一種產(chǎn)超高光學(xué)純度r,r-2,3-丁二醇基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種產(chǎn)R,R-2,3-丁二醇基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，該基因工程菌株的命名為重組多粘類芽孢桿菌CGMCC3044--dar-。dar為丁二酮還原酶基因，通過同源重組雙交換，敲除多粘類芽孢桿菌CGMCC3044中的dar基因獲得菌株重組多粘類芽孢桿菌CGMCC3044-dar-。通過上述方法構(gòu)建的重組菌能發(fā)酵合成超高光學(xué)純度R,R-2,3-丁二醇，光學(xué)純度高達(dá)100%，無光學(xué)副產(chǎn)物meso-2,3-丁二醇，該菌株能直接利用菊芋菊粉、葡萄糖、3-羥基丁酮等底物，培養(yǎng)條件粗放，操作方便簡單，光學(xué)純度高，生產(chǎn)成本低，有利于大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】—種產(chǎn)超高光學(xué)純度R, R-2, 3- 丁二醇基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，具體涉及一種產(chǎn)超高光學(xué)純度(≥99.9%) R, R-2, 3_ 丁二醇基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]2，3- 丁二醇屬于典型的生物基化學(xué)品，存在3個旋光異構(gòu)體，分別為R，R型(D型)、S，S型(L型)和meso型(內(nèi)消旋型LR，R-2, 3-丁二醇是一種新興的微生物四碳手性醇，具有獨特的光學(xué)等理化性質(zhì)。超高光學(xué)純度O 99.9%)的R，R-2, 3-丁二醇可用于合成丁三醇-對甲苯磺酸酯，丁三醇-對甲苯磺酸酯是合成藥物阿司匹林的關(guān)鍵中間體。超高光學(xué)純度的R，R-2, 3- 丁二醇還可以用于合成光學(xué)活性的2-甲基-1，4- 丁二醇，2-甲基-1，4- 丁二醇及其衍生物是合成各種手性近晶型聚酯液晶材料及手性天然生物活性物質(zhì)的重要中間體。隨著R，R-2, 3- 丁二醇的發(fā)酵技術(shù)不斷提高和完善，超高光學(xué)純度R，R-2, 3- 丁二醇在手性產(chǎn)品的合成路線改進(jìn)和新型手性產(chǎn)品的開發(fā)等手性合成領(lǐng)域中的作用日趨顯著。此外，R, R-2, 3- 丁二醇還是優(yōu)良的抗凍劑(R，R-2, 3- 丁二醇的凝固點低達(dá)_60°C )，添加到液體燃料里，燃料在_40°C也不會凝固。
[0003]化學(xué)法合成超高光學(xué)純度手性R，R-2, 3- 丁二醇，除需特殊的合成路徑，還需手性拆分，手段尤為復(fù)雜，難以實現(xiàn)大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。自然界某些酵母菌(Saccharomycescerevisiae)雖然能夠體內(nèi)代謝合成R，R-2, 3_ 丁二醇，但由于發(fā)酵制備R，R-2, 3- 丁二醇產(chǎn)量極低(最高產(chǎn)量大約0.09g L—1)，缺乏實際應(yīng)用價值，因此，一些特殊的多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa,也稱Bacillus polymyxa)是目前唯一具備工業(yè)化生產(chǎn)R，R-2, 3- 丁二醇潛力的微生物。
[0004]P.polymyxa代謝合 成R, R-2, 3_ 丁二醇時，總是伴隨合成少量的meso-2，3_ 丁二醇，且pH、溶氧、底物的流加速率等外源發(fā)酵條件的變動常導(dǎo)致副產(chǎn)物的meso-2，3- 丁二醇的含量發(fā)生明顯變化。在發(fā)酵液中，R，R-2, 3-丁二醇的光學(xué)純度約為90-98%，meso-2，3-丁二醇的光學(xué)純度約為2-10%。當(dāng)R，R_2，3-丁二醇用于手性產(chǎn)品的合成時，一般要求其應(yīng)達(dá)到99.9%以上的超高光學(xué)純度，否則將不適合制備手性物質(zhì)。通過優(yōu)化發(fā)酵工藝條件，雖然能提高R，R-2, 3- 丁二醇的光學(xué)純度，但是光學(xué)純度仍難達(dá)到99.9%以上這個標(biāo)準(zhǔn)，且常常引起R，R-2, 3- 丁二醇產(chǎn)量下降。而用手性分離法提取R，R-2, 3- 丁二醇時，存在操作繁瑣，難度大，成本高等缺陷，導(dǎo)致R，R-2, 3- 丁二醇的市場價格居高不下，極大地限制了R, R-2, 3- 丁二醇的工業(yè)化應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]發(fā)明目的:為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明所要解決的第一個技術(shù)問題是提供一種產(chǎn)超高光學(xué)純度O 99.9%) R, R-2, 3- 丁二醇基因工程菌。
[0006]本發(fā)明所要解決的第二個技術(shù)問題是提供上述產(chǎn)超高光學(xué)純度R，R-2, 3- 丁二醇基因工程菌的構(gòu)建方法。
[0007]本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問題是提供上述產(chǎn)超高光學(xué)純度R，R-2, 3- 丁二醇基因工程菌的應(yīng)用。
[0008]技術(shù)方案:為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0009]一種產(chǎn)超高光學(xué)純度R，R-2, 3- 丁二醇基因工程菌，該工程菌是通過下列方法構(gòu)建得到:利用PCR技術(shù)從多粘類芽孢桿菌CGMCC3044中擴(kuò)增出丁二酮還原酶基因dar，5’端39bp堿基序列構(gòu)成同源臂I，3’端20bp堿基序列構(gòu)成同源臂II，通過多克隆位點將同源臂I和同源臂II分別串聯(lián)到攜帶入如(1同源重組序列克隆粘粒5即虹(:08-1/PIJ790的oriT復(fù)制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因ApraK序列的兩端，得到含“dar同源臂1-oriT-ApraK_dar同源臂II”序列的重組粘?！癝uperCos-l/pIJ790_dar同源臂1-oriT-ApraE-dar同源臂II ”,重組粘粒轉(zhuǎn)化多粘類芽孢桿菌CGMCC3044，并在λ Red介導(dǎo)下與多粘類芽孢桿菌CGMCC3044發(fā)生同源重組雙交換，得到重組的多粘類芽孢桿菌，即產(chǎn)超高光學(xué)純度R，R-2, 3- 丁二醇基因工程菌CGMCC3044-dar_。
[0010]其中，SuperCos_l/pIJ790中 SuperCos-1 為粘粒；質(zhì)粒 pIJ790 攜帶 λ Red 同源重組序列、oriT復(fù)制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因ApraK等序列。
[0011]該基因工程菌通過下列方法構(gòu)建得到:
[0012](I)基因dar的克隆:根據(jù)Genebank公布的多粘類芽孢桿菌ATCC12321中dar基因的序列設(shè)計合成PCR所需的引物:
[0013]Pl:5，-ATGGAACTTAAAAACAAAACAGCC-3’
[0014]P2:5’ -CTGT`GGGTTGGTTGTCCAAAT-3’
[0015]以多粘類芽孢桿菌CGMCC3044基因組為模板完成PCR反應(yīng):PCR反應(yīng)條件:94°C變性 5min，經(jīng) 94°C 30s, 56°C 30s, 72°C lmin，共 32 個循環(huán)，再經(jīng)過 72°C延伸 lOmin，獲得的 PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分析確認(rèn)，經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后，與pMD18-T載體連接，進(jìn)行序列測定，獲得來源于多粘類芽孢桿菌CGMCC3044的丁二酮還原酶基因，即dar基因；
[0016](2)重組粘粒 “SuperCos-l/pIJ790_dar 同源臂 1-oriT_ApraK-dar 同源臂 II ” 的構(gòu)建:在dar的5’端39bp堿基序列的兩端分別引入EcoR I,Xho I，得到dar同源臂I ;在dar的3，端20bp堿基序列的兩端分別引入Not I,BamH I,得到dar同源臂II ;將上述dar同源臂I和dar同源臂II分別連接至攜帶ARed同源重組序列的克隆粘粒SuperCos-1/PIJ790的oriT復(fù)制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因ApraK序列的兩端，得到含“dar同源臂 1-oriT-ApraK_dar 同源臂 II” 序列的重組粘粒 SuperCos_l/pIJ790 ；
[0017](3)重組基因工程菌的獲得:將重組粘?！癝uperCos-l/pIJ790-dar同源臂1-oriT-ApraE-dar同源臂II ”轉(zhuǎn)化多粘類芽孢桿菌CGMCC3044，涂布含40 μ g/mL阿泊拉霉素平板，挑取陽性重組子，并進(jìn)行菌落PCR鑒定，得到重組多粘類芽孢桿菌，命名為CGMCC3044-dar_。
[0018]其中，該方法包括下列步驟:利用PCR技術(shù)從多粘類芽孢桿菌CGMCC3044中擴(kuò)增出丁二酮還原酶基因dar，5’端39bp堿基序列構(gòu)成同源臂I，3’端20bp堿基序列構(gòu)成同源臂II，通過多克隆位點將同源臂I和同源臂II分別串聯(lián)到攜帶ARed同源重組序列克隆粘粒SuperCos-l/pIJ790的oriT復(fù)制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因ApraK序列的兩端,得到含“dar同源臂1-oriT-ApraK-dar同源臂II ”序列的重組粘粒SuperCos_l/pIJ790,重組粘粒轉(zhuǎn)化CGMCC3044，并在λ Red介導(dǎo)下與宿主菌發(fā)生同源重組雙交換，得到重組的多粘類芽孢桿菌，即產(chǎn)超高光學(xué)純度R，R-2, 3- 丁二醇基因工程菌CGMCC3044-dar_。
[0019]其中，上述產(chǎn)超高光學(xué)純度R，R-2, 3- 丁二醇基因工程菌的構(gòu)建方法包括下列步驟:(1)基因dar的克隆:根據(jù)Genebank公布的多粘類芽孢桿菌ATCC12321中dar基因的序列設(shè)計合成PCR所需的引物:
[0020]Pl:5，-ATGGAACTTAAAAACAAAACAGCC-3’
[0021]P2:5’ -CTGTGGGTTGGTTGTCCAAAT-3’
[0022]以多粘類芽孢桿菌CGMCC3044基因組為模板完成PCR反應(yīng):PCR反應(yīng)條件:94°C變性 5min，經(jīng) 94°C 30s, 56°C 30s, 72°C lmin，共 32 個循環(huán)，再經(jīng)過 72°C延伸 lOmin，獲得的 PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分析確認(rèn)，經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后，與pMD18-T載體連接，進(jìn)行序列測定，獲得來源于多粘類芽孢桿菌CGMCC3044的丁二酮還原酶基因，即dar基因；
[0023](2)重組粘粒 “SuperCos-l/pIJ790_dar 同源臂 1-oriT-ApraK_dar 同源臂 II ” 的構(gòu)建:在dar的5’端39bp堿基序列的兩端分別引入EcoR I,Xho I，得到dar同源臂I ;在dar的3，端20bp堿基序列的兩端分別引入Not I,BamH I,得到dar同源臂II ;將上述dar同源臂I和dar同源臂II分別連接至攜帶ARed同源重組序列的克隆粘粒SuperCos-1/PIJ790的oriT復(fù)制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因ApraK序列的兩端，得到含“dar同源臂 1-oriT-ApraK_dar 同源臂 II” 序列的重組粘粒 SuperCos_l/pIJ790 ；
[0024](3)重組基因工程菌的獲得:將重組粘?！癝uperCos-l/pI J790_dar同源臂
1-oriT-ApraE-dar同源臂I I ”轉(zhuǎn)化多粘類芽孢桿菌CGMCC3044，涂布含40 μ g/mL阿泊拉霉素平板，挑取陽性重組子，并進(jìn)行菌落PCR鑒定，得到重組多粘類芽孢桿菌，命名為CGMCC3044-dar_。
[0025]上述的產(chǎn)超高光學(xué)純度R，R-2，3- 丁二醇基因工程菌CGMCC3044_dar_在生產(chǎn)R, R-2, 3-丁二醇中的應(yīng)用。
[0026]上述應(yīng)用，將構(gòu)建的基因工程菌CGMCC3044_dar_接種于含碳源、氮源和無機(jī)鹽的無菌培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)酵生產(chǎn)超高光學(xué)純R，R-2, 3- 丁二醇，其中，所述碳源為未經(jīng)任何水解處理的菊芋菊粉粗提液。
[0027]上述的應(yīng)用，該基因工程菌直接以菊芋菊粉粗提液為底物生產(chǎn)超高光學(xué)純度R, R-2, 3- 丁二醇，具體生產(chǎn)工藝為:
[0028](I)出發(fā)菌株:重組多粘類芽孢桿菌CGMCC3044-dar_ ；
[0029](2)種子培養(yǎng)基:(NH4) 2ΗΡ040.5-2.0g/L, KC10.10-0.3g/L, MgSO4.7Η200.1-0.3g/L,酵母膏0.l-0.3g/L，葡萄糖2.0-8.0g/L,菊芋菊粉粗提液含菊粉1.0-3.0g/L,阿泊拉霉素20-40 μ g/mL ；
[0030]種子培養(yǎng):1000mL三角瓶，裝液量200mL，培養(yǎng)溫度30-37 °C，搖床轉(zhuǎn)速120-200rpm，培養(yǎng) 12_36h ；
[0031](3)發(fā)酵培養(yǎng):培養(yǎng)基組成:菊芋菊粉粗提液含菊粉20.0-60.0g/L,(NH4)2HPO40.5-2.0g/L, KC10.10-0.3g/L, MgSO4.7Η200.1-0.3g/L，酵母膏 3.0-8.0g/L,阿泊拉霉素 20-40 μ g/mL ；
[0032]培養(yǎng)條件:接種量10v/v%，發(fā)酵溫度30_37°C，pH6.0-8.0，控制氧氣的通入量，接種后發(fā)酵前24h,控制轉(zhuǎn)速240-320rpm,發(fā)酵24h后,控制轉(zhuǎn)速80_160rpm,維持微氧環(huán)境發(fā)酵，搖瓶發(fā)酵，或批式發(fā)酵，或分批補(bǔ)料發(fā)酵，流加補(bǔ)料菊粉維持菊粉濃度在30.0±1.0g/L,補(bǔ)料后底物共約60-120g/L。
[0033]其中，本發(fā)明人實驗室選育并保藏的微生物菌株為能產(chǎn)菊粉酶的多粘芽孢桿菌(paenibacillus polymyxa) CGMCC N0.3044,目前該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏單位地址:北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，登記入冊的編號是CGMCC N0.3044，保藏日期是:2009年4月29日。以此菌作為出發(fā)菌株。該菌株相應(yīng)的專利的申請日為2009年6月I日，專利號為ZL200910026807.1。
[0034]有益效果:
[0035]本發(fā)明在于提供一種新型基因工程菌，用于發(fā)酵產(chǎn)超高光學(xué)純度O 99.9%)R，R-2, 3- 丁二醇，該菌在微氧條件下直接利用未經(jīng)處理的菊芋菊粉粗提液高效發(fā)酵產(chǎn)超高光學(xué)純度R，R-2, 3- 丁二醇，突破了傳統(tǒng)發(fā)酵難以獲得超高光學(xué)純度R，R-2, 3- 丁二醇和低效率生產(chǎn)超高光學(xué)純度R，R_2，3-丁二醇的局限。研究發(fā)現(xiàn)能夠代謝合成R，R-2, 3- 丁二醇的菌種在菌體內(nèi)通過氧化還原酶系將前體化合物即羰基化合物逐步還原成R，R-2, 3- 丁二醇(光學(xué)純度約為90-98%)過程中，總是伴隨合成光學(xué)純度約為2-10%的副產(chǎn)物meso-2，3- 丁二醇，通過控制溶氧、添加還原性物質(zhì)、調(diào)節(jié)pH等優(yōu)化發(fā)酵工藝條件，R, R-2, 3- 丁二醇仍難達(dá)到99.9%以上超高光學(xué)純度，從而無法用于制備手性液晶材料等手性產(chǎn)品，而進(jìn)一步用手性拆分法制備R，R-2, 3- 丁二醇，存在操作繁瑣，難度大，成本高，產(chǎn)量低等缺陷，上述因素導(dǎo)致R，R-2, 3- 丁二醇的市場價格居高不下，極大地限制了 R，R-2，3-丁二醇的工業(yè)化應(yīng)用。與原始多粘類芽孢桿菌相比，重組菌株發(fā)酵液中R，R-2, 3-丁二醇的光學(xué)純度可達(dá)100%，且產(chǎn)量也得到了明顯提高。與目前文獻(xiàn)所報道發(fā)酵后利用手性拆分生產(chǎn)超高光學(xué)純度R，R-2, 3- 丁二醇方法相比，不僅重組菌產(chǎn)超高光學(xué)純度R，R-2, 3- 丁二醇穩(wěn)定性和產(chǎn)物濃度均較高，而且發(fā)酵后無需手性拆分等分離手段即可獲得100%的超高光學(xué)純度R，R-2, 3- 丁二醇，顯著地減低了分離成本和提高了生產(chǎn)效益，為微生物發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)超高光學(xué)純度R，R-2, 3- 丁二醇奠定了良好的基礎(chǔ)。
【具體實施方式】
`[0036]根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。
[0037]實施例1:
[0038]菊芋菊粉粗提液的制備方法:
[0039]新鮮的菊芋洗凈去皮，熱燙滅酶(100°C，15min)后切成薄片，70°C下鼓風(fēng)干燥，然后粉碎過80目篩制得菊芋粗粉，冰箱保存?zhèn)溆谩０凑?:6的比例稱取菊芋粗粉放入水中攪拌均勻后，70°C水浴加熱浸提4h，用石灰乳調(diào)節(jié)pH為9，然后80°C水浴保溫lh，用紗布過濾后即可得菊芋菊粉粗提液。
[0040]實施例2:基因dar的克隆:
[0041]根據(jù)Genebank 公布的多粘類芽抱桿菌(paenibacillus polymyxa) ATCC12321 中dar基因的序列設(shè)計合成PCR所需的引物:
[0042]Pl:5，-ATGGAACTTAAAAACAAAACAGCC-3’[0043]P2:5’ -CTGTGGGTTGGTTGTCCAAAT-3’
[0044]以多粘類芽孢桿菌CGMCC3044基因組為模板完成PCR反應(yīng)；PCR反應(yīng)條件:94°C變性 5min，94°C 30s ；56°C 30s ；72°C lmin 共 32 次循環(huán)，72°C延伸 lOmin，獲得的 PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳分析確認(rèn)，經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后，與PMD18-T載體連接，進(jìn)行序列測定，獲得來源于多粘類芽孢桿菌CGMCC3044的丁二酮還原酶基因dar。
[0045]實施例3:重組粘粒 “SuperCos-l/pIJ790_dar 同源臂 1-oriT-ApraK_dar 同源臂II”的構(gòu)建:
[0046]在dar的5’端約39bp堿基序列的兩端分別引入EcoR I,Xho I,得到dar同源臂
I;在dar的3’端約20bp堿基序列的兩端分別引入Not I,BamH I，得到dar同源臂II。根據(jù)所述酶切位點將上述dar同源臂I和dar同源臂II分別連接至攜帶λ Red同源重組序列的連接至克隆粘粒SuperCos-l/pIJ790的oriT復(fù)制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因ApraK序列的兩端，得到含“dar同源臂1-oriT-ApraK-dar同源臂II”序列和λ Red序列的重組粘粒 “SuperCos-l/pIJ790_dar 同源臂 1-oriT-ApraR_dar 同源臂 II”。
[0047]實施例4:重組粘粒 “SuperCos-l/pIJ790_dar 同源臂 1-oriT-ApraK_dar 同源臂
II”轉(zhuǎn)化多粘類芽孢桿菌CGMCC3044。
[0048]將重組粘?！癝uperCos-l/pIJ790_dar同源臂 1-oriT-ApraK_dar 同源臂 II”轉(zhuǎn)化多粘類芽孢桿菌CGMCC3044，涂布含40 μ g/mL阿泊拉霉素平板，挑取陽性重組子，并進(jìn)行菌落PCR鑒定，得到重組多粘類芽孢桿菌，命名為CGMCC3044-dar_。
[0049]實施例5:重組多粘類芽孢桿菌CGMCC3044_dar_中丁二酮還原酶酶活測定
`[0050](I)出發(fā)菌株:重組多粘類芽孢桿菌CGMCC3044-dar_
[0051](2)所用培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10，酵母膏5，氯化鈉10，阿泊拉霉素40 μ g/mL,ρΗ6.0
[0052](3)酶活測定方法:酶活力測定的基本反應(yīng)體系(200 μ L)組成:200mmol/L磷酸鉀 ρΗ6.0177 μ L，酶液 10 μ L，5.3mmol/L丁二酮 10 μ L, 14.2mmol/L NADPH (NADP+) 3 μ L，37°C反應(yīng)5min后，測定lmin內(nèi)340nm處吸光度的變化率。一個酶活力單位(U)定義為IminNADPH減少(增加)的ymoL數(shù)量。酶粗提液的制備如下:將發(fā)酵液離心所得的菌體用生理鹽水(0.85%NaCl)洗滌兩次后重懸于pH8.050mmol/L磷酸鉀中，在300W，30min，超聲2s，停4s進(jìn)行超聲破碎，冰浴保護(hù)，8500rpm低溫離心30min，上清液即為酶粗提液。蛋白濃度用Bradford法檢測，以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品。
[0053]考察結(jié)果:重組多粘類芽孢桿菌CGMCC3044_dar_中丁二酮還原酶酶活為O。
[0054]對比例1:原始菌株多粘類芽孢桿菌CGMCC3044中丁二酮還原酶酶活測定
[0055](I)出發(fā)菌株:多粘類芽孢桿菌CGMCC3044
[0056](2)所用培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10，酵母膏5，氯化鈉10，ρΗ6.0
[0057](3)酶活測定方法:酶活力測定的基本反應(yīng)體系(200 μ L)組成:200mmol/L磷酸鉀 ρΗ6.0177 μ L，酶液 10 μ L，5.3mmol/L丁二酮 10 μ L, 14.2mmol/L NADPH (NADP+) 3 μ L，37°C反應(yīng)5min后，測定lmin內(nèi)340nm處吸光度的變化率。一個酶活力單位(U)定義為IminNADPH減少(增加)的ymoL數(shù)量。酶粗提液的制備如下:將發(fā)酵液離心所得的菌體用生理鹽水(0.85%NaCl)洗滌兩次后重懸于pH8.050mmol/L磷酸鉀中，在300W，30min，超聲2s，停4s進(jìn)行超聲破碎，冰浴保護(hù)，8500rpm低溫離心30min，上清液即為酶粗提液。蛋白濃度用Bradford法檢測，以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品。
[0058]考察結(jié)果:原始菌株多粘類芽孢桿菌CGMCC3044中丁二酮還原酶酶活為0.239U/
mg ο
[0059]實施例6:重組多粘類芽孢桿菌CGMCC3044_dar_直接利用菊芋菊粉粗提液在搖瓶中發(fā)酵產(chǎn)超高光學(xué)純度R，R-2, 3- 丁二醇
[0060](I)出發(fā)菌株:paenibacillus polymyxa CGMCC3044-dar_ ；
[0061](2)種子培養(yǎng)基(g/L): (NH4)2HPO4L 0,KC10.2,MgSO4.7H200.1，酵母膏 0.2，葡萄糖5.0，菊芋菊粉粗提液含菊粉2.0,阿泊拉霉素30 μ g/mL ；
[0062]種子培養(yǎng):1000mL三角瓶，裝液量200mL，培養(yǎng)溫度30°C，搖床轉(zhuǎn)速120rpm，培養(yǎng)22h ；
[0063](3)發(fā)酵培養(yǎng):培養(yǎng)基組成(g/L):菊粉粗提液含菊粉60.0，(NH4)2HPO4LO,KC10.10，MgSO4.7Η200.1，酵母膏 6.0，阿泊拉霉素 30 μ g/mL ；
[0064]培養(yǎng)條件:接種量10v/v%，發(fā)酵溫度30°C，pH6.0，控制氧氣的通入量，接種后發(fā)酵前24h,控制轉(zhuǎn)速240rpm,發(fā)酵24h后,控制轉(zhuǎn)速160rpm,維持微氧環(huán)境發(fā)酵，發(fā)酵時間42h。
[0065]發(fā)酵結(jié)果:菊芋菊粉粗提液中含60.0g/L的菊粉，經(jīng)發(fā)酵得到24.4g/L的R, R-2, 3- 丁二醇，光學(xué)純 度 100%。
[0066]對比例2:原始菌多粘類芽孢桿菌CGMCC直接利用菊芋菊粉粗提液在搖瓶中發(fā)酵產(chǎn) R，R-2, 3- 丁二醇
[0067](I)出發(fā)菌株:多粘類芽孢桿菌CGMCC3044 ；
[0068](2)種子培養(yǎng)基(g/L): (NH4)2HPO4L 0,KC10.2,MgSO4.7H200.1，酵母膏 0.2，葡萄糖5.0，菊粉 2.0 ；
[0069]種子培養(yǎng):1000mL三角瓶，裝液量200mL，培養(yǎng)溫度30°C，搖床轉(zhuǎn)速120rpm，培養(yǎng)22h ；
[0070](3)發(fā)酵培養(yǎng):培養(yǎng)基組成(g/L):菊粉粗提液含菊粉60.0，(NH4)2HPO4LO,KC10.10，MgSO4.7Η200.1，酵母膏 6.0 ；
[0071]培養(yǎng)條件:接種量10ν/ν%，發(fā)酵溫度30°C，pH6.0，控制氧氣的通入量，搖床轉(zhuǎn)速120rpm,維持微氧環(huán)境發(fā)酵即可，發(fā)酵時間42h。
[0072]發(fā)酵結(jié)果:菊芋菊粉粗提液中含60.0g/L的菊粉，經(jīng)發(fā)酵得到20.7g/L的R, R-2, 3- 丁二醇，光學(xué)純度 98.0%。
[0073]實施例7:重組多粘類芽孢桿菌CGMCC3044_dar_直接利用菊芋菊粉粗提液在5L發(fā)酵罐中批式發(fā)酵生產(chǎn)超高光學(xué)純度R，R-2, 3- 丁二醇
[0074](I)出發(fā)菌株:重組多粘類芽孢桿菌CGMCC3044_dar_ ；
[0075](2)種子培養(yǎng)基(g/L): (NH4)2HPO4L 0,KC10.2,MgSO4.7H200.1，酵母膏 0.2，葡萄糖5.0，菊粉2.0,阿泊拉霉素30 μ g/mL ；
[0076]種子培養(yǎng):1000mL三角瓶，裝液量200mL，培養(yǎng)溫度30°C，搖床轉(zhuǎn)速120rpm，培養(yǎng)22h ；
[0077](3)發(fā)酵培養(yǎng):培養(yǎng)基組成(g/L):酵母膏 6.0，(NH4)2HPO4L O, KC10.10，MgSO4.7H200.1，菊粉粗提液含菊粉60.0,阿泊拉霉素30 μ g/mL ；
[0078]培養(yǎng)條件:5L發(fā)酵罐(New Brunswick Scientific, NJ),接種量 10v/v%,發(fā)酵溫度30°C，pH6.0，控制氧氣的通入量，接種后發(fā)酵前24h，控制轉(zhuǎn)速240rpm，發(fā)酵24h后，控制轉(zhuǎn)速120rpm，維持微氧環(huán)境發(fā)酵，發(fā)酵時間42±lh。
[0079]發(fā)酵結(jié)果:底物約為60.0g/L的菊粉，經(jīng)發(fā)酵得到26.2g/L的R，R-2, 3_ 丁二醇，光學(xué)純度100%。
[0080]對比例3:原始多粘類芽孢桿菌CGMCC3044直接利用菊芋菊粉粗提液在5L發(fā)酵罐中批式發(fā)酵生產(chǎn)R，R-2, 3- 丁二醇
[0081](I)出發(fā)菌株:多粘類芽孢桿菌CGMCC3044 ；
[0082](2)種子培養(yǎng)基(g/L): (NH4)2HPO4L 0,KC10.2,MgSO4.7H200.1，酵母膏 0.2，葡萄糖5.0，菊粉 2.0 ；
[0083]種子培養(yǎng):1000mL三角瓶，裝液量200mL，培養(yǎng)溫度30°C，搖床轉(zhuǎn)速120rpm，培養(yǎng)22h ；
[0084](3)發(fā)酵培養(yǎng):培養(yǎng)基組成(g/L):酵母膏 6.0，(NH4)2HPO4L 0，KC10.10，MgSO4.7H200.1，菊粉粗提液含菊粉60.0 ；
[0085]培養(yǎng)條件:5L發(fā)酵罐(New Brunswick Scientific, NJ),接種量 10v/v%,發(fā)酵溫度300C，pH6.0，控制氧氣的通入量，接種后發(fā)酵前24h，控制轉(zhuǎn)速240rpm，發(fā)酵24h后，控制轉(zhuǎn)速120rpm，維持微氧環(huán)境發(fā)酵，發(fā)酵時間42±lh，。
[0086]發(fā)酵結(jié)果:底物約為60.0g/L的菊粉，經(jīng)發(fā)酵得到22.lg/L的R，R-2，3_ 丁二醇，光
學(xué)純度98.8%。
`[0087]實施例8重組多粘類芽孢桿菌CGMCC3044_dar_直接利用菊芋菊粉粗提液在5L發(fā)酵罐中分批補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)超高光學(xué)純度R，R-2, 3- 丁二醇
[0088](I)出發(fā)菌株:重組多粘類芽孢桿菌CGMCC3044-dar_ ；
[0089](2)種子培養(yǎng)基(g/L): (NH4)2HPO40.5,KC10.LMgSO4.7Η200.3，酵母膏 0.1，葡萄糖2.0，菊粉1.0，阿泊拉霉素30 μ g/mL ；
[0090]種子培養(yǎng):1000mL三角瓶，裝液量200mL，培養(yǎng)溫度37°C，搖床轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)12h ；
[0091](3)發(fā)酵培養(yǎng):培養(yǎng)基組成(g/L):酵母膏 3.0，(NH4)2HPO40.5，KC10.2，MgSO4.7H200.2，菊粉粗提液含菊粉20.0,阿泊拉霉素20 μ g/mL ；
[0092]培養(yǎng)條件:5L發(fā)酵罐(New Brunswick Scientific, NJ),接種量 10v/v%,發(fā)酵溫度370C，pH8.0，控制氧氣的通入量，接種后發(fā)酵前24h，控制轉(zhuǎn)速320rpm，發(fā)酵24h后，控制轉(zhuǎn)速80rpm,維持微氧環(huán)境發(fā)酵，當(dāng)菊粉剩余濃度約為5g/L時開始流加補(bǔ)料,補(bǔ)料流加菊粉維持菊粉濃度在30.0±1.0g/L，發(fā)酵時間72±lh。
[0093]發(fā)酵結(jié)果:補(bǔ)料后底物共約為60g/L的菊粉，經(jīng)發(fā)酵得到28.6g/L的R，R-2, 3_ 丁二醇，光學(xué)純度100%。
[0094]對比例4:原始菌多粘類芽孢桿菌CGMCC3044直接利用菊芋菊粉粗提液在5L發(fā)酵罐中分批補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)R，R-2, 3- 丁二醇
[0095](I)出發(fā)菌株:多粘類芽孢桿菌CGMCC3044 ；
[0096](2)種子培養(yǎng)基(g/L): (NH4)2HPO40.5,KC10.LMgSO4.7Η200.3，酵母膏 0.1，葡萄糖
2.0,菊粉 1.0 ；
[0097]種子培養(yǎng):1000mL三角瓶，裝液量200mL，培養(yǎng)溫度37°C，搖床轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)12h ；
[0098](3)發(fā)酵培養(yǎng):培養(yǎng)基組成(g/L):酵母膏 3.0，(NH4)2HPO40.5，KC10.2，MgSO4.7H200.2，菊粉粗提液含菊粉20.0 ；
[0099]培養(yǎng)條件:5L發(fā)酵罐(New Brunswick Scientific, NJ),接種量 10v/v%,發(fā)酵溫度370C，pH8.0，控制氧氣的通入量，接種后發(fā)酵前24h，控制轉(zhuǎn)速320rpm，發(fā)酵24h后，控制轉(zhuǎn)速80rpm,維持微氧環(huán)境發(fā)酵，當(dāng)菊粉剩余濃度約為5g/L時開始流加補(bǔ)料,補(bǔ)料流加菊粉維持菊粉濃度在30.0±1.0g/L，發(fā)酵時間72±lh。
[0100]發(fā)酵結(jié)果:補(bǔ)料后底物共約為60g/L的菊粉，經(jīng)發(fā)酵得到24.3g/L的R，R-2, 3_ 丁
二醇，光學(xué)純度98.9%。
[0101]實施例9重組多粘類芽孢桿菌CGMCC3044-dar_直接利用菊芋菊粉粗提液在5L發(fā)酵罐中分批補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)超高光學(xué)純度R，R-2, 3- 丁二醇
[0102](I)出發(fā)菌株:重組多粘類芽孢桿菌CGMCC3044-dar_ ；
[0103](2)種子培養(yǎng)基(g/L): (NH4)2ΗΡ042.0,KC10.3,MgSO4.7Η200.2，酵母膏 0.3，葡萄糖
8.0,菊粉3.0,阿泊拉霉素40 μ g/mL ；
[0104]種子培養(yǎng):1000mL三角瓶，裝液量200mL，培養(yǎng)溫度33°C，搖床轉(zhuǎn)速160rpm，培養(yǎng)36h ；
[0105](3)發(fā)酵培養(yǎng):培養(yǎng)基組成(g/L):酵母膏 8.0，(NH4)2HP042.0, KC10.3，MgSO4.7H200.3，菊粉粗提液含菊粉60.0,阿泊拉霉素40 μ g/mL ；
[0106]培養(yǎng)條件:5L發(fā)酵罐(New Brunswick Scientific, NJ),接種量 10v/v%,發(fā)酵溫度33°C，pH8.0，控制氧氣的通入量，接種后發(fā)酵前24h，控制轉(zhuǎn)速280rpm，發(fā)酵24h后，控制轉(zhuǎn)速160rpm，維持微氧環(huán)境發(fā)酵，補(bǔ)料流加菊粉維持菊粉濃度在30.0±1.0g/L，發(fā)酵時間96± lh。
[0107]發(fā)酵結(jié)果:補(bǔ)料后底物共約為120g/L的菊粉，經(jīng)發(fā)酵得到58.5g/L的R，R-2, 3_ 丁二醇，光學(xué)純度100%。
[0108]對比例5:原始菌多粘類芽孢桿菌CGMCC3044直接利用菊芋菊粉粗提液在5L發(fā)酵罐中分批補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)R，R-2, 3- 丁二醇
[0109](I)出發(fā)菌株:多粘類芽孢桿菌CGMCC3044 ；
[0110](2)種子培養(yǎng)基(g/L): (NH4)2ΗΡ042.0,KC10.3,MgSO4.7Η200.2，酵母膏 0.3，葡萄糖8.0，菊粉 3.0 ；
[0111]種子培養(yǎng):1000mL三角瓶，裝液量200mL，培養(yǎng)溫度33°C，搖床轉(zhuǎn)速160rpm，培養(yǎng)36h ；
[0112](3)發(fā)酵培養(yǎng):培養(yǎng)基組成(g/L):酵母膏 8.0，(NH4)2HP042.0, KC10.3，MgSO4.7H200.3，菊粉粗提液含菊粉60.0 ；
[0113]培養(yǎng)條件:5L發(fā)酵罐(New Brunswick Scientific, NJ),接種量 10v/v%,發(fā)酵溫度33°C，pH8.0，控制氧氣的通入量，接種后發(fā)酵前24h，控制轉(zhuǎn)速280rpm，發(fā)酵24h后，控制轉(zhuǎn)速160rpm，維持微氧環(huán)境發(fā)酵，補(bǔ)料流加菊粉維持菊粉濃度在30.0±1.0g/L，發(fā)酵時間96± lh。
[0114]發(fā)酵結(jié)果:補(bǔ)料后底物共約為120g/L的菊粉，經(jīng)發(fā)酵得44.8g/L的R，R-2，3_ 丁二醇，光學(xué)純度98.6%。
【權(quán)利要求】
1.一種產(chǎn)超高光學(xué)純度R，R-2, 3- 丁二醇基因工程菌，該工程菌是通過下列方法構(gòu)建得到:利用PCR技術(shù)從多粘類芽孢桿菌CGMCC3044中擴(kuò)增出丁二酮還原酶基因dar，5’端39bp堿基序列構(gòu)成同源臂I，3’端20bp堿基序列構(gòu)成同源臂II，通過多克隆位點將同源臂I和同源臂II分別串聯(lián)到攜帶入如(1同源重組序列克隆粘粒5即虹(:08-1/PIJ790的oriT復(fù)制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因ApraK序列的兩端，得到含dar同源臂1-oriT-ApraK_dar同源臂II序列的重組粘粒SuperCos-l/pIJ790_dar同源臂1-oriT-ApraK-dar同源臂II，重組粘粒轉(zhuǎn)化多粘類芽孢桿菌CGMCC3044，并在λ Red介導(dǎo)下與多粘類芽孢桿菌CGMCC3044發(fā)生同源雙交換，得到重組的多粘類芽孢桿菌，即產(chǎn)超高光學(xué)純度R，R-2, 3- 丁二醇基因工程菌CGMCC3044-dar'
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)超高光學(xué)純度R，R-2,3- 丁二醇基因工程菌，其特征在于:該工程菌通過下列方法構(gòu)建得到: (1)基因dar的克隆:根據(jù)Genebank公布的多粘類芽孢桿菌ATCC12321中dar基因的序列設(shè)計合成PCR所需的引物:
Pl:5，-ATGGAACTTAAAAACAAAACAGCC-3，
P2:5’ -CTGTGGGTTGGTTGTCCAAAT-3’ 以多粘類芽孢桿菌CGMCC3044基因組為模板完成PCR反應(yīng):PCR反應(yīng)條件:94°C變性5min，經(jīng) 94°C 30s, 56°C 30s, 72°C lmin，共 32 個循環(huán)，再經(jīng)過 72°C延伸 lOmin，獲得的 PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分析確認(rèn)，經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后，與pMD18-T載體連接，進(jìn)行序列測定，獲得來源于多粘類芽孢桿菌CGMCC3044的丁二酮還原酶基因，即dar基因；
(2)重組粘粒SuperCos-l/pIJ790_dar 同源臂 1-oriT-ApraK_dar 同源臂 II 的構(gòu)建:在dar的5’端39bp堿基序列的兩端分別引入EcoR I, Xho I，得到dar同源臂I ;在dar的3’端20bp堿基序列的兩端分別引入Not I, BamH I,得到dar同源臂II ;將上述dar同源臂I和dar同源臂II分別連接至攜帶ARed同源重組序列的克隆粘粒SuperCos-1/PIJ790的oriT復(fù)制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因ApraK序列的兩端，得到含dar同源臂1-oriT-ApraE-dar同源臂II序列和λ Red序列的重組粘粒SuperCos-l/pIJ790_dar同源臂 1-oriT-ApraE-dar 同源臂 II ； (3)重組基因工程菌的獲得:將重組粘粒SuperCos-l/pIJ790-dar同源臂1-or iT-ApraE-dar同源臂II轉(zhuǎn)化多粘類芽孢桿菌CGMCC3044，涂布含40 μ g/mL阿泊拉霉素平板，挑取陽性重組子，并進(jìn)行菌落PCR鑒定，得到重組多粘類芽孢桿菌，命名為CGMCC3044-dar_。
3.權(quán)利要求1所述的產(chǎn)R，R-2,3- 丁二醇基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于:該方法包括下列步驟:利用PCR技術(shù)從多粘類芽孢桿菌CGMCC3044中擴(kuò)增出丁二酮還原酶基因dar，5’端39bp堿基序列構(gòu)成同源臂I，3’端20bp堿基序列構(gòu)成同源臂II，通過多克隆位點將同源臂I和同源臂II分別串聯(lián)到攜帶ARed同源重組序列克隆粘粒SuperCos-1/PIJ790的oriT復(fù)制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因ApraK序列的兩端，得到含dar同源臂1-oriT-ApraE-dar同源臂II序列的重組粘粒SuperCos-l/pI J790,重組粘粒轉(zhuǎn)化多粘類芽孢桿菌CGMCC3044，并在λ Red介導(dǎo)下與宿主菌發(fā)生同源重組雙交換，得到重組的多粘類芽孢桿菌，即產(chǎn)超高光學(xué)純度R，R-2, 3- 丁二醇基因工程菌CGMCC3044-dar_。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的產(chǎn)超高光學(xué)純度R，R-2,3- 丁二醇基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于:包括下列步驟:(I)基因dar的克隆:根據(jù)Genebank公布的多粘類芽孢桿菌ATCC12321中dar基因的序列設(shè)計合成PCR所需的引物:
Pl:5，-ATGGAACTTAAAAACAAAACAGCC-3，
P2:5’ -CTGTGGGTTGGTTGTCCAAAT-3’ 以多粘類芽孢桿菌CGMCC3044基因組為模板完成PCR反應(yīng):PCR反應(yīng)條件:94°C變性5min，經(jīng) 94°C 30s, 56°C 30s, 72°C lmin，共 32 個循環(huán)，再經(jīng)過 72°C 延伸 lOmin，獲得的 PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分析確認(rèn)，經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后，與pMD18-T載體連接，進(jìn)行序列測定，獲得來源于多粘類芽孢桿菌CGMCC3044的丁二酮還原酶基因，即dar基因； (2)重組粘粒SuperCos-l/pIJ790_dar 同源臂 1-oriT-ApraK_dar 同源臂 II 的構(gòu)建:在dar的5’端39bp堿基序列的兩端分別引入EcoR I, Xho I，得到dar同源臂I ;在dar的3’端20bp堿基序列的兩端分別引入Not I, BamH I,得到dar同源臂II ;將上述dar同源臂I和dar同源臂II分別連接至攜帶ARed同源重組序列的克隆粘粒SuperCos-1/PIJ790的oriT復(fù)制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因ApraK序列的兩端，得到含dar同源臂1-oriT-ApraE-dar同源臂II序列和λ Red序列的重組粘粒SuperCos-l/pIJ790_dar同源臂 1-oriT-ApraE-dar 同源臂 II ； (3)重組基因工程菌的獲得:將重組粘粒SuperCos-l/pIJ790-dar同源臂1-or iT-ApraE-dar同源臂II轉(zhuǎn)化多粘類芽孢桿菌CGMCC3044，涂布含40 μ g/mL阿泊拉霉素平板，挑取陽性重組子，并進(jìn)行菌落PCR鑒定，得到重組多粘類芽孢桿菌，命名為CGMCC3044-dar_。
5.權(quán)利要求1所述的產(chǎn)超高光學(xué)純度R，R-2,3- 丁二醇基因工程菌CGMCC3044-dar_在生產(chǎn)R，R-2, 3- 丁二醇中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于:將構(gòu)建的基因工程菌CGMCC3044-dar_接種于含碳源、氮源和無機(jī)鹽的無菌培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)酵生產(chǎn)超高光學(xué)純度R，R-2, 3- 丁二醇，其中，所述碳源為未經(jīng)任何水解處理的菊芋菊粉粗提液。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于:該基因工程菌直接以菊芋菊粉粗提液為底物生產(chǎn)超高光學(xué)純度R，R-2, 3- 丁二醇，具體生產(chǎn)工藝為: Cl)出發(fā)菌株:重組多粘類芽孢桿菌CGMCC3044-dar_ ；
(2)種子培養(yǎng)基:(NH4)2HPO40.5-2.0g/L, KC10.10-0.3g/L, MgSO4.7Η200.1-0.3g/L,酵母膏0.1-0.3g/L，葡萄糖2.0-8.0g/L,菊芋菊粉粗提液含菊粉1.0-3.0g/L,阿泊拉霉素20-40 μ g/mL ； 種子培養(yǎng)=1000mL三角瓶，裝液量200mL，培養(yǎng)溫度30_37°C，搖床轉(zhuǎn)速120-200rpm，培養(yǎng) 12-36h ； (3)發(fā)酵培養(yǎng):培養(yǎng)基組成:菊芋菊粉粗提液含菊粉20.0-60.0g/L,(NH4)2HPO40.5-2.0g/L, KC10.10-0.3g/L, MgSO4.7Η200.1-0.3g/L，酵母膏 3.0-8.0g/L,阿泊拉霉素 20-40 μ g/mL ； 培養(yǎng)條件:接種量10v/v%，發(fā)酵溫度30-37°C，pH6.0-8.0，控制氧氣的通入量，接種后發(fā)酵前24h,控制轉(zhuǎn)速240-320rpm,發(fā)酵24h后,控制轉(zhuǎn)速80_160rpm,維持微氧環(huán)境發(fā)酵，搖瓶發(fā)酵，或批式發(fā)酵，或分批補(bǔ)料發(fā)酵，流加補(bǔ)料菊粉維持菊粉濃度在30.0±1.0g/L，補(bǔ)料后底物共約60-120g/L。
【文檔編號】C12P7/18GK103756949SQ201410018001
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月15日
【發(fā)明者】高健, 徐虹, 徐尤勇, 薛鋒, 丁鴿, 李莎, 馮小海 申請人:鹽城工學(xué)院