本申請(qǐng)要求于2014年4月21日遞交的，序號(hào)為61/981,957的美國臨時(shí)申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，其全部內(nèi)容通過全文引用并入本申請(qǐng)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明一般涉及利用生物質(zhì)的技術(shù)。更具體的，本發(fā)明提供能夠有效的、大規(guī)模的捕獲生物質(zhì)(例如DDGS)的許多有價(jià)值組分的新方法，及其組合物和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

具有可溶物的干酒糟(DDGS)是釀酒過程的副產(chǎn)品。DDGS的傳統(tǒng)來源是來自釀酒商。最近，美國生物乙醇產(chǎn)量從2000年的17億加侖到2014年的150億加侖的顯著增長(http：//ethanolrfa.org/pages/statistics)大大增加了DDGS的供應(yīng)。目前，美國占全球生物乙醇產(chǎn)量的58％，令人驚訝的復(fù)合年增長率(CAGR)為16.8％。(http：//ethanolrfa.org/pages/World-Fuel-Ethanol-Production)此外，美國能源部藍(lán)圖在2030年前需要400億加侖的生物乙醇。

由于美國的主要原料是玉米，目前超過95％的DDGS由乙醇燃料廠生產(chǎn)。僅在美國和加拿大，每年就會(huì)生產(chǎn)3200萬至3900萬噸DDGS，這個(gè)數(shù)字預(yù)計(jì)將會(huì)繼續(xù)增長。在加拿大和美國，超過75％的DDGS用作家畜飼料(“DDGS概述”，明尼蘇達(dá)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)系http：//www.ddgs.umn.edu/overview.htm。)

不同于由于含水量而具有四至五天保質(zhì)期的維生素谷物(WDG)，DDGS具有幾乎無限的保質(zhì)期，并且可以運(yùn)輸?shù)饺魏问袌?chǎng)，而不管其是否接近乙醇廠。來自乙醇工業(yè)，基于玉米的酒糟通常作為高蛋白質(zhì)家畜飼料而銷售。

DDGS的營養(yǎng)成分取決于所使用的谷物的來源和質(zhì)量，以及產(chǎn)生DDGS的具體過程。在美國生產(chǎn)的大多數(shù)乙醇是由玉米制成。因?yàn)橛衩装s三分之二的淀粉，并且大多數(shù)淀粉在發(fā)酵期間轉(zhuǎn)化為乙醇，DDGS的營養(yǎng)物(例如蛋白質(zhì)、脂肪、纖維、灰分和磷)含量比玉米濃2至3倍。不同植物產(chǎn)生的DDGS在營養(yǎng)物質(zhì)含量和質(zhì)量上，可以存在大的變化。

除了玉米之外，小麥、大麥、黑麥和高粱(milo)也可用于酒精生產(chǎn)。來自小麥的DDGS比來自玉米和高粱的蒸餾產(chǎn)品具有高得多的蛋白質(zhì)和低得多的脂肪含量。

一個(gè)主要的挑戰(zhàn)是更好地利用由乙醇植物和釀酒商產(chǎn)生的大量生物質(zhì)。為了降低燃料乙醇的生產(chǎn)成本，迫切需要來自生物精煉方法、新的和改進(jìn)的DDGS和其它副產(chǎn)物的利用。雖然已經(jīng)報(bào)道了從DDGS中提取蛋白質(zhì)和生物柴油的嘗試，但是在工業(yè)規(guī)模上，捕獲DDGS中的許多其它有用組分尚未成功。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明部分是基于新的改進(jìn)的技術(shù)的發(fā)現(xiàn)，該技術(shù)允許以有成本效益的商業(yè)規(guī)模，高效捕獲生物質(zhì)(例如DDGS)的有價(jià)值的活性成分。可以有效捕獲的活性成分包括例如維生素、類黃酮、類胡蘿卜素、生育酚和親脂性酚類(lipophilic phenolics)、酚酸和核苷酸。本發(fā)明的提取物組合物以獨(dú)特的比例存在一組活性成分，例如提高的生物利用度。

一方面，本發(fā)明一般涉及從生物質(zhì)中提取一種或多種活性成分的方法。該方法包括：(a)使生物質(zhì)與溶劑接觸，其接觸的條件和時(shí)間足以將一種或多種活性成分從生物質(zhì)提取到溶劑中，從而產(chǎn)生殘余生物質(zhì)以及包含溶劑和提取的一種或多種活性成分的液相；(b)分離所述殘余生物質(zhì)和包含所述溶劑和一種或多種活性成分的液相；和(c)從液相中除去溶劑，得到包含一種或多種活性成分的濃縮混合物或基本上純的形式的提取物組合物。

另一方面，本發(fā)明一般涉及包含通過本發(fā)明的方法提取的一種或多種活性成分的組合物。

再一方面，本發(fā)明一般涉及生物質(zhì)提取物，其包含以重量計(jì)的：約0.1％至約10％的維生素；約0.1％至約10％的類黃酮；約0.1％至約10％的類胡蘿卜素；約0.1％至約10％的生育酚；約0.1％至約30％的親脂酚醛樹脂和約0.1％至約30％的酚酸。

再一方面，本發(fā)明一般涉及從生物質(zhì)中提取核苷酸的方法。該方法包括：(a)使生物質(zhì)與堿性水溶液接觸，其接觸的條件和時(shí)間足以從生物質(zhì)提取核酸，從而產(chǎn)生殘余生物質(zhì)和包含提取的核酸的堿性水相；(b)分離殘余生物質(zhì)和包含提取的核酸的堿性水相；(c)處理包含提取的核酸的堿性水相，以從水相中沉淀核酸；和(d)從水相中分離沉淀的核酸以產(chǎn)生包含核酸的提取物組合物。

再一方面，本發(fā)明一般涉及包含通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的核酸的組合物。

再一方面，本發(fā)明一般涉及包含通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的5'-核苷酸單磷酸單體的組合物。

再一方面，本發(fā)明一般涉及生物質(zhì)提取物，其包含按重量計(jì)的：約0.1％至約50％的GMP；約0.1％至約50％的UMP；約0.1％至約50％的IMP；和約0.1％至約50％的CMP。

再一方面，本發(fā)明一般涉及包含通過本發(fā)明公開的方法產(chǎn)生的玉米醇溶蛋白的組合物。在某些實(shí)施例中，產(chǎn)生的玉米醇溶蛋白與來自商業(yè)來源或從玉米提取的玉米醇溶蛋白相似或基本相同。

附圖說明

圖1A示意性地描述了涉及生物質(zhì)的提取以獲得提取物組合物的本發(fā)明的示例性實(shí)施例；

圖1B示意性地描述了涉及生物質(zhì)的提取以獲得提取物組合物的本發(fā)明的示例性實(shí)施例；

圖2示意性地描述了涉及生物質(zhì)的提取以獲得提取物組合物的本發(fā)明的示例性實(shí)施例；

圖3為DDGS鹽水提取物的UV-VIS光譜；

圖4為用生物活性劑(檢測(cè)波長：300nm)對(duì)DDGS油進(jìn)行HPLC分析；

圖5為玉米醇溶蛋白的SDS-PAGE圖像，泳道1：商業(yè)玉米醇溶蛋白；2：從DDGS提取的玉米醇溶蛋白樣品；3：來自玉米的玉米醇溶蛋白；濃度：用樣品緩沖液將30mg/mL玉米醇溶蛋白在70％EtOH中稀釋至10mg/mL；

圖6為核苷酸提取物的HPLC色譜圖(檢測(cè)波長為254nm)；核苷酸的單個(gè)濃度為UMP，4.61±0.05mg/g；GMP，2.98±0.04mg/g；AMP，3.02±0.04mg/g；

圖7為小鼠血漿中類胡蘿卜素的吸收；

圖8為小鼠血漿中γ-和α-生育酚的吸收；

圖9為小鼠血漿中酚類的吸收。

定義

本申請(qǐng)所用的術(shù)語“生物質(zhì)”廣泛地指來自活的、或近期活的生物體的任何生物材料。生物質(zhì)可以指植物或基于植物的材料，包括木質(zhì)生物質(zhì)和農(nóng)業(yè)生物質(zhì)。生物質(zhì)的實(shí)例包括玉米糖漿、玉米油、糖蜜、青貯飼料、農(nóng)業(yè)殘余物(玉米秸稈、草、稻草、谷殼、甘蔗渣等)、酒糟濕谷物(DWG)、干酒糟(DDG)，干酒糟(DDS)，濃縮酒精可溶物(CDS)，具有可溶物的干酒糟(DDGS)、改性DDGS、木質(zhì)材料(木材或樹皮、鋸屑、木材斜紋和磨碎料)、楊樹、柳樹、桉樹、柳枝稷、苜蓿、藍(lán)藻、藻類、包括大型藻類等)。谷物淀粉的實(shí)例包括：全麥面粉、全燕麥/燕麥、全谷物玉米/玉米粉、糙米、全黑麥、全谷物大麥、全法蘭、野生稻、蕎麥、小黑麥、粟、藜麥、高粱、淀粉蔬菜包括：歐洲防風(fēng)草、車前草馬鈴薯、南瓜、橡果南瓜、胡桃樹、青豆。

示例性生物質(zhì)還包括纖維素材料、木質(zhì)纖維素材料、半纖維素材料、碳水化合物、果膠、淀粉、菊粉、果聚糖、葡聚糖、玉米、甘蔗、草、柳枝稷、高粱、高生物量高粱、竹、藻類和衍生自這些材料的材料。生物質(zhì)還包括加工的或廢的生物質(zhì)，例如，經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生醇或其他發(fā)酵產(chǎn)物后的生物質(zhì)。

本申請(qǐng)所用的術(shù)語“發(fā)酵”是指使用微生物或微生物群，在適合微生物的培養(yǎng)基之中或之上，將有機(jī)分子轉(zhuǎn)化成另一分子的過程。微生物可以有氧或厭氧生長。例如，“發(fā)酵可以指轉(zhuǎn)化生物質(zhì)中糖或其它分子以產(chǎn)生醇(例如乙醇、甲醇、丁醇)；有機(jī)酸(例如檸檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡萄糖酸)；酮(例如丙酮)，氨基酸(例如谷氨酸)。因此，發(fā)酵包括酒精發(fā)酵。

發(fā)酵可以通過適合用于期望的發(fā)酵步驟的任何生物來實(shí)現(xiàn)，包括但不限于細(xì)菌、菌、細(xì)菌和原生生物。合適的發(fā)酵生物包括那些可以將單糖、二糖和三糖，特別是葡萄糖和麥芽糖或任何其它生物質(zhì)衍生的分子直接或間接轉(zhuǎn)化為所需發(fā)酵產(chǎn)物(例如乙醇、丁醇等)的生物。合適的發(fā)酵生物包括，例如，酵母或絲狀真菌。酵母可以包括來自畢赤酵母屬(Pichia)或酵母屬(Saccharomyces)的菌株。在一些實(shí)施例中，酵母可以是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在一些實(shí)施例中，發(fā)酵由細(xì)菌實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施例中，微生物(例如酵母或細(xì)菌)可以是經(jīng)遺傳修飾的微生物。

本申請(qǐng)所用的術(shù)語“預(yù)處理”是指導(dǎo)致生物質(zhì)更易于用溶劑如醇或水溶液提取的，任何機(jī)械、熱、生物化學(xué)或化學(xué)過程或其組合。

本申請(qǐng)?jiān)跔I養(yǎng)和營養(yǎng)成分的上下文中使用的術(shù)語“生物利用度”，可以定義為能夠被吸收并可用于使用或儲(chǔ)存的施用物質(zhì)的比例。因此，生物利用度指通過正常途徑消化，吸收和代謝的那部分營養(yǎng)物。(Srinivasan 2001“營養(yǎng)物的生物利用度：體外證明多種維生素-礦物質(zhì)組合產(chǎn)品中營養(yǎng)物可用性的實(shí)用方法”，營養(yǎng)學(xué)報(bào)131(4Suppl)：1349S-50S。)

本申請(qǐng)所用的術(shù)語“核酸”是指任何長度的聚合物，例如大于約2個(gè)堿基，大于約10個(gè)堿基，大于約100個(gè)堿基，大于約500個(gè)堿基，大于1,000個(gè)堿基或更多個(gè)由核苷酸組成的堿基，例如脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。核酸可以以單鏈或雙鏈形式存在。具有兩條核酸互補(bǔ)鏈的雙鏈核酸在本申請(qǐng)中可以稱為“第一”和“第二”鏈或一些其他任意命名。

本申請(qǐng)所用的術(shù)語“核苷酸”是指核苷單磷酸，核酸(無論是DNA或RNA或其類似物)的亞單位，其包括磷酸基團(tuán)、糖基和雜環(huán)堿基，以及這些亞單元的類似物。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了新的、改進(jìn)的方法，該方法允許在商業(yè)規(guī)模上，有成本效益地、高效連續(xù)地捕獲生物質(zhì)(例如，DDGS)中的有價(jià)值的活性成分。可以有效捕獲的活性成分包括，例如維生素，類黃酮，類胡蘿卜素，生育酚和親脂性酚類，酚酸，核苷酸和玉米醇溶蛋白。本發(fā)明還提供具有獨(dú)特性質(zhì)(例如營養(yǎng)價(jià)值和增強(qiáng)的生物利用度)的活性成分的新型組合物。另外，本發(fā)明通過生物質(zhì)的高效和有成本效益的利用，降低了生物燃料生產(chǎn)的成本。

當(dāng)以大規(guī)模(公斤級(jí)規(guī)?；蚋?執(zhí)行時(shí)，從DDGS中高效和有成本效益地回收活性成分遇到了許多挑戰(zhàn)。在100公斤級(jí)或更大規(guī)模時(shí)，這些挑戰(zhàn)可以變得更加顯著。典型的困難包括起泡，固液相的分離，所需組分的低提取產(chǎn)率。例如，起泡是大規(guī)模提取中常見的困難，會(huì)大大降低提取效率并增加操作的成本。同時(shí)，固液分離是另一個(gè)常見的問題，其可能導(dǎo)致涉及復(fù)雜和耗時(shí)的分離程序，導(dǎo)致生產(chǎn)成本的增加。從基于谷物的DDGS中提取活性成分也存在獨(dú)特的問題。例如，DDGS中的顯著的油含量可能降低提取產(chǎn)率，并且由于需要重復(fù)提取而增加生產(chǎn)成本，因?yàn)樵诖笠?guī)模提取過程中，非常需要通過提高提取效率來消除重復(fù)操作，這可以大大降低生產(chǎn)成本?？梢酝ㄟ^選擇最佳提取溫度，時(shí)間，提取溶劑，應(yīng)用酶將核酸分解成可提取單體，選擇最佳固液分離方法來實(shí)現(xiàn)。

參照?qǐng)D1A，其描述了用于從生物質(zhì)中提取活性成分的本發(fā)明的示例性實(shí)施方案的流程圖(100)。將生物質(zhì)原料(101)注入到提取容器中，并在溶劑與生物質(zhì)的選擇比例下，與溶劑(例如水或乙醇)混合。提取容器可以根據(jù)需要關(guān)閉或打開。提取(102)在設(shè)定的溫度，壓力和時(shí)間長度條件下進(jìn)行。一旦認(rèn)為提取完成，就進(jìn)行分離步驟(104)，由此分離固相和液相。固相或殘余生物質(zhì)(107)可以用新鮮溶劑(或多種溶劑)再提取，以進(jìn)行進(jìn)一步提取(110)。使液相(103)經(jīng)歷溶劑去除(106)，產(chǎn)生粗提取物(105)。去除的溶劑(108)，例如乙醇，可以回收用于提取(102)或其它目的。粗提取物(105)可以原樣使用或可以進(jìn)行進(jìn)一步的處理和/或純化程序。在提取核苷酸的情況下，酶被添加到水和DDGS的混合物中，以將核酸解聚成核苷酸，從而提供核苷酸提取物。

參照?qǐng)D2，其描述了用于從生物質(zhì)中提取核酸和核苷酸的本發(fā)明的另一個(gè)示例性實(shí)施方案的流程圖(100)。將生物質(zhì)原料(201)注入到提取容器中，并在溶劑與生物質(zhì)的選擇比例下，與溶劑(例如堿性水溶液)混合。提取容器可以根據(jù)需要關(guān)閉或打開。提取(202)在設(shè)定的溫度，壓力和時(shí)間長度條件下進(jìn)行。一旦認(rèn)為提取完成，就進(jìn)行分離步驟(204)，由此分離固相和液相。固相或殘余生物質(zhì)(207)可以用新鮮溶劑(或多種溶劑)再提取，以進(jìn)行進(jìn)一步提取(212)。使液相(203)經(jīng)歷酸化和/或加入其它溶劑，以引起核酸沉淀，然后將其分離，得到粗提取物(205)。

一方面，本發(fā)明一般涉及從生物質(zhì)中提取一種或多種活性成分的方法。該方法包括：使生物質(zhì)與溶劑A接觸，其接觸條件和時(shí)間足以將一種或多種活性成分從生物質(zhì)提取到溶劑A中，從而產(chǎn)生殘余生物質(zhì)I以及包含溶劑A和提取的一種或多種活性成分的液相；分離所述殘余生物質(zhì)I和包含溶劑A和提取的一種或多種活性成分的液相；以及從液相中除去溶劑A，得到包含一種或多種活性成分的濃縮混合物或基本上純的形式的提取物組合物。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法還包括：使殘余生物質(zhì)I與溶劑B接觸，以將蛋白質(zhì)提取到溶劑B中，從而產(chǎn)生殘余生物質(zhì)II以及包含溶劑B和蛋白質(zhì)的液相；并分離殘余生物質(zhì)II和包含溶劑B和提取的蛋白質(zhì)的液相；以及從液相中除去溶劑B，得到包含蛋白質(zhì)的提取物組合物。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法還包括：使殘余生物質(zhì)II與溶劑C和5'-磷酸二酯酶接觸，以將核苷酸提取到溶劑中；并分離殘余生物質(zhì)II和包含溶劑C和提取的核苷酸的液相；以及從液相中除去溶劑C，得到包含核苷酸的提取物組合物。

再次參照?qǐng)D1B，本發(fā)明的示例性方法可包括以下步驟：(a)使生物質(zhì)與溶劑(例如乙酸乙酯，乙醇或其組合)接觸，其接觸條件和時(shí)間足以將一種或多種活性成分從生物質(zhì)提取到溶劑，從而產(chǎn)生殘余生物質(zhì)I以及包含溶劑和提取的一種或多種活性成分的液相；(b)分離所述殘余生物質(zhì)I和包含所述溶劑和一種或多種活性成分的液相；(c)從液相中除去溶劑，以得到包含一種或多種活性成分的濃縮混合物或基本上純的形式的提取物組合物；(d)使殘余生物質(zhì)I與70％乙醇接觸，以提取醇可溶性蛋白質(zhì)(玉米醇溶蛋白)；(e)分離殘余生物質(zhì)(其被稱為殘余生物質(zhì)II)和包含溶劑和玉米醇溶蛋白的液相；(f)從液相中除去溶劑，得到包含玉米醇溶蛋白的提取物；(g)重復(fù)步驟(d)至步驟(f)，以使玉米醇溶蛋白的產(chǎn)量最大化；(h)使殘余生物質(zhì)II與水和5'-磷酸二酯酶接觸，以將核酸水解成可提取核苷酸；(i)分離殘余生物質(zhì)(其被稱為廢DDGS)和包含核苷酸和其它水溶性化合物的液相；(j)從液相中除去溶劑，得到富含核苷酸的餾分；以及(k)干燥廢DDGS以產(chǎn)生廢DDGS粉末。

任何合適的生物質(zhì)原料都可以被使用。示例性生物質(zhì)原料包括植物或基于植物的材料的發(fā)酵產(chǎn)物。在某些實(shí)施方案中，生物質(zhì)原料是各種谷物(例如玉米、稻、小麥、大麥和黑麥)的發(fā)酵產(chǎn)物。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物質(zhì)原料是DDGS。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物質(zhì)原料是由基于玉米的乙醇發(fā)酵所產(chǎn)生的DDGS。

在某些實(shí)施方案中，生物質(zhì)可以包括來自植物或基于植物材料的發(fā)酵產(chǎn)物堿性水提取的廢生物質(zhì)材料，例如來自谷物發(fā)酵產(chǎn)物堿性水提取的廢生物質(zhì)材料，所述谷物選自玉米、稻、小麥、大麥和黑麥。在某些實(shí)施方案中，所述生物質(zhì)可包括由具有可溶物的干酒糟(DDGS)的堿性水提取產(chǎn)生的廢生物質(zhì)材料。

生物質(zhì)可以是任何合適的形式，例如通常的具體形式的尺寸為約0.5μm至約10mm(例如，約0.5μm至約8mm，約0.5μm至約6mm，約0.5μm至約5mm，約0.5μm至約2mm，約0.5μm至約1mm，約1μm至約10mm，約10μm至約10mm，約50μm至約10mm，約1mm至約10mm)。

任何合適的溶劑(包括溶劑混合物)均可以用于提取。在某些實(shí)施方案中，使用醇作為溶劑。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，使用乙醇作為溶劑。

在某些實(shí)施方案中，溶劑可以包括兩種或更多種共溶劑，例如第一或主要共溶劑和第二或次要共溶劑。在某些實(shí)施方案中，使用乙醇作為主要共溶劑，并且還使用共溶劑(例如，另一種醇、水、丙酮、乙酸乙酯和己烷)。第一、主要共溶劑與第二、次要共溶劑的重量比可以是任何合適的比例，例如約5：1至約20：1(例如，約7：1至約20：1，約10：1至約20：1，約15：1至約20：1，約5：1至約10：1，約5：1至約12：1，約5：1至約15：1，約7：1至約12：1，約7：1至約10：1)。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一共溶劑是乙醇。

在某些實(shí)施方案中，溶劑A選自醇，水，丙酮，乙酸乙酯和己烷及其兩種或更多種的組合；溶劑B選自水，乙醇，異丙醇和雜醇及其兩種或更多種的組合；并且溶劑C選自水和鹽水。

溶劑與生物質(zhì)的重量比可以是任何合適的比例，例如約2：1至約15：1(例如，約2：1至約12：1，約2：1至約10：1，約5：1至約15：1，約5：1至約11：1，約5：1至約9：1，約7：1至約15：1，約7：1至約12：1，約7：1至約10：1，約7：1至約9：1)。

對(duì)于殘余生物質(zhì)和包含溶劑和一種或多種活性成分的液相的分離步驟，其可以通過任何合適的技術(shù)進(jìn)行，例如通過過濾和/或離心。分離步驟可包括一輪過濾或離心或可包括兩輪或多輪的過濾或離心或其組合。

一旦殘余生物質(zhì)從具有溶劑和一種或多種活性成分的液相中分離，從液相中除去溶劑，已得到一種或多種活性成分的粗提取物。

溶劑可以通過多種技術(shù)除去，例如通過蒸發(fā)、蒸餾、真空轉(zhuǎn)移和過濾。蒸發(fā)可以在升高的溫度和/或減壓下進(jìn)行。適合于溶劑去除的溫度和壓力可以根據(jù)溶劑的性質(zhì)，生產(chǎn)的規(guī)模，所回收的溶劑是否被回收在提取中再利用等來選擇。通常，蒸發(fā)可以在以下溫度下有效地進(jìn)行：約20℃至約100℃(例如，約30℃至約100℃，約40℃至約100℃，約50℃至約100℃，約60℃至約100℃，約20℃約100℃，約20℃至約100℃，約20℃至約100℃，約20℃至約100℃)，在約大氣壓至約1mmHg的壓力下進(jìn)行。在某些實(shí)施方案中，從液相除去的溶劑被回收并用于提取步驟。

根據(jù)生物質(zhì)的來源，可以根據(jù)本發(fā)明公開的方法提取多種化合物。優(yōu)選地，所述一種或多種活性成分選自維生素、類黃酮、類胡蘿卜素、生育酚和親脂性酚類以及酚酸。

在某些實(shí)施方案中，可通過本發(fā)明的方法提取的所述維生素包括以下的一種或多種：維生素E、維生素B(例如維生素B1、B2、B3、B4、B6)、維生素D、維生素A。

在某些實(shí)施方案中，可通過本發(fā)明的方法提取的所述類黃酮包括以下中的一種或多種：花青素(包括無糖花色素苷糖苷和花青苷糖苷)。

在某些實(shí)施方案中，可以通過本發(fā)明的方法提取的所述類胡蘿卜素包括以下中的一種或多種：β-胡蘿卜素、葉黃素和玉米黃質(zhì)。

在某些實(shí)施方案中，可通過本發(fā)明的方法提取的所述生育酚包括以下的一種或多種：α-生育酚、δ-生育酚和γ-生育酚。

在某些實(shí)施方案中，可通過本發(fā)明的方法提取的所述親脂性酚類包括以下中的一種或多種：阿魏酸及其酯和香豆酸及其酯、咖啡酸及其酯，以及突觸酸及其酯。

根據(jù)生物質(zhì)的來源和特定的提取條件，活性成分的相對(duì)產(chǎn)率可能變化，其可以被用于控制所得提取物的組成。例如，基于玉米的DDGS類胡蘿卜素含量通常高于基于小麥的DDGS。

本發(fā)明的方法能夠有效回收活性成分。特定成分的實(shí)際回收率取決于諸如生物質(zhì)來源，溶劑選擇，與生物質(zhì)的比率，溫度和提取時(shí)間等因素。該方法可以設(shè)計(jì)為適于提取一種或多種特定活性成分或類別的化合物。

在某些實(shí)施方案中，維生素的回收產(chǎn)率為1％或更高，例如約20％至95％，優(yōu)選約50％至95％，更優(yōu)選約70％至約95％，最優(yōu)選約90％至約100％。

在某些實(shí)施方案中，類胡蘿卜素的回收產(chǎn)率為1％或更高，例如約20％至95％，優(yōu)選約50％至95％，更優(yōu)選約70％至約95％，以及最優(yōu)選約90％至約100％。

在某些實(shí)施方案中，親脂性酚類的回收產(chǎn)率為1％或更高，例如約20％至95％，優(yōu)選約50％至95％，更優(yōu)選約70％至約95％和最優(yōu)選約90％至約100％。

該方法還可以設(shè)計(jì)為適于提取特定組合的活性成分或化合物類別。在某些實(shí)施方案中，例如，該方法實(shí)現(xiàn)維生素的回收產(chǎn)率為60％或更高，類胡蘿卜素的收率為60％或更高，親脂性酚類的收率為60％或更高。在某些實(shí)施方案中，該方法實(shí)現(xiàn)維生素的回收產(chǎn)率為60％或更高，類胡蘿卜素的收率為60％或更高，親脂性酚類的收率為60％或更高。在某些實(shí)施方案中，例如，該方法實(shí)現(xiàn)維生素的回收產(chǎn)率為90％或更高，類胡蘿卜素的收率為90％或更高，以及親脂酚醛樹脂的收率為90％或更高。

本發(fā)明的方法可以包括例如為了使生物質(zhì)更適合于特定的提取和/或分離技術(shù)的預(yù)處理步驟。例如，可以將生物質(zhì)原料(例如DDGS)研磨至期望的顆粒狀態(tài)，優(yōu)選研磨至適合于高效和有效的提取，并適合過濾和/或離心分離的水平。其它預(yù)處理技術(shù)包括例如切割，研磨，壓制，剪切和切碎。

應(yīng)注意，對(duì)于某些應(yīng)用，對(duì)所需組合物的提取產(chǎn)物進(jìn)行重復(fù)(例如，第二或第三輪)提取、分離和溶劑移除可能是有益的。重復(fù)輪可以與前一輪相同。在一個(gè)或多個(gè)方面，重復(fù)輪也可以不同于前一輪，例如溶劑的選擇和量，提取時(shí)間，殘余生物質(zhì)分離技術(shù)和溶劑的去除。

應(yīng)注意，盡管該方法通?？梢酝ㄟ^不同規(guī)模(例如，從約5Kg至約20Kg，從約20Kg至約200Kg，每批至少20Kg的生物質(zhì)，每批至少200Kg生物質(zhì)，每批至少1,000Kg生物質(zhì))的分批法進(jìn)行，該方法也可以設(shè)計(jì)為連續(xù)法，連續(xù)或周期性地補(bǔ)充生物質(zhì)原料，連續(xù)的提取，分離殘余和/或去除溶劑。

在另一方面，本發(fā)明一般涉及一種組合物，該組合物包含通過本發(fā)明公開的方法提取的一種或多種活性成分。

根據(jù)生物質(zhì)的來源，提取條件(例如，溶劑選擇，溶劑與生物質(zhì)的比率，提取溫度和時(shí)間長度)，分離方法和溶劑去除，生物質(zhì)提取物的組成可能變化。因此，可以處理生物質(zhì)提取物，以產(chǎn)生某些活性成分的組合物。

再一方面，本發(fā)明一般涉及生物質(zhì)提取物，其包括以重量計(jì)：約0.01％至約20％的維生素；約0.01％至約20％的類黃酮；約0.01％至約20％的類胡蘿卜素；約0.01％至約20％的生育酚；約0.01％至約30％的親脂性酚類和約0.01％至約30％的酚酸。

在某些實(shí)施方案中，生物質(zhì)提取物包含按重量計(jì)約0.01％至約20％(例如約0.01％至約20％，0.1％至約20％，約1.0％至約20％，約0.01％至約10％，約0.01％至約5.0％，約0.1％至約10％，約1.0％至約5.0％)的維生素E和維生素B；約0.01％約20％(例如，約0.1％至約20％，約1.0％至約20％，約0.01％至約10％，約0.01％至約5.0％，約0.1％至約10％，約1.0％至約5.0％)的類黃酮花青素；約0.01％至約20％(例如約0.1％至約20％，約1.0％至約20％，約0.01％至約10％，約0.01％至約5.0％，約0.1％至約10％，約1.0％至約5.0％)的類胡蘿卜素、β-胡蘿卜素和葉黃素；約0.01％至約20％(例如，約0.1％至約20％，約1.0％至約20％，約0.01％至約10％，約0.01％至約5.0％，約0.1％至約10％，約1.0％至約5.0％)的生育酚：包括α-、δ-和γ-生育酚；和約0.01％至約20％(例如，約0.1％至約20％，約1.0％至約20％，約0.01％至約10％，約0.01％至約5.0％，約0.1％至約10％，約1.0％至約5.0％)的親脂性酚類：阿魏酸酯和香豆酸酯。

在某些實(shí)施方案中，生物質(zhì)提取物包含按重量計(jì)約0.01％至約20％(例如約0.1％至約20％，約1.0％至約20％，約0.01％至約10％，約0.01％至約5.0％，約0.1％至約10％，約1.0％至約5.0％)的維生素E和維生素B；約0.01％至約20％(例如，約0.1％至約20％，約1.0％至約20％，約0.01％至約10％，約0.01％至約5.0％，約0.1％％至約10％，約1.0％至約5.0％)的花青素；約0.01％至約20％(例如，約0.1％至約20％，約1.0％至約20％，約0.01％至約10％，約0.01％至約5.0％，約0.1％至約10％，約1.0％至約5.0％)的β-胡蘿卜素和葉黃素；約0.01％至約20％(例如，約0.1％至約20％，約1.0％至約20％，約0.01％至約10％，約0.01％至約5.0％，約0.1％至約10％，約1.0％至約5.0％)的生育酚：包括α-、δ-和γ-生育酚；和約0.01％至約20％(例如，約0.1％至約20％，約1.0％至約20％，約0.01％至約10％，約0.01％至約5.0％，約0.1％至約10％，約1.0％至約5.0％)的阿魏酸酯和香豆酸酯。

在某些實(shí)施方案中，生物質(zhì)提取物包含按重量計(jì)約0.5％至約20％(例如約1.0％至約20％，約5.0％至約20％，約0.5％至約10％，約0.5％至約5.0％，約1.0％至約5.0％)的維生素E和維生素B；約0.5％至約20％(例如，約1.0％至約20％，約5.0％至約20％，約0.5％至約10％，約0.5％至約5.0％，約1.0％至約5.0％)的花青素；約0.5％至約20％(例如，約1.0％至約20％，約5.0％至約20％，約0.5％至約10％，約0.5％至約5.0％，約1.0％至約5.0％)的β-胡蘿卜素和葉黃素；約0.5％至約20％(例如，約1.0％至約20％，約5.0％至約20％，約0.5％至約10％，約0.5％至約5.0％，約1.0％至約5.0％)的生育酚：包括α-、δ-和γ-生育酚；和約0.5％至約20％(例如，約1.0％至約20％，約5.0％至約20％，約0.5％至約10％，約0.5％至約5.0％，約1.0％至約5.0％)的阿魏酸酯和香豆酸酯。

在某些實(shí)施方案中，生物質(zhì)提取物包含按重量計(jì)的：約10％至約20％的維生素E和維生素B；約10％至約20％的花青素；約10％至約20％的β-胡蘿卜素和葉黃素；約10％至約20％的生育酚：包括α-、δ-和γ-生育酚；和約10％至約20％的阿魏酸酯和香豆酸酯。

再一方面，本發(fā)明一般涉及從生物質(zhì)中提取玉米醇溶蛋白的方法。

又一方面，本發(fā)明一般涉及包含通過本發(fā)明公開的方法產(chǎn)生的玉米醇溶蛋白的組合物。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含約1％至約90％(例如，約1％至約80％，約10％至約80％，約20％至約80％，約30％至約80％，約40％至約80％，約50％至約90％，約60％至約90％，約70％至約90％，約80％至約90％)的玉米醇溶蛋白。

又一方面，本發(fā)明一般涉及從生物質(zhì)中提取核苷酸的方法。該方法包括：(a)使生物質(zhì)與堿性水溶液接觸，其接觸條件和時(shí)間足以將核酸從生物質(zhì)提取出來，從而產(chǎn)生殘余生物質(zhì)和包含提取的核酸的堿性水相；(b)分離所述殘余生物質(zhì)和包含提取的核酸的堿性水相；(c)處理包含提取的核酸的堿性水相，以從水相中沉淀核酸；和(d)從水相中分離沉淀的核酸，以得到包含核酸的提取物組合物。

可以使用任何合適的生物質(zhì)原料。示例性生物質(zhì)原料包括植物或基于植物的材料的發(fā)酵產(chǎn)物。在某些實(shí)施方案中，生物質(zhì)原料是各種谷物(例如玉米，稻，小麥，大麥和黑麥)的發(fā)酵產(chǎn)物。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物質(zhì)原料是DDGS。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物質(zhì)原料是由基于玉米的乙醇發(fā)酵所產(chǎn)生的DDGS。

在某些實(shí)施方案中，生物質(zhì)可以包括來自植物或基于植物材料的發(fā)酵產(chǎn)物的醇提取的廢生物質(zhì)材料，例如，來自谷物酒精發(fā)酵產(chǎn)物的醇提取的廢生物質(zhì)材料，所述谷物選自玉米，水稻，小麥，大麥和黑麥。在某些實(shí)施方案中，生物質(zhì)可以包括由具有可溶物的干酒糟(DDGS)的醇提取所產(chǎn)生的廢生物質(zhì)材料。

生物質(zhì)可以是任何合適的形式，例如通常的具體形式的尺寸為約0.5μm至約10mm(例如，約0.5μm至約8mm，約0.5μm至約6mm，約0.5μm至約5mm，約0.5μm至約2mm，約0.5μm至約1mm，約1μm至約10mm，約10μm至約10mm，約50μm至約10mm，約1mm至約10mm)。

堿性水溶液可以具有任何合適的大于7的pH，例如約8至約11。在某些實(shí)施方案中，堿性水溶液的pH為約8至約9.5(例如，約8.0，8.2，8.4，8.6，8.8，9.0，9.2，9.4)。在某些實(shí)施方案中，堿性水溶液的pH為約9.5至約11(例如，約9.6，9.8，10.0，10.2，10.4，10.6，10.8)。

堿性水溶液可以包含任何合適的溶質(zhì)以實(shí)現(xiàn)所需的堿性條件。例如，溶質(zhì)可以選自堿，諸如氨，碳酸鈉，氫氧化鈉和氫氧化鉀。

堿性水溶液與生物質(zhì)的重量比可以是任何合適的比例，例如約1：1至約20：1(例如，約1：1至約15：1，約1：1至約12：1，約1：1至約10：1，約1：1至約8：1，約2：1至約20：1，約5：1至約20：1，約8：1至約20：1，約10：1至約20：1，約5：1至約15：1，約5：1至約12：1，約5：1至約10：1，約7：1至約15：1，約7：1至約12：1，約7：1至約9：1)。

對(duì)于分離殘余生物質(zhì)和包含核酸的液相的步驟，其可以通過任何合適的技術(shù)進(jìn)行，例如通過過濾和/或離心。分離步驟可包括一輪過濾或離心或可包括兩輪或多輪的過濾或離心或其組合。

在某些實(shí)施方案中，分離殘余的生物質(zhì)和包含核酸的液相，是通過一輪或多輪過濾進(jìn)行的。

在某些實(shí)施方案中，分離殘余的生物質(zhì)和包含核酸的液相，是通過一輪或多輪離心分離進(jìn)行的。

隨后處理包含核酸的堿性液相，使核酸從液相中沉淀，例如通過向堿性液相中加入一種或多種有機(jī)溶劑(例如乙醇，乙酸乙酯和己烷)。在某些實(shí)施方案中，將醇(例如乙醇)加入到堿性液相中以從液相中沉淀核酸。可以同時(shí)或依次加入共-有機(jī)溶劑(例如，另一種醇，乙酸乙酯和己烷)。

生物質(zhì)提取物中回收的核酸可以包括RNA分子、DNA分子或兩者，例如酵母RNA和酵母DNA。

本發(fā)明的方法能夠從生物質(zhì)原料中有效的回收核酸。特定核酸(RNA和DNA)的實(shí)際回收率取決于諸如生物質(zhì)來源，溶劑pH，與生物質(zhì)的比率，溫度和提取時(shí)間等因素。該過程可以設(shè)計(jì)為適于某些核酸分子的提取，例如，優(yōu)選回收酵母RNA分子。

在某些實(shí)施方案中，該方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)提取前的生物質(zhì)中的核酸的10％或更高的回收產(chǎn)率(例如，約10％或更高，約20％或更高，約30％或更高，約40％或更高，約50％或更高，約60％或更高，約70％或更高，約80％或更高，約90％或更高)。

本發(fā)明的方法可以包括預(yù)處理步驟，例如，以使生物質(zhì)更適合于特定的提取和/或分離技術(shù)。例如，可以將生物質(zhì)原料(例如DDGS)研磨至期望的顆粒狀態(tài)，優(yōu)選研磨至適合于高效和有效的提取，并適合過濾和/或離心分離的水平。其它預(yù)處理技術(shù)包括例如切割、研磨、壓制、剪切和切碎。

在某些實(shí)施方案中，生物質(zhì)在與堿性水溶液接觸之前，經(jīng)一種或多種有機(jī)溶劑預(yù)處理。

此外，通過堿性水溶液對(duì)殘余生物質(zhì)進(jìn)行重復(fù)(例如，第二或第三輪)提取，分離和溶劑移除可能是有益的，得到所需組合物的提取產(chǎn)物。重復(fù)輪可以與前一輪相同。在一個(gè)或多個(gè)方面，重復(fù)輪也可以不同于前一輪，例如溶劑選擇和量，提取時(shí)間，殘余生物質(zhì)分離技術(shù)和溶劑的去除。

應(yīng)注意，盡管該方法通常可以通過不同規(guī)模(例如，每批至少5Kg的生物質(zhì)，每批至少50Kg的生物質(zhì)，每批至少500Kg生物質(zhì))的分批法進(jìn)行，該方法可以設(shè)計(jì)為連續(xù)法，連續(xù)或周期性地補(bǔ)充生物質(zhì)原料，連續(xù)的提取，分離殘余和/或去除溶劑。

又一方面，本發(fā)明一般涉及一種組合物，該組合物包含通過本發(fā)明公開的方法產(chǎn)生的核酸。

在生物質(zhì)提取物的某些實(shí)施方案中，所述組合物包含按重量計(jì)約0.1％至約90％(例如約0.1％至約80％，約10％至約80％，約20％至約80％，約30％至約80％，約40％至約80％，約50％至約90％，約60％至約90％，約70％至約90％，約80％至約90％)的酵母RNA。在生物質(zhì)提取物的某些實(shí)施方案中，所述組合物還包含約0.1％至約60％(例如約10％至約60％，約20％至約60％，約30％至約60％，約40％至約60％，約50％至約60％，約0.1％至約50％，約0.1％至約40％，約0.1％至約30％，約0.1％至約20％，約0.1％至約10％，小于10％，小于5％)的酵母DNA。

在某些實(shí)施方案中，酵母RNA與酵母DNA的重量比為約5：1至約20：1(例如，約5：1至約15：1，約5：1至約12：1，約5：1至約10：1，約5：1至約8：1，約8：1至約20：1，約10：1至約20：1，約12：1至約20：1，約15：1至約20：1，約6：1至約12：1，約7：1至約10：1)。

核酸的粗提取物可經(jīng)進(jìn)一步處理，使之轉(zhuǎn)化為核苷酸和/或根據(jù)需要進(jìn)一步轉(zhuǎn)化。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括：酶水解分離的核酸以產(chǎn)生5'-核苷酸單磷酸(MP)單體的混合物，所述5'-核苷酸單磷酸(MP)單體選自GMP、UMP、AMP和CMP。

又一方面，本發(fā)明一般涉及一種組合物，該組合物包含通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的5'-核苷酸單磷酸單體。

又一方面，本發(fā)明一般涉及生物質(zhì)提取物，其包含以重量計(jì)的：約0.1％至約50％的GMP；約0.1％至約50％的UMP；和約0.1％至約50％的CMP。

在某些實(shí)施方案中，產(chǎn)生的玉米醇溶蛋白與來自商業(yè)來源或提取自玉米的玉米醇溶蛋白相似或基本相同。

實(shí)施例

實(shí)施例1.從DDSG中提取核酸

從DDSG中提取核酸(方法1)

稱量DDGS(100.0g)并將之置于藍(lán)色蓋帽瓶中。向固體中加入氯化鈉溶液(8％，300mL)，將混合物加熱至90℃，保持2小時(shí)。將所得漿液快速冷卻至10℃并過濾。用鹽酸將濾液調(diào)節(jié)至pH2.5。將溶液在4℃冰箱保存12小時(shí)，以沉淀RNA。然后將溶液離心，用無水乙醇(50mL)洗滌沉淀兩次。將殘余物溶于去離子水(50mL)中并過濾。通過UV-VIS光譜測(cè)量濾液。結(jié)果顯示于圖3中，根據(jù)260nm處的吸光度值估算核酸濃度，并顯示于表1中。

表1.酒糟生物質(zhì)核酸含量估算

·根據(jù)260nm處的吸光度值估算(一個(gè)吸光度單位相當(dāng)于40μg/mL.)

從DDSG中提取核酸(稀釋法)

在燒瓶(250mL)中，加入水(180mL)，氫氧化鈉(2.0g)和DDGS(20g)。將所得漿液攪拌30分鐘，用鹽酸(6.0M)將pH調(diào)節(jié)至中性(7.0)再攪拌10分鐘。然后將混合物加熱至90℃10分鐘，冷卻至室溫，然后在4℃冰箱中過夜。將漿液以3500RPM離心，并傾析上清液。將上清液用鹽酸(6M)酸化至pH 2.50并在4℃下保持過夜。將所得混合物以6000RPM離心，將沉淀物合并，用乙醇(95％，10mL)洗滌三次。將固體(粗核酸)溶解在1升蒸餾水中。測(cè)量260nm處的吸光度為0.093。基于該值，DDGS中的RNA的百分比估算為0.020％。

從DDSG中提取RNA(鹽水法)

在燒瓶(250mL)中，加入水(180mL)，氯化鈉(20g)和DDGS(20g)。然后將混合物加熱至95℃2小時(shí)，冷卻至室溫，然后將其置于4℃過夜。將漿液以3500RPM離心，并傾析上清液。將上清液用鹽酸(6M)酸化至pH 2.50并在4℃下保持過夜。將所得混合物以6000RPM離心，將沉淀物合并，用乙醇(95％，10mL)洗滌三次。將固體(粗核酸)溶解在1升蒸餾水中。測(cè)量260nm處的吸光度為0.295?；谠撝担珼DGS中的RNA的百分比估算為0.059％。

乙醇脫脂后從DDSG中提取RNA

在燒瓶(250mL)中加入乙醇(95％，100mL)和DDGS(20g)，攪拌30分鐘。將混合物過濾，將殘余物置于燒瓶中，并與氯化鈉(20g)和水(180mL)混合。然后將混合物加熱至95℃2小時(shí)，冷卻至室溫，然后在4℃下保持過夜。將漿液以3500RPM離心，并傾析上清液。將上清液用鹽酸(6M)酸化至pH 2.50并在4℃下保持過夜。將所得混合物以6000RPM離心，將沉淀物合并，用乙醇(95％，10mL)洗滌三次。將固體(粗核酸)溶解在1升蒸餾水中。測(cè)量260nm處的吸光度為0.320?；谠撝担珼DGS中的RNA的百分比估算為0.064％。

核酸至核苷酸的水解：將來自DDGS的RNA提取物(10mg，獲取自先前工序的00106段)與水(10mL)和來自青霉菌(Penicilliumcitrinum)凍干粉末(DDGS核酸的重量的0.2％)的核酸酶P1混合。將混合物調(diào)節(jié)至pH5.0，并在60℃下加熱8小時(shí)。將所得溶液在90℃加熱15分鐘以使核酸酶P1失活。將所得溶液進(jìn)行HPLC分析(核苷酸)，結(jié)果顯示溶液中的GMP濃度為10mg/L，AMP的濃度為5.5mg/L。

實(shí)施例2.DDGS的連續(xù)提取(5kg級(jí))至不同級(jí)分中(方法1)

在該實(shí)施例中，進(jìn)行5kg級(jí)的DDGS的連續(xù)提取，包括：油(乙酸乙酯和乙醇1：1混合物)→玉米醇溶蛋白(70％乙醇)→核苷酸(水和5'磷酸二酯酶)->廢DDGS，詳情如本發(fā)明記載。

用生物活性物質(zhì)提取油

向具有加熱夾套的20L反應(yīng)器中加入無水乙醇(7.5L)和乙酸乙酯(7.5L)，并攪拌混合。向混合物中加入DDGS(5Kg)并從室溫加熱至60℃，約需45分鐘。將混合物保持在60℃下，攪拌1小時(shí)并冷卻。30分鐘后，溫度達(dá)到30℃。將混合物傾析并離心。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將濾液中的溶劑回收(12.6L，84％)，得到729.4克油狀物。將殘余物置于反應(yīng)器中，并與乙酸乙酯和乙醇混合物(1：1,15L)混合。45分鐘后將混合物加熱至60℃，并在該溫度下保持?jǐn)嚢?小時(shí)。30分鐘后將混合物冷卻至30℃，傾析漿液并過濾。將來自濾液的溶劑回收(12.7L，85％)，得到179.2g油狀物。具有生物活性物質(zhì)的油的總產(chǎn)率為908.6g(18.2％)。殘余物將用于進(jìn)一步提取。

分析：油溶液的HPLC在與光電二極管陣列檢測(cè)器(PDA)(Waters 2996)和自動(dòng)進(jìn)樣器(Waters 717plus)偶聯(lián)的Waters 2695HPLC系統(tǒng)上進(jìn)行。HPLC柱為250×4.6mm，5μmRP C18柱(Waters，Atlantis T3)。流動(dòng)相由A(0.04％乙酸的去離子水溶液)和B(0.04％乙酸的甲醇溶液)組成。HPLC分離的梯度程序顯示在表2中。

表2.色譜分離的梯度程序

酚酸(香草酸、咖啡酸、對(duì)香豆酸和阿魏酸)，葉黃素和α-生育酚的鑒定是基于比較各化合物的保留時(shí)間和紫外吸光度。關(guān)鍵化合物的濃度為：香草酸8.74mg/100g油)；咖啡酸，8.68mg/100g油；對(duì)-香豆酸，14.49mg/100g油；阿魏酸，16.38mg/100g油；葉黃素，31.62mg/100g油；α-生育酚，40.12mg/100g油。典型的HPLC指紋圖如圖4所示。

玉米醇溶蛋白

將具有生物活性物質(zhì)(自上面)的油提取的殘余物置于20L反應(yīng)器中，并與70％乙醇(15L)混合并加熱至60℃，需50分鐘將溫度升至60℃。將漿液攪拌1小時(shí)，35分鐘后冷卻至30℃。傾析漿液并離心。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(12.4L，乙醇濃度75％)回收濾液中的溶劑。將殘余物在真空中干燥12小時(shí)，得到348.4g固體。將殘余物置于20L反應(yīng)器中，并與70％乙醇(15L)混合。將混合物在50分鐘內(nèi)加熱至60℃，并在該溫度下保持?jǐn)嚢?小時(shí)。將混合物在35分鐘內(nèi)冷卻至30℃，然后傾析并離心。將濾液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以回收溶劑(12.4L，75％乙醇)，在60℃真空烘箱中干燥10小時(shí)后得到203.5g固體。玉米醇溶蛋白的總產(chǎn)量為551.7g(11％)。

從DDGS提取的玉米醇溶蛋白與商業(yè)玉米醇溶蛋白及來自玉米的玉米醇溶蛋白表達(dá)譜的分析方法。玉米醇溶蛋白的電泳采用來自Bio-rad公司(Hercules，California，USA)的電泳儀進(jìn)行。在Paraman的SDS-PAGE方法(Paraman，I.；Lamsal，B.P.，從玉米發(fā)酵副產(chǎn)物中回收和表征α-玉米醇溶蛋白。農(nóng)業(yè)與食品化學(xué)雜志2011，59，3071.)之后，在SDS-Tris-甘氨酸緩沖液系統(tǒng)中用4％堆積凝膠和12％分離凝膠顯示提取的玉米醇溶蛋白的分子量分布。簡言之，通過樣品緩沖液：pH7.0的125mM Tris-HCl，2％SDS，10％甘油，5％2-巰基乙醇和0.05％溴酚藍(lán)將玉米醇溶蛋白溶液稀釋至10g/L。將蛋白質(zhì)溶液離心以除去沉淀，將15μL溶液加載到凝膠上。在200V下進(jìn)行電泳60分鐘。凝膠用0.1％考馬斯亮藍(lán)溶液染色。使用范圍為10至200kDa的Bio-rad分子量標(biāo)記(Hercules，California，USA)。玉米醇溶蛋白的選擇性圖像顯示在圖5中。從圖5可以看出，DDGS玉米醇溶蛋白與商業(yè)玉米醇溶蛋白及來自玉米的玉米醇溶蛋白相當(dāng)。

核苷酸

在20L反應(yīng)器中，將來自玉米醇溶蛋白提取的殘余物(自上面)與水(15L)混合，并加熱至60℃，然后加入50g 5-磷酸二酯酶(來自青霉菌來源的核酸酶P1，50g)。將混合物在60℃下攪拌24小時(shí)，并在30分鐘內(nèi)冷卻至40℃。將漿液以3000r/min離心5分鐘。將濾液(約13升)再次過濾以除去少量的白色沉淀。將所得澄清濾液噴霧干燥。干燥過程約需12小時(shí)，得到核苷酸級(jí)分，淡黃色粉末288克(5.6％)。

核苷酸含量的分析：HPLC在與光電二極管陣列檢測(cè)器(PDA)(Waters 2996)和自動(dòng)進(jìn)樣器(Waters 717plus)偶聯(lián)的Waters 2695HPLC系統(tǒng)上進(jìn)行。固定相是HPLC柱，為250×4.6mm，5μmC18柱(Atlantis，Waters)。流動(dòng)相A(K₂HPO₄，0.1M，pH＝5.6)是通過將13.6g K₂HPO₄溶解在1000mL去離子水中，并用2M KOH溶液調(diào)節(jié)pH至5.6而制備。流動(dòng)相B為100％甲醇。溶劑梯度序列示于表3中。核苷酸提取物的HPLC色譜圖示于圖6中。

表3.核苷酸HPLC分析梯度程序

廢DDGS

用少量水洗滌來自核苷酸提取的殘余物(自上面)。用于洗滌殘余物的總水量為1.5L。將殘余物置于烘箱中并在100℃下干燥2天，得到3.00Kg的廢DDGS固體(產(chǎn)率60％)。

廢DDGS的氨基酸譜的HPLC定量：氨基酸的HPLC分析遵循Waters的標(biāo)準(zhǔn)方法：AccQ·Tag。AccQ·Tag衍生化試劑盒和AccQ·Tag洗脫液A購自Waters(Milford，Massachusetts，USA)。流動(dòng)相A由50mL AccQ·Tag洗脫液A濃縮物和500mL去離子水組成，流動(dòng)相B為乙腈，流動(dòng)相C為去離子水。水解產(chǎn)物通過0.45μm微過濾器過濾得到。衍生化程序遵循Waters：將70μL緩沖液和20μL衍生化試劑加入到10μL水解產(chǎn)物中。將混合物搖動(dòng)15秒鐘，然后在55℃下放入加熱器中10分鐘。

表4.氨基酸

總氨基酸：78.8mg/g廢DDGS.

總之，產(chǎn)物產(chǎn)率顯示在下表5中。

表5.DDGS煉油廠5公斤級(jí)產(chǎn)品的產(chǎn)量

實(shí)施例3.DDGS的提取(5kg級(jí))(方法2)

核苷酸

向夾套反應(yīng)器(20L)中加入水(17L)并以100rpm攪拌，然后加入DDGS(5kg)?；旌衔锵喈?dāng)粘稠。加入DDGS后，通過熱循環(huán)器將反應(yīng)器加熱至60℃，需要35分鐘。向溶液中加入5'-磷酸二酯酶(來自青霉菌的核酸酶P1，50g)，并攪拌24小時(shí)。將漿液離心，得到混濁濾液，將其再次離心，得到13.7L液體。對(duì)液體進(jìn)行噴霧干燥，得到740克褐色粘稠固體，其為核苷酸級(jí)分。

玉米醇溶蛋白

向夾套反應(yīng)器中加入乙醇(70％，15L)和來自上述操作的殘余物，并在60℃下攪拌1小時(shí)。溫度冷卻至30℃后，將混合物從反應(yīng)器中分出并離心分離殘余物2和濾液。從濾液中蒸發(fā)揮發(fā)物后，在70℃下真空干燥10小時(shí)后，得到粘稠的固體，產(chǎn)量為297克玉米醇溶蛋白。重復(fù)該步驟，多得到213克固體。玉米醇溶蛋白的總產(chǎn)量為511g。

含生物活性物質(zhì)的油

向夾套反應(yīng)器(20L)中加入乙酸乙酯和乙醇(1：1)并攪拌。向混合物中加入殘余物2并加熱至60℃維持1小時(shí)。將反應(yīng)混合物的溫度冷卻至30℃后，將混合物從反應(yīng)器中分出并離心。收集濾液，并使用相同量的溶劑(20L)，乙酸乙酯和乙醇(1：1)再次提取殘余物，并過濾，得到殘余物3和濾液。蒸發(fā)溶劑后，所得油級(jí)分產(chǎn)率為240g。

廢DDGS

將殘余物3真空干燥，得到3174g固體，其為廢DDGS(深棕色)。

總共，提取5Kg DDGS，得到：

·3174克廢DDGS(63.5％)

·240克油(4.8％)

·511g玉米醇溶蛋白(11％)

·740克核苷酸(14.8％)

產(chǎn)品的總重量為：4665克(回收率為93.3％)。

實(shí)施例4.從DDGS提取的植物化學(xué)成分的生物利用度研究

動(dòng)物研究。三十六只雄性CD-1小鼠(22-24g)購自Charles River Labs(Wilmington，MA)。在研究之前，讓小鼠在SPF設(shè)施中適應(yīng)至少3天。在Cephrim Biosciences，Inc.(Woburn，MA)的機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)(IACUC)批準(zhǔn)的方案或指南下進(jìn)行動(dòng)物的飼養(yǎng)，處理和操作。在每個(gè)籠子中飼養(yǎng)三只小鼠。溫度，濕度和光/黑暗循環(huán)良好地維持在68-76°F，40-60％相對(duì)濕度，具有12小時(shí)光/暗循環(huán)。允許小鼠自由獲得水和食物。

在研究的第一天，將小鼠隨機(jī)分為兩組，即酒精提取物(AE，DDGS)組和油提取物(OE，DDGS)組。將每組小鼠進(jìn)一步分成6個(gè)亞組，代表6個(gè)時(shí)間點(diǎn)(即0小時(shí)，0.5小時(shí)，1.0小時(shí)，3.0小時(shí)，7.0小時(shí)和24小時(shí))。通過口服管飼法給每組小鼠兩個(gè)提取物中的每一個(gè)，劑量為AE 2mL，OE 2mL。給藥時(shí)間設(shè)定為零時(shí)間。通過心臟穿刺收集血液樣品，并立即轉(zhuǎn)移到一組肝素化管中。

在給藥前立即收集在時(shí)間0小時(shí)的血樣。在其余5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，提取物給藥后的時(shí)間-0.5hr，-1.0hr，-3.0hr，-7.0hr和-24hr，從每個(gè)亞組(n＝3)收集血液樣品。將所有血液樣品在收集后置于冰上，并以14000rpm/min旋轉(zhuǎn)。將頂部血漿轉(zhuǎn)移到新的預(yù)標(biāo)記的管中，并將樣品儲(chǔ)存在-70℃直到分析。

血漿中生育酚和類胡蘿卜素的測(cè)定。將小鼠血漿(150μL)與600μL己烷混合，并以200rpm振蕩10分鐘。將混合物在14,000rpm離心6分鐘。將上清液在氮?dú)庀抡舭l(fā)至干，并用100μL甲醇替換。然后將提取物在14,000rpm離心5分鐘，并注入HPLC。

生育酚的HPLC條件：在C30反相柱(250×4.6mm，5μm)上以1mL/min的流速分離化合物。使用甲醇作為流動(dòng)相。將柱保持在6℃。總運(yùn)行時(shí)間為35分鐘。在熒光檢測(cè)器中進(jìn)行檢測(cè)，激發(fā)波長292nm，發(fā)射波長336nm。

類胡蘿卜素的HPLC條件：在DeveloshR水性C30反相柱(250×4.6mm，5μm)上以1mL/min的流速分離化合物。使用雙溶劑梯度系統(tǒng)完成HPLC分離。流動(dòng)相由A)甲醇：MTBE：1％乙酸銨(83：15：2，V/V/V)和B)甲醇：MTBE：1％乙酸銨(8：90：2，V/V/V)。將柱保持在16℃。總運(yùn)行時(shí)間為36分鐘(運(yùn)行后5分鐘)。在450nm檢測(cè)。

血漿中酚類物質(zhì)的測(cè)定。將小鼠血漿(200μL)與12μL10％抗壞血酸-40mM KH₂PO₄-0.1％EDTA，30μl 50mM磷酸鉀(pH 7.4)，350單位來自大腸桿菌的X-A型β-d-葡萄糖醛酸酶(Sigma Chemical Co，St.Louis，MO，USA)和6單位來自鮑魚腸內(nèi)的硫酸酯酶VIII型(Sigma Chemical Co，St.Louis，MO，USA)。將混合物在37℃下孵育45分鐘。通過加入2mL乙酸乙酯，然后劇烈搖動(dòng)20分鐘并在4℃下以2000×g離心5分鐘來終止反應(yīng)。將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的管中，并重復(fù)乙酸乙酯提取。將10μL的0.02％抗壞血酸：0.005％EDTA加入到合并的上清液部分中，并充分渦旋混合。然后將上清液在氮?dú)庀略谑覝叵抡舭l(fā)至干。將樣品在100μL甲醇中重構(gòu)，充分渦旋，超聲處理10分鐘，并離心(14,000rpm，5分鐘)。

酚的HPLC條件：在Phenomenex C18苯基-己基柱(250×4.6mm，5μm)上以1mL/min的流速分離化合物。使用雙溶劑梯度系統(tǒng)完成HPLC分離。流動(dòng)相由A)水：乙酸：乙腈(89：2：9，v/v/v)，加入10mM PBS(pH 3.4)及B)80％乙腈(v/v)，加入1mM PBS(pH 5)組成。將柱保持在20℃?？傔\(yùn)行時(shí)間為50分鐘(運(yùn)行后5分鐘)。使用具有500和800mV的電位設(shè)置的ESA 5600CoulArrray電化學(xué)檢測(cè)器實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。

生物利用度測(cè)試的結(jié)果在圖7-9中顯示。圖7顯示在胃輸注7小時(shí)后發(fā)現(xiàn)小鼠血漿中類胡蘿卜素的最大吸收。如圖8所示，在胃輸注3小時(shí)后發(fā)現(xiàn)小鼠血漿中γ-和α-生育酚的最大吸收，而在胃輸注24小時(shí)后發(fā)現(xiàn)小鼠血漿中δ-生育三烯酚的最大吸收。圖9顯示在胃輸注后0.5小時(shí)發(fā)現(xiàn)小鼠血漿中酚類物質(zhì)的最大吸收。如在該小鼠研究中所證明的，DDGS中鑒定的植物化學(xué)物質(zhì)是生物可利用的。

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等同

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