語“增強輔酶A合成途徑關(guān)鍵酶的活性”是指增強涉及輔酶A合成途徑的相關(guān)酶，例如泛酸合成酶、天冬氨酸脫羧酶、3-甲基-2-氧化丁烷酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的活性。
[0040]輔酶A合成前體
[0041]本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，“前體”表示在代謝途徑中位于另一化合物之前的一種化合物。在微生物的生物合成過程中，有些化合物能直接被微生物利用構(gòu)成產(chǎn)物分子結(jié)構(gòu)的一部分，這些物質(zhì)稱為前體。前體必須通過產(chǎn)生菌的生物合成途徑，才能滲入到產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)中。因此，本文所述的“輔酶A合成前體”表示在輔酶A的生物合成過程中，能直接用于構(gòu)成輔酶A分子結(jié)構(gòu)的一部分的化合物。 [0042]在具體的實施方式中，所述輔酶A合成前體包括但不限于:泛酸、天冬氨酸、β -丙氨酸、3-甲基-2-氧化丁烷酸、2-脫氫泛解酸、泛解酸；更優(yōu)選地，所述輔酶A合成前體是泛酸。
[0043]類似地，本文所述的“輔酶A前體合成途徑關(guān)鍵酶”表示微生物中產(chǎn)生輔酶A前體，例如泛酸、天冬氨酸、β -丙氨酸、3-甲基-2-氧化丁烷酸、2-脫氫泛解酸、泛解酸的具體途徑中涉及的各種酶，包括但不限于:所述泛酸合成酶、天冬氨酸脫羧酶、3-甲基-2-氧化丁烷酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶。
[0044]本發(fā)明的5-氨基乙酰丙酸生產(chǎn)菌株
[0045]本發(fā)明提供一種5-氨基乙酰丙酸生產(chǎn)菌株，所述菌株中輔酶A合成途徑關(guān)鍵酶和/或輔酶A前體合成途徑關(guān)鍵酶的活性增強。
[0046]在具體的實施方式中，所述菌株本身可以具有一定5-氨基乙酰丙酸合成能力。
[0047]本領(lǐng)域技術(shù)人員知道許多菌株可以用于產(chǎn)生5-氨基乙酰丙酸。這些菌株雖然不同，但它們合成5-氨基乙酰丙酸的合成體系、途徑卻是類似的。因此，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員鑒于本發(fā)明的教導(dǎo)和現(xiàn)有技術(shù)可以明白，本發(fā)明的菌株可以是任何可用于產(chǎn)生5-氨基乙酰丙酸的菌株,包括但不限于:大腸桿菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、球形紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)等。在具體的實施方式中，所述菌株優(yōu)選埃希氏菌屬細(xì)菌，更優(yōu)選大腸桿菌。
[0048]本發(fā)明的菌株具有較高的5-氨基乙酰丙酸生產(chǎn)能力，例如，在具體的實施方式中，所述菌株產(chǎn)生5-氨基乙酰丙酸的產(chǎn)量高于4g/L。
[0049]5-氨基乙酰丙酸生產(chǎn)菌株的構(gòu)建
[0050]基于發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)增強胞內(nèi)輔酶A合成途徑關(guān)鍵酶的活性和/或外源性添加輔酶A的合成前體可以極大提高生產(chǎn)菌株的5-氨基乙酰丙酸產(chǎn)量，本發(fā)明進(jìn)一步提供一種5-氨基乙酰丙酸生產(chǎn)菌株的構(gòu)建方法，所述方法包括:增強所述5-氨基乙酰丙酸生產(chǎn)菌株中輔酶A合成途徑關(guān)鍵酶和/或輔酶A前體合成途徑關(guān)鍵酶的活性；或?qū)胪庠葱缘妮o酶A合成途徑關(guān)鍵酶和/或輔酶A前體合成途徑關(guān)鍵酶。
[0051]在具體的實施方式中，所述增強酶的活性可通過以下方法之一或組合來實現(xiàn):表達(dá)同源或異源的該酶的編碼基因，和/或增加所述菌株中所述編碼基因的拷貝數(shù)，和/或改造所述編碼基因的啟動子以增強轉(zhuǎn)錄啟動速度，和/或修改攜帶有所述編碼基因的信使RNA的翻譯調(diào)控區(qū)以增強翻譯強度。
[0052]在另一具體的實施方式中，所述方法還包括測定所得菌株的5-氨基乙酰丙酸產(chǎn)量。
[0053]基于上文所述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，本發(fā)明的5-氨基乙酰丙酸生產(chǎn)菌株的構(gòu)建方法適用于上述多種菌株。
[0054]鑒于本發(fā)明的教導(dǎo)和現(xiàn)有技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)明白本發(fā)明是通過增強起始菌株中輔酶A合成途徑關(guān)鍵酶和/或輔酶A前體合成途徑關(guān)鍵酶的活性，導(dǎo)入外源性的輔酶A合成途徑關(guān)鍵酶和/或輔酶A前體合成途徑關(guān)鍵酶來提高所述菌株產(chǎn)生5-氨基乙酰丙酸的能力。因此，只要通過以上手段來構(gòu)建或改造菌株，進(jìn)而提高5-氨基乙酰丙酸產(chǎn)量的方法或由此得到的菌株均應(yīng)落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)，本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于實施例中采用的具體方法和得到的菌株。
[0055]5-氨基乙酰丙酸的生產(chǎn)方法
[0056]在本發(fā)明人出乎意料的發(fā)現(xiàn)以及本發(fā)明構(gòu)建菌株的方法和獲得的菌株的基礎(chǔ)上，本發(fā)明進(jìn)一步提供產(chǎn)生5-氨基乙酰丙酸的方法，所述方法包括:1)培養(yǎng)本發(fā)明構(gòu)建的菌株，從而得到5-氨基乙酰丙酸；和2)從I)的發(fā)酵培養(yǎng)體系中獲得5-氨基乙酰丙酸。
[0057]此外，發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)可以通過外源性添加輔酶A的合成前體來提高生產(chǎn)菌株的5-氨基乙酰丙酸產(chǎn)量。在具體的實施方式中，所述輔酶A合成前體包括但不限于:泛酸、天冬氨酸、丙氨酸、3-甲基-2-氧化丁烷酸、2-脫氫泛解酸、泛解酸；更優(yōu)選地，所述輔酶A合成前體是泛酸。
[0058]因此，鑒于本發(fā)明的教導(dǎo)和現(xiàn)有技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)知道通過外源性添加輔酶A的合成前體來提高生產(chǎn)菌株的5-氨基乙酰丙酸產(chǎn)量的方法也適用于普通菌株，即，其中輔酶A合成途徑關(guān)鍵酶和/或輔酶A前體合成途徑關(guān)鍵酶的活性未得到增強；或未包含外源性的輔酶A合成途徑關(guān)鍵酶和/或輔酶A前體合成途徑關(guān)鍵酶的5-氨基乙酰丙酸生產(chǎn)菌株。在更進(jìn)一步的實施方式中，通過外源性添加輔酶A的合成前體來提高生產(chǎn)菌株的5-氨基乙酰丙酸產(chǎn)量的方法還可與本發(fā)明構(gòu)建菌株的方法聯(lián)用，即，在本發(fā)明構(gòu)建的菌株的發(fā)酵生產(chǎn)過程中外源性添加輔酶A的合成前體來進(jìn)一步提高5-氨基乙酰丙酸的產(chǎn)量。
[0059]在優(yōu)選的實施方式中，所述方法獲得的5-氨基乙酰丙酸的產(chǎn)量高于4g/L。
[0060]本發(fā)明的5-氨基乙酰丙酸高產(chǎn)菌株的用途
[0061]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)明白，本發(fā)明的5-氨基乙酰丙酸高產(chǎn)菌株不僅可用于產(chǎn)生5-氨基乙酰丙酸，還可用于產(chǎn)生以5-氨基乙酰丙酸為前體的衍生物，例如血紅素或VB12。
[0062]本發(fā)明的優(yōu)點:
[0063]1.本發(fā)明菌株的5-氨基乙酰丙酸產(chǎn)量大大提高；
[0064]2.本發(fā)明發(fā)現(xiàn)增強胞內(nèi)輔酶A合成途徑關(guān)鍵酶的活性和/或輔酶A前體合成途徑關(guān)鍵酶的活性，和/或外源性添加輔酶A的合成前體可以極大提高生產(chǎn)菌株的5-氨基乙酰丙酸產(chǎn)量，從而為工程改造5-氨基乙酰丙酸生產(chǎn)菌株或優(yōu)化5-氨基乙酰丙酸生產(chǎn)菌株的生產(chǎn)工藝提供了新的思路；
[0065]3.本發(fā)明構(gòu)建5-氨基乙酰丙酸高產(chǎn)菌株的方法可與培養(yǎng)條件的優(yōu)化結(jié)合起來從而進(jìn)一步提高5-氨基乙酰丙酸的產(chǎn)量。[0066]下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克隆:實驗室手冊(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。
[0067]除非另有定義，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的意義相同。雖然可利用與本文所述相似或等價的任何方法和材料來實施或檢驗本發(fā)明，但優(yōu)選本文所述的方法和材料。
[0068]材料與方法
[0069]本發(fā)明實施例所用的DNA聚合酶購自北京全式金公司的Fastpfu ;限制性內(nèi)切酶及DNA連接酶等均購自Fermentas公司；
[0070]酵母粉和蛋白胨購自英國Oxoid公司產(chǎn)品；甘氨酸和IPTG購自Promega公司；ALA和對二甲氨基苯甲醛等購自Sigma公司；瓊脂粉和抗生素購自北京索來寶；葡萄糖、冰醋酸、高氯酸、三氯乙酸、乙酰丙酮、氯仿以及其他常用化學(xué)試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
[0071]質(zhì)粒提取試劑盒和瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒均購自上海生工生物工程股份有限公司，相關(guān)操作均嚴(yán)格按照說明書執(zhí)行；
[0072]質(zhì)粒構(gòu)建測序驗證由華大基因完成；
[0073]DH5a感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金公司。
[0074]LB培養(yǎng)基成分:酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaC`110g/L,固體培養(yǎng)基中添加2%的瓊脂粉。
[0075]抗生素濃度為:氨節(jié)青霉素100 μ g/mL,氯霉素30 μ g/mL。
[0076]ALA的檢測方法:200 μ L稀釋的發(fā)酵液加入100 μ L ρΗ4.6乙酸鈉緩沖液，然后加入5μ L乙酰丙酮，100 °C水浴溫育15min,冷卻至室溫后加入等體積的Ehrlish’ s試劑(42mL冰醋酸，8mL70%高氯酸，Ig 二甲氨基苯甲醒)混勻，顯色I(xiàn)Omin后測553nm波長下的吸光度。
[0077]葡萄糖分析方法采用山東科學(xué)院生產(chǎn)的SBA-40D生物傳感分析儀進(jìn)行檢測。
[0078]實施例1.泛酸激酶表達(dá)載體構(gòu)建
[0079]根據(jù)NCBI公布的大腸桿菌MG1655的基因組序列設(shè)計引物coaA_F(引物序列:GCTCTAGAttgacggctagctcagtcctaggtacagtgctagcAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAGTATAAAAGAGCAAAC ；SEQ ID NO:1)和 coaA-R(引物序列:CGGAATTCAGAAAGGGGAGTATTCGCTC ;SEQ IDNO:2)，并在上游引物添加BioBrick中啟動子BBa_J23100和Xba I酶切位點，在下游引物添加EcoR I酶切位點。以大腸桿菌MG1655基因組為模板PCR擴增得到帶有組成型啟動子的 coaA 基因片段，PCR 擴增參數(shù)為 94°C 2min ；94°C 20s, 60°C 20s, 72°C lmin，循環(huán) 30 次；72°C延伸5min。coaA基因片段回收后用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xba I處理，然后與同樣處理的pZCA9載體連接，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有氯霉素的LB平板，挑取陽性克隆提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切驗證，測序正確的重組質(zhì)粒命名為ΡΖΡΑ10。
[0080]實施例2.MG1655/pZPA6菌株的構(gòu)建
[0081]2.1磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc和ALA合成酶共表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0082]根據(jù)NCBI公布的大腸桿菌MG1655的基因組序列設(shè)計引物ppc_F (CCGCAAGCTTTATCCGACCTACACCTTTGG ；SEQ ID N0:3)和ppc-R(CCGCMGCTTGGACTTCTGTGGAATGCATAGT;SEQ IDNO:4)，以大腸桿菌MG1655基因組為模板PCR擴增得到帶有自身啟動子的ppc基因片段，PCR 擴增參數(shù)為 94°C 2min ；94°C 20s, 60°C 20s, 72°C 1.5min，循環(huán) 30 次；72°C 延伸 5min。ppc基因片段回收后用Hind III處理，同時將攜帶有ALA合成酶的質(zhì)粒pZGA24(pZGA24構(gòu)建參見參考文獻(xiàn):郭小飛等，利用5-氨基乙酰丙酸脫水酶缺失的重組大腸桿菌合成5-氨基乙酰丙酸，天津科技大學(xué)學(xué)報，2012，27 (4):1-6)也用該酶處理，載體和片段回收后用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有Amp的LB平板，挑取陽性克隆提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切驗證，測序正確的重組質(zhì)粒命名為ΡΖΡΑ6。
[0083]2.2.重組菌株 MG1655/pZPA6 的構(gòu)建
[0084]將上述構(gòu)建的重組質(zhì)粒pZPA6轉(zhuǎn)化野生型大腸桿菌MG1655，涂布Amp抗性LB平板，過夜培養(yǎng)后挑取陽性克隆提取質(zhì)粒驗證，獲得重組菌株MG1655/pZPA6。
[0085]實施例3.增強輔酶A供給對ALA合成的影響
[0086]為了驗證表達(dá)泛酸激酶及增強輔酶A供給對ALA合成的影響，分別將ρΖΡΑΙΟ及其對照空載體PZCA9轉(zhuǎn)入MG1655/pZPA6菌株中，感受態(tài)細(xì)胞制備和轉(zhuǎn)化過程參考J.薩姆布魯克(Sambrook)等編寫的《分子克隆實驗指南》。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布氨節(jié)抗性和氯霉素抗性的LB平板，過夜培養(yǎng)后挑取陽性克隆提取質(zhì)粒驗證，分別獲得重組菌株MG1655/pZPA6/ρΖΡΑΙΟ 和 MG1655/pZPA6/pZCA9。
[0087]將上述重組菌單菌落分別接種5mL含有100 μ g/mL氨節(jié)青霉素和30 μ g/mL氯霉素的LB液體培養(yǎng)基，37 0C，220rpm培養(yǎng)12h。按照初始OD6tltl為0.05轉(zhuǎn)接裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶，370C，220rpm培養(yǎng)2.5h后加入終濃度為50 μ M的IPTG，誘導(dǎo)培養(yǎng)24h后收集發(fā)酵液，檢測ALA的濃度。其中發(fā)酵培養(yǎng)基為添加了少量酵母粉的M9培養(yǎng)基，主要成分為=Na2HPO4.12Η2017.lg/L，ΚΗ2Ρ043.0g/L，NaC10.5g/L，NH4Cll.0g/L,MgS042mM, CaCl20.1mM,葡萄糖15g/L,酵母粉2g/L,甘氨酸4g/L,氨節(jié)青霉素100 μ g/mL和氯霉素30 μ g/mL。ALA的檢測方法如“材料與方法”部分所述。同時，為了驗證添加外源添加泛酸對輔酶A及ALA合成的影響，上述重組菌同時轉(zhuǎn)接含有5mM泛酸鈣的發(fā)酵培養(yǎng)基，相同處理后檢測發(fā)酵液中ALA的濃度。
[0088]重組菌發(fā)酵結(jié)果見表1，在不添加泛酸的發(fā)酵培養(yǎng)基中，對照菌株MG1655/pZPA6/PZCA9發(fā)酵24h后ALA的產(chǎn)量為2.59g/L，表達(dá)泛酸激酶后ALA的產(chǎn)量達(dá)到3.04g/L，比對照菌株提高了 17%。當(dāng)在培養(yǎng)基中外源添加泛酸后，上述重組菌ALA的產(chǎn)量分別達(dá)到3.67g/L和4.12g/L，分別比對照組提高了 42%和36%，而同時表達(dá)泛酸激酶并外源添加泛酸的條件下ALA產(chǎn)量比對照組提高了 59%，效果非常顯著。上述結(jié)果表明通過表達(dá)泛酸激酶和/或外源添加泛酸的方法增強輔酶A的合成有利于提高ALA的產(chǎn)量。
[0089]表1重組菌搖瓶發(fā)酵結(jié)果
[0090]
【權(quán)利要求】
1.一種5-氨基乙酰丙酸生產(chǎn)菌株的構(gòu)建方法，所述方法包括: 增強所述5-氨基乙酰丙酸生產(chǎn)菌株中輔酶A合成途徑關(guān)鍵酶和/或輔酶A前體合成途徑關(guān)鍵酶的活性。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述輔酶A合成途徑關(guān)鍵酶是泛酸激酶。
3.一種5-氨基乙酰丙酸生產(chǎn)菌株，所述菌株中輔酶A合成途徑關(guān)鍵酶和/或輔酶A前體合成途徑關(guān)鍵酶的活性增強。
4.如權(quán)利要求3所述的5-氨基乙酰丙酸生產(chǎn)菌株，其特征在于，所述輔酶A合成途徑關(guān)鍵酶是泛酸激酶。
5.如權(quán)利要求3或4所述的5-氨基乙酰丙酸生產(chǎn)菌株，其特征在于，所述菌株選自大腸桿菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、球形紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)、或沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)。
6.—種產(chǎn)生5-氨基乙酰丙酸的方法，所述方法包括: 1)培養(yǎng)權(quán)利要求3-5中任一項所述的5-氨基乙酰丙酸生產(chǎn)菌株；和/或，在權(quán)利要求3-5中任一項所述的5-氨基乙酰丙酸生產(chǎn)菌株的培養(yǎng)過程中或在普通5-氨基乙酰丙酸生產(chǎn)菌株的培養(yǎng)過程中添加外源性輔酶A合成前體，從而得到5-氨基乙酰丙酸；和 2)從I)的發(fā)酵培養(yǎng)體系中獲得5-氨基乙酰丙酸。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述輔酶A合成前體是泛酸。
8.權(quán)利要求3-5中任一項所述的5-氨基乙酰丙酸生產(chǎn)菌株的用途，所述菌株用于產(chǎn)生5-氨基乙酰丙酸和/或產(chǎn)生以5-氨基乙酰丙酸為前體的下游產(chǎn)物。
【文檔編號】C12P19/42GK103710374SQ201410015848
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2014年1月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月14日
【發(fā)明者】鄭平, 陳久洲, 蒲偉, 孫際賓, 馬延和 申請人:中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所