一種快速檢測(cè)snp位點(diǎn)的四重?zé)晒舛吭噭┖械闹谱鞣椒?br> 【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種直接使用TaqMan探針檢測(cè)SNP位點(diǎn)的試劑盒，涉及到10個(gè)常染色體SNP位點(diǎn)。每個(gè)SNP位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于兩條上下游引物及特異性的兩條TaqMan探針，并且將10個(gè)SNP位點(diǎn)分為5組體系，于單管反應(yīng)體系中同時(shí)對(duì)2個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。探針選擇FAM，HEX，CY5，ROX四種通道。本發(fā)明試劑盒采用四重探針檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)特異性擴(kuò)增，于單個(gè)反應(yīng)體系中檢測(cè)出兩個(gè)SNP位點(diǎn)的信息。此試劑盒用于法醫(yī)個(gè)體診斷，檢測(cè)快捷迅速，個(gè)體識(shí)別率高達(dá)98.14%；又因適用于試劑盒的定量PCR儀器攜帶方便，可車(chē)載直接用于犯罪現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行勘測(cè)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種快速檢測(cè)SNP位點(diǎn)的四重?zé)晒舛吭噭┖?br> 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，具體涉及一種四重(四種探針)實(shí)時(shí)熒光定量PCR在同一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢測(cè)兩個(gè)SNP位點(diǎn)的檢測(cè)方法，總共檢測(cè)10個(gè)SNP位點(diǎn)?？蓱?yīng)用于法醫(yī)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。
【背景技術(shù)】
[0002]SNP是指基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，在群體中的發(fā)生頻率不小于1%。包括單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失等。所謂轉(zhuǎn)換是指同型堿基之間的轉(zhuǎn)換，如嘌呤與嘌呤(G —A)、嘧啶與嘧啶(T —C)間的替換；所謂顛換是指發(fā)生在嘌呤與嘧啶(A — T、A — C、C — G、G — T)之間的替換。依據(jù)排列組合原理，SNP 一共可以有6種替換情況，即A/G、A/T、A/C、C/G、C/T和G/T，但事實(shí)上，轉(zhuǎn)換的發(fā)生頻率占多數(shù)，而且是C/T轉(zhuǎn)換為主，其原因是CpG的C是甲基化的，容易自發(fā)脫氨基形成胸腺嘧啶T，CpG也因此變?yōu)橥蛔儫狳c(diǎn)。
[0003]隨著人類(lèi)基因組序列的繪制完成，生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)正迅速轉(zhuǎn)向?qū)蚬δ?、表達(dá)調(diào)控、多個(gè)基因間以及基因和環(huán)境間相互作用等方面。對(duì)基因組序列中單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)的研究是該階段的重要研究?jī)?nèi)容之一。
[0004]SNP作為人類(lèi)的第三代分子標(biāo)記，具有數(shù)量多、密度大、分布廣等特點(diǎn)，可用于疾病基因的定位與克隆、關(guān)聯(lián)分析等，并在疾病的早期診斷、預(yù)防和治療等方面體現(xiàn)重要功能和應(yīng)用價(jià)值。SNP具有豐富的位點(diǎn)，在基因組中的分布幾乎遍及整個(gè)基因組。據(jù)估計(jì)，平均約1000bp就會(huì)出現(xiàn)一個(gè)SNP，但不同基因組之間、同一基因組不同的染色體之間，編碼區(qū)及非編碼區(qū)的SNP分布頻率都不同。在人類(lèi)基因中，平均每1900個(gè)堿基對(duì)出現(xiàn)I個(gè)SNP。
[0005]因此，SNP標(biāo)記在個(gè)體識(shí)別中亦能提供重要的遺傳數(shù)據(jù)，于法醫(yī)檢測(cè)分析中也極具重要性。現(xiàn)今SNP的分型檢測(cè)技術(shù)種類(lèi)繁多，各有利弊，探索和建立準(zhǔn)確、快速、高通量的SNP檢測(cè)方法仍然十分必要。
[0006]TaqMan探針技術(shù)是一種通過(guò)檢測(cè)PCR過(guò)程中和PCR之后產(chǎn)生的熒光信號(hào)來(lái)區(qū)分等位基因類(lèi)型的SNP檢測(cè)技術(shù)。為特異地識(shí)別待檢SNP位點(diǎn)，需要一對(duì)TaqMan探針及其對(duì)應(yīng)上下引物。這對(duì)探針?lè)謩e檢測(cè)SNP位點(diǎn)的兩種等位基因，其3’端連有熒光淬滅劑，5’端分別連有兩種不同的熒光染料。在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，利用Taq酶5’核酸酶活性降解與目標(biāo)序列完全互補(bǔ)的探針，并使熒光劑與淬滅劑分離而發(fā)出熒光。如果探針與目標(biāo)序列間存在錯(cuò)配，就會(huì)大大減少熒光的釋放量。TaqMan探針技術(shù)最突出的優(yōu)點(diǎn)是不需要分離或洗脫等PCR后處理過(guò)程，從而提高了檢測(cè)速度。
[0007]熒光定量PCR技術(shù)是一項(xiàng)發(fā)展較為成熟的核酸檢測(cè)方法。其優(yōu)勢(shì)在于:操作性強(qiáng)，因閉蓋操作可減少污染，結(jié)果分析快捷。只要選擇體積較小便攜式的儀器，則可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)現(xiàn)場(chǎng)的案件偵測(cè)。故采用熒光定量PCR技術(shù)及TaqMan探針?lè)椒z測(cè)多重SNP位點(diǎn)。
[0008]Thermo PikoReal 熒光定量 PCR 儀器擁有 5 通道，分別是 FAM，HEX, CY5, R0X,SYBGreen等。單個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)需要兩種熒光標(biāo)記的探針?lè)謩e對(duì)應(yīng)于FAM，HEX通道或者CY5，ROX通道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的是提供一種四重實(shí)時(shí)熒光定量PCR的SNP檢測(cè)試劑盒，其可以實(shí)現(xiàn)快速的檢測(cè)，能用于法醫(yī)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)SNP位點(diǎn)。具體的技術(shù)方案如下:
[0010]一種快速檢測(cè)SNP位點(diǎn)的四重?zé)晒舛吭噭┖?，包括有用于擴(kuò)增如下10個(gè)SNP位點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的引物:rs921115(NT_022184)、rsl009480 (NT_022517)、rs560681 (NT_079484)、rs 1019029 (NT_00 7819)、rs7205345 (NT_010552)、rs315791 (NT_0 2313 3)、rsl979255(NT_022792)、 rs7015070(NT_030737)、 rs985492(NT_010966)、rs354439 (NT_009952)。括號(hào)內(nèi)為 genebank 登記號(hào)。
[0011]以上10個(gè)SNP位點(diǎn)均查詢自美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)，屬于非疾病相關(guān)基因，均為單堿基替換的SNP位點(diǎn)，在亞洲人群中存在較高的多態(tài)性；選擇的位點(diǎn)的雙等位基因出現(xiàn)的機(jī)會(huì)較為均等(見(jiàn)表1)，以提高個(gè)體識(shí)別率。
[0012]進(jìn)一步，每個(gè)位點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的引物中包括有上、下游引物和TaqMan探針。
[0013]進(jìn)一步，上述的10個(gè)SNP位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的引物可以以2個(gè)為一組進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增。采用這樣的目的是可以提高檢測(cè)效率，在盡量短的、簡(jiǎn)潔的步驟之內(nèi)就可以完成10個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)。在設(shè)計(jì)引物時(shí)，需要針對(duì)位點(diǎn)所在的序列分別設(shè)計(jì)一條上游引物和下游引物，另外，還需要針對(duì)SNP的位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)一條針對(duì)野生型的引物探針和一條針對(duì)變異型的引物探針，那么對(duì)于一個(gè)位點(diǎn)就會(huì)有4條引物，當(dāng)使用在單管內(nèi)同時(shí)對(duì)2個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行多重?cái)U(kuò)增時(shí)，就會(huì)有8條引物在同一個(gè)擴(kuò)增體系中。
[0014]進(jìn)一步，在試劑盒中還包括有純合子標(biāo)準(zhǔn)品和雜合子標(biāo)準(zhǔn)品。單個(gè)SNP位點(diǎn)具有3種分型，兩種純合子型以及一種雜合子型。針對(duì)一組體系，應(yīng)用到兩種純合子標(biāo)準(zhǔn)品及一種雜合子標(biāo)準(zhǔn)品。此時(shí)，該純合子標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)對(duì)應(yīng)于兩個(gè)SNP位點(diǎn)的純合子型，而雜合子標(biāo)準(zhǔn)品則對(duì)應(yīng)于兩個(gè)SNP位點(diǎn)的雜合子型。標(biāo)準(zhǔn)品均由含SNP位點(diǎn)擴(kuò)增片段的質(zhì)粒組成。故一組體系的純合子標(biāo)準(zhǔn)品則由2種質(zhì)粒構(gòu)成，而雜合子標(biāo)準(zhǔn)品則有4種質(zhì)粒構(gòu)成。體系I的純合子標(biāo)準(zhǔn)品I由rs921115C型及rsl009480C型組成，其對(duì)應(yīng)的檢測(cè)熒光報(bào)告基團(tuán)分別為FAM及CY5，純合子標(biāo)準(zhǔn)品2由rs921115G型及rsl009480T型組成，其檢測(cè)熒光報(bào)告基團(tuán)分別為HEX及R0X，雜合子標(biāo)準(zhǔn)品3則由rs921115C型，rs921115G型，rsl009480C型，及rsl009480T型四種質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品混合而成，其檢測(cè)熒光報(bào)告集團(tuán)分別為FAM，HEX, CY5及R0X。其他體系的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品組合與此類(lèi)似。標(biāo)準(zhǔn)品中同種質(zhì)粒的拷貝數(shù)一致。表1即為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)統(tǒng)計(jì)。標(biāo)準(zhǔn)品的制備可以根據(jù)已經(jīng)公開(kāi)的SNP序列采用常規(guī)的T-A克隆方法制備得到。
[0015]表1各個(gè)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品 的拷貝數(shù)
【權(quán)利要求】
1.一種快速檢測(cè)SNP位點(diǎn)的四重?zé)晒舛吭噭┖?，其特征在?包括有用于擴(kuò)增如下 10 個(gè) SNP 位點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的引物:rs921115、rsl009480、rs560681、rsl019029、rs7205345、rs315791、rsl979255、rs7015070、rs985492 和 rs354439。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)SNP位點(diǎn)的四重?zé)晒舛吭噭┖?，其特征在?還包括有檢測(cè)所述的SNP位點(diǎn)的TaqMan探針。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的快速檢測(cè)SNP位點(diǎn)的四重?zé)晒舛吭噭┖?，其特征在?10個(gè)SNP位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的引物以2個(gè)為一組進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的快速檢測(cè)SNP位點(diǎn)的四重?zé)晒舛吭噭┖?，其特征在?位點(diǎn)的分組如下:第 I 組，rs921115、rsl009480 ;第 2 組，rs560681、rsl019029 ;第 3 組，rs7205345、rs315791 ;第 4 組，rsl979255, rs7015070 ?’第 5 組，rs985492、rs354439。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的快速檢測(cè)SNP位點(diǎn)的四重?zé)晒舛吭噭┖?，其特征在?每個(gè)SNP的位點(diǎn)都對(duì)應(yīng)一條針對(duì)野生型的引物探針和一條針對(duì)變異型的引物探針，以及一對(duì)上、下游引物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的快速檢測(cè)SNP位點(diǎn)的四重?zé)晒舛吭噭┖?，其特征在?在同一個(gè)組中的4個(gè)引物探針是用不同熒光色進(jìn)行標(biāo)記的，4個(gè)引物探針的熒光標(biāo)記色選自FAM、HEX、CY5 或 ROX。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的快速檢測(cè)SNP位點(diǎn)的四重?zé)晒舛吭噭┖?，其特征在于，各個(gè)SNP位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的上、下游引物以及引物探針的序列如下:rs921115、上下游引物SEQ IDN0.1~2，引物探針引物SEQ ID N0.3~4 ;rsl009480、上下游引物SEQ ID N0.5~6，引物探針引物SEQ ID N0.7~8 ;rs560681、上下游引物SEQ ID N0.9~10，引物探針引物SEQ IDN0.11 ~12 ;rsl019029、上下游引物 SEQ ID N0.13 ~14，引物探針引物 SEQ ID N0.15 ~16;rs7205345、上下游引物 SEQ ID N0.17 ~18，引物探針引物 SEQ ID N0.19 ~20 ;rs315791、上下游引物SEQ ID N0.21~22，引物探針引物SEQ ID N0.23~24 ;rsl979255、上下游引物SEQ ID N0.25~26，引物探針引物SEQ ID N0.27~28 ;rs7015070、上下游引物SEQ IDN0.29 ~30，引物探針引物 SEQ ID N0.31 ~32 ;rs985492、上下游引物 SEQ ID N0.33 ~34，引物探針引物SEQ ID N0.35~36 ;rs354439、上下游引物SEQ ID N0.37~38，引物探針引物 SEQ ID N0.39 ~40。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的快速檢測(cè)SNP位點(diǎn)的四重?zé)晒舛吭噭┖?，其特征在?各個(gè)引物在擴(kuò)增體系中的濃度是:
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的快速檢測(cè)SNP位點(diǎn)的四重?zé)晒舛吭噭┖校涮卣髟谟?，試劑盒的反?yīng)體系由如下組成:反應(yīng)混合物8 μ 1，上下游引物和引物探針混合液.4μ 1，C-Taq0.6 μ L, DNA提取液0.5ng~2ng，補(bǔ)水至20 μ L ;所述的反應(yīng)混合物的組成是 Tris-HC150mM, KC150mM, BSA1.2mg/ml, MgCl2 為 2.4mM, dNTP 為 0.2mM,甜菜堿 0.6M,Tween-20體積占2%，剩余成分為水。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)SNP位點(diǎn)的四重?zé)晒舛吭噭┖?，其特征在?擴(kuò)增程序是:25°C Imin收集熒光；95°C 2min熱變性；95°C 15s, 60°C 50s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；.25 °C Imin收集熒光。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103805706SQ201410053694
【公開(kāi)日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2014年2月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月17日
【發(fā)明者】鄭衛(wèi)國(guó), 張帆, 郭育林, 盧青, 葛海鵬 申請(qǐng)人:無(wú)錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司