一株具有降解bde-47能力的側(cè)孢芽孢桿菌的制作方法
【專利摘要】一株具有降解BDE-47能力的側(cè)孢芽孢桿菌，本發(fā)明涉及一株側(cè)孢芽孢桿菌。本發(fā)明提供了一株芽孢桿菌，對BDE-47具有降解能力。本發(fā)明的一株具有降解BDE-47能力的側(cè)孢芽孢桿菌為側(cè)孢芽孢桿菌（Bacillus?laterospora）4-1，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏日期為2013年12月20日，保藏號為CGMCC?No.8616。本發(fā)明克服了目前含BDE-47污染土壤生物處理中污染物去除效果差及紫外光解法、物理化學(xué)法成本高、易造成二次污染的缺陷。
【專利說明】一株具有降解BDE-47能力的側(cè)孢芽孢桿菌
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一株側(cè)孢芽孢桿菌。
【背景技術(shù)】
[0002]含BDE-47 土壤屬于極難處理的土壤之一。目前，對此類污染土壤一般采用紫外光解法、物理化法等技術(shù)處理，但由于這些方法存在成本高、易造成二次污染等缺點，所以難以在實際中應(yīng)用。
[0003]極端環(huán)境微生物具有獨特的基因類型，可以在極端環(huán)境下生存、繁衍。降解微生物是能在污染環(huán)境下生長、繁衍的一類極端微生物，因其特殊的生理機能，具有巨大的研究價值和實際應(yīng)用價值。降解微生物在污染環(huán)境治理方面顯示出巨大的開發(fā)潛力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供了一株芽孢桿菌，對BDE-47具有降解能力。
[0005]本發(fā)明的一株具有降解BDE-47能力的側(cè)孢芽孢桿菌，它為側(cè)孢芽孢桿菌(Bacillus laterospora) 4-1,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期為2013年12月20日，保藏號為CGMCC N0.8616。
[0006]本發(fā)明側(cè)孢芽孢桿菌(Bacillus laterospora) 4-1屬于革蘭氏陽性好氧桿菌,側(cè)孢芽孢桿菌長短多變，長為19 μ m~22 μ m,寬為6 μ m~9 μ m,有鞭毛；在固體培養(yǎng)基上生長菌落為紅褐色，表面濕潤，邊緣不整齊，最適生長溫度為30°C~37°C，最適生長pH為8~10。
[0007]本發(fā)明側(cè)孢芽孢桿菌(Bacillus laterospora) 4_1可利用在以葡萄糖、鹿糖、乳糖、果糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上均能生長。
[0008]本發(fā)明側(cè)孢芽孢桿菌(Bacillus laterospora)4_l接觸酶陽性、甲基紅實驗陽性、尿素反應(yīng)陽性、吲哚實驗陽性、氧化酶陰性性、淀粉水解陰性、苯丙氨酸脫氫酶陰性、伏普實驗陰性、檸檬酸鹽反應(yīng)陰性。
[0009]本發(fā)明側(cè)抱芽抱桿菌(Bacillus laterospora) 4-1通過16S rRNA基因序列比對分析與其最相近的種屬是Bacillus aerius菌,相似性為99%,結(jié)合細菌形態(tài)特征、生長條件及生理生化鑒定結(jié)果，確定側(cè)孢芽孢桿菌為Bacillus sp.屬的一個新菌種，命名為側(cè)孢芽抱桿菌(Bacillus laterospora) 4-1,側(cè)抱芽抱桿菌(Bacillus laterospora) 4-1 為側(cè)孢芽孢桿菌模式菌株。
[0010]本發(fā)明側(cè)孢芽孢桿菌(Bacillus laterospora) 4-1具有處理BDE-47污染土壤的功能，BDE-47污染土壤中污染物去除率較高、費用低、不造成二次污染，本發(fā)明側(cè)孢芽孢桿菌為生物處理BDE-47污染土壤及極端微生物的研究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。
[0011]本發(fā)明側(cè)孢芽孢桿菌(Bacillus laterospora)4_l,它屬于芽孢桿菌屬(Bacilluslaterospora),保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏日期為2013年12月20日，保藏號為CGMCC N0.8616。[0012]本發(fā)明的有益效果:
[0013]1、本發(fā)明提供了一株BDE-47降解菌株，并應(yīng)用于BDE-47污染土壤的生物強化處理，克服了目前含BDE-47污染土壤生物處理中污染物去除效果差及紫外光解法、物理化學(xué)法成本高、易造成二次污染的缺陷；
[0014]2、本發(fā)明微生物好氧降解法中，采用微生物在處理BDE-47 (土壤持久性有機污染物)污染土壤時具有很大的優(yōu)勢，污染物濃度在100 μ g/L時，微生物仍然具有較好的降解作用，從而具有較好的BDE-47污染土壤處理效果。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1是本發(fā)明側(cè)孢芽孢桿菌1000倍的革蘭氏染色圖；
[0016]圖2是本發(fā)明側(cè)孢芽孢桿菌15000倍的原子力顯微鏡觀察圖；
[0017]圖3是本發(fā)明側(cè)孢芽孢桿菌和相近菌株的16S rRNA基因序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹圖。
【具體實施方式】
[0018]本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉【具體實施方式】，還包括各【具體實施方式】間的任意組合。
[0019]【具體實施方式】一:本實施方式一株具有降解BDE-47能力的側(cè)孢芽孢桿菌,它為側(cè)孢芽孢桿菌(Bacillus laterospora) 4-1,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期為2013年12月20日，保藏號為 CGMCC N0.8616。
[0020]本實施方式側(cè)孢芽孢桿菌(Bacillus laterospora) 4-1屬于革蘭氏陽性好氧桿菌，側(cè)孢芽孢桿菌長短多變，長為19 μ m~22 μ m,寬為6 μ m~9 μ m,有鞭毛(如圖2所示)；在固體培養(yǎng)基上生長菌落為紅褐色，表面濕潤，邊緣不整齊(如圖1所示)，最適生長溫度為30°C~37°C，最適生長pH為8~10。
[0021]本實施方式側(cè)孢芽孢桿菌(Bacillus laterospora) 4_1在以葡萄糖、鹿糖、乳糖、果糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上均能生長。
[0022]參照《伯杰細菌鑒定手冊》第八版和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》對側(cè)孢芽孢桿菌進行生理生化鑒定:側(cè)孢芽孢桿菌接觸酶陽性、甲基紅實驗陽性、尿素反應(yīng)陽性、吲哚實驗陽性、氧化酶陰性性、淀粉水解陰性、苯丙氨酸脫氫酶陰性、伏普實驗陰性、檸檬酸鹽反應(yīng)陰性。
[0023]本實施方式側(cè)孢芽孢桿菌(Bacillus laterospora) 4-1能夠在BDE-47濃度為100 μ g/L, pH為8~10的環(huán)境中生長。
[0024]本實施方式的有益效果:
[0025]1、本實施方式提供了一株BDE-47降解菌株，并應(yīng)用于BDE-47污染土壤的生物強化處理，克服了目前含BDE-47污染土壤生物處理中污染物去除效果差及紫外光解法、物理化學(xué)法成本高、易造成二次污染的缺陷；
[0026]2、本實施方式微生物好氧降解法中，采用微生物在處理BDE-47 (土壤持久性有機污染物)污染土壤時具有很大的優(yōu)勢，污染物濃度在100 μ g/L時，微生物仍然具有較好的降解作用，從而具有較好的BDE-47污染土壤處理效果。
[0027]【具體實施方式】二:本實施方式的側(cè)孢芽孢桿菌是從浙江省臺州市路橋區(qū)峰江鎮(zhèn)白楓岙村電子垃圾拆解處土壤中篩選得到的。篩選按以下步驟進行:一、取電子垃圾拆解處土壤IOg置于90mL滅菌無機鹽液體培養(yǎng)基中，于35°C，120r/min震蕩培養(yǎng)4h，靜置2h，取上清液10mL，置于90mL以BDE-47為唯一碳源的無機鹽液體培養(yǎng)基中，整個反應(yīng)體系的BDE-47終濃度為100 μ g/L ;二、然后在35°C，120r/min條件下震蕩培養(yǎng)8~10天；8~10天后，取IOmL菌液置于90mL以BDE-47為唯一碳源的無機鹽液體培養(yǎng)基中，整個反應(yīng)體系的BDE-47終濃度為100μ g/L ;三、重復(fù)步驟二的操作過程3次；四、應(yīng)用稀釋涂布平板法、四區(qū)劃線和一區(qū)劃線純化培養(yǎng)，即可得到具有降解BDE-47能力的側(cè)孢芽孢桿菌。
[0028]本實施方式中每升無機鹽液體培養(yǎng)基含3.5g Na2HPO4.2H20、Ig KH2PO4,
0.5g (NH4)2SO4'0.1g MgCl2.6Η20、0.05g Ca (NO3) 2.4Η20 和余量的去離子水。本實施方式中每升固體培養(yǎng)基含IOg蛋白胨、5g酵母浸膏、lOgNaCl、15~20g瓊脂和余量的去離子水，并調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至7~7.5，均在121°C下滅菌20min。[0029]參照《伯杰細菌鑒定手冊》第八版和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》對篩選得到的BDE-47降解菌株進行生理生化鑒定，通過16S rRNA的擴增、測序及同源性比較鑒定篩選得到的降解菌株，按以下步驟進行:用細菌基因組DNA提取試劑盒提取篩選得到的降解菌株的總DNA，并用通用引物進行PCR擴增，16S rRNA序列的上游引物BlOlF:5 ' -TGGCGGACGGGTGAGTAA-3 '、下游引物 BA534R:5 ' -ATTACCGCGGCTGCTGG-3 '。PCR 反應(yīng)體系為25 μ L:上游引物和下游引物各0.5μ L, DNA提取液lyL，2XMasterMixl2.5yL和剩余的雙蒸水。PCR反應(yīng)程序為:95°C下預(yù)變性5min，94°C下變性40s，57°C下退火40s，72°C下延伸40s。30個循環(huán)，最后在72°C下延伸8min。將所得PCR產(chǎn)物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，委托北京博邁德科技發(fā)展有限公司進行PCR產(chǎn)物的純化及16S rRNA測序。
[0030]本實施方式篩選得到的側(cè)孢芽孢桿菌的16S rRNA序列長度為1000bp (如序列表Seq ID No:1所示),其序列提交至GenBank,以確定菌株的種屬關(guān)系。同源性分析結(jié)果表明，該序列與空氣芽孢桿菌(Bacillus aerius)菌的16SrRNA序列的同源性最高，保守區(qū)相似性為99%，結(jié)合細菌形態(tài)特征、生長條件和生理生化鑒定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)兩者間存在明顯區(qū)別，與本屬其它菌種的區(qū)別更為明顯，確定側(cè)孢芽孢桿菌屬于一個新菌種，命名為側(cè)孢芽孢桿菌(Bacillus laterospora)4-1。根據(jù)側(cè)孢芽孢桿菌和相近菌株的16S rRNA基因序列，采用MEGA4軟件鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，側(cè)孢芽孢桿菌和相近菌株的16S rRNA基因序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹圖如圖3所示。
[0031]PCR引物購買自北京博邁德科技發(fā)展有限公司，細菌基因組DNA提取試劑盒購自于北京博邁德科技發(fā)展有限公司，其他試劑購自于北京生工生物工程有限公司。
[0032]對本實施方式的側(cè)孢芽孢桿菌(Bacillus laterospora) 4-1進行功能驗證:
[0033]側(cè)孢芽孢桿菌(Bacillus laterospora) 4-1處理污染物BDE-47,具體如下:反應(yīng)體系中BDE-47濃度為50 μ g/L,處理8天，BDE-47的去除率為95%。實驗證明側(cè)孢芽孢桿菌(Bacillus laterospora) 4-1具有強化處理污染物BDE-47的功能,可以明顯去除污染物，而且無需添加其它化學(xué)制劑，大幅度降低了處理成本，避免了二次污染。
[0034]另外，在反應(yīng)體系中BDE-47濃度為100 μ g/L，處理8天，BDE-47的去除率為47.5%。表明側(cè)孢芽孢桿菌(Bacillus laterospora) 4-1在高濃度的BDE-47下，仍然具較好的降解作用，從而具有較好的BDE-47處理 效果。
【權(quán)利要求】
1.一株具有降解BDE-47能力的側(cè)孢芽孢桿菌，其特征在于它為側(cè)孢芽孢桿菌(Bacillus laterospora) 4-1,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期為2013年12月20日，保藏號為CGMCC N0 .8616。
【文檔編號】C12R1/07GK103740626SQ201410040222
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月27日
【發(fā)明者】王繼華, 關(guān)健飛, 劉翔, 楊雪辰, 龔雪, 張珊珊, 朱丹 申請人:哈爾濱師范大學(xué)