一種具有高效驅(qū)動活性的啟動子的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種具有高效驅(qū)動活性的啟動子。揭示一種來源于植物Histone3.3基因的多核苷酸，將其作為啟動子元件，可指導(dǎo)目的基因高水平表達(dá)。本發(fā)明的啟動子具有廣泛的活性，能夠指導(dǎo)目的基因高水平表達(dá)。
【專利說明】一種具有高效驅(qū)動活性的啟動子
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)和植物學(xué)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及一種具有高效驅(qū)動活性的啟動子。
【背景技術(shù)】
[0002]在植物基因工程中常用的啟動子按其作用和功能分為三種:組成型啟動子、誘導(dǎo)型啟動子和組織特異型啟動子。其中組成型啟動子最為常用。組成型啟動子分為內(nèi)源組成型和異源組成型啟動子兩大類。植物基因工程中常用的內(nèi)源啟動子主要有水稻肌動蛋白(actin)基因和玉米泛素(ubiquitin)基因的啟動子。異源組成型啟動子有來自農(nóng)桿菌的Nos和Ocs啟動子以及來源于煙草花葉病毒基因的CaMV35S啟動子。組成型啟動子在所有組織中都有表達(dá)，具有持續(xù)性但不具有時(shí)空特異性。重復(fù)使用同一啟動子驅(qū)動兩個(gè)或兩個(gè)以上的外源基因可能引起基因沉默或共抑制現(xiàn)象。然而關(guān)于CaMV35S啟動子在轉(zhuǎn)基因生物安全性角度存在潛在風(fēng)險(xiǎn)的問題報(bào)道比較多。已有文獻(xiàn)報(bào)道認(rèn)為CaMV35S啟動子來源于煙草花葉病毒，一旦在轉(zhuǎn)基因過程中整合到病毒隱性基因附近就有可能激活病毒的表達(dá)，或者CaMV35S啟動子插入到編碼毒素蛋白的基因上游，將增強(qiáng)毒素蛋白的表達(dá)，使得轉(zhuǎn)基因植物的安全性面臨巨大的挑戰(zhàn)。
[0003]真核生物的細(xì)胞核中與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)包括組蛋白和非組蛋白類。組蛋白指細(xì)胞核中與DNA結(jié)合的堿性蛋白質(zhì)的總稱。組蛋白富含精氨酸和賴氨酸等堿性氨基酸，二者加起來約為所有氨基酸殘基的1/4。它們分子量較小，大約10000~20000道爾頓。組蛋白主要有五種——Hl、H2A、H2B、H3、H4，它們具有不同的分子量和氨基酸組成。在五種組蛋白中，四種組蛋白(H2A、H2B、H3、H4)分子量較小(102~135個(gè)氨基酸殘基)，Hl的分子量較大(約含220個(gè)氨基酸殘基)，序列保守程度相對較低，但結(jié)構(gòu)相似，Hl組蛋白其球形中心結(jié)構(gòu)域在進(jìn)化上保守，而 N端和C端兩個(gè)“臂”的氨基酸變異較大，所以Hl在進(jìn)化上不如核小體組蛋白那么保守，在構(gòu)成核小體時(shí)Hl起連接作用，它賦予染色質(zhì)以極性。
[0004]除常規(guī)的組蛋白外，組蛋白還有各種不同的變體，尤其是在核心組蛋白H2A、H3和連接組蛋白Hl中。核心組蛋白H2B和H4變化相對較少。根據(jù)與對應(yīng)的常規(guī)組蛋白氨基酸序列的不同，組蛋白變體可分為兩類:一類是由氨基酸替換產(chǎn)生的變體，氨基酸總數(shù)不變，稱為同型變體(Homomorphous variants),如植物常規(guī)組蛋白H3 (即H3.1)及其變體H3.3。它們之間只在四個(gè)位置氨基酸呈現(xiàn)不同，分別在第31位(H3.1中為甘氨酸，H3.3中為蘇氨酸)、41位(H3.1中為苯丙氨酸，H3.3中為酪氨酸)、87位(H3.1中為半胱氨酸，H3.3中為組氨酸)和90位(H3.1中為甘氨酸，H3.3中為亮氨酸)。雖然H3.1和H3.3之間只有四個(gè)氨基酸的區(qū)別，但它們在染色質(zhì)上的分布和功能有很大不同。H3.1主要在DNA復(fù)制過程中加載入染色質(zhì)，而H3.3則可以不依賴于DNA復(fù)制而加載入間期染色質(zhì)。H3.1主要與沉默的染色質(zhì)有關(guān)，而H3.3主要與轉(zhuǎn)錄活躍的染色質(zhì)有關(guān)。在植物包括擬南芥、水稻和玉米組蛋白H3.3的氨基酸序列分析結(jié)果中發(fā)現(xiàn)植物的組蛋白H3.3非常保守。
[0005]因此，結(jié)合現(xiàn)有的植物工程技術(shù)，對高表達(dá)保守蛋白的啟動子的功能研究是非常必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種具有高效驅(qū)動活性的啟動子及其應(yīng)用。
[0007]在本發(fā)明的第一方面，提供分離的多核苷酸，所述的多核苷酸是:
[0008](I)SEQ ID NO:2所不的核苷酸序列的多核苷酸；
[0009](2) SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列的多核苷酸；
[0010](3) SEQ ID N0:4所不的核苷酸序列的多核苷酸；
[0011](4) SEQ ID NO: 34中(1-743)~1405位所示的核苷酸序列的多核苷酸；
[0012](5) SEQ ID NO: 35中(1-1076)~1369位所示的核苷酸序列的多核苷酸；
[0013](6) SEQ ID NO: 13所不的核苷酸序列的多核苷酸； [0014](7) SEQ ID NO: 14所示的核苷酸序列的多核苷酸；
[0015](8) SEQ ID NO: 15所示的核苷酸序列的多核苷酸；
[0016](9) SEQ ID NO: 16所不的核苷酸序列的多核苷酸；
[0017](IO)SEQ ID NO: 17所示的核苷酸序列的多核苷酸；
[0018](11)核苷酸序列在嚴(yán)格條件下能夠與(I)-(IO)任一限定的多核苷酸序列雜交且具有(I)-(IO)任一限定的多核苷酸功能的多核苷酸；或
[0019](12)核苷酸序列與(I)-(IO)任一限定的多核苷酸序列有80%以上(較佳地85%以上；更佳地90%以上；更佳地95%以上；更佳地99%以上)相同性且具有(I)-(IO)任一限定的多核苷酸功能的多核苷酸。
[0020]在另一優(yōu)選例中，⑷中，包括:SEQID NO:34 中第464-1405位(pHTR4_5 (942bp))所示的核苷酸序列的多核苷酸;SEQ ID NO: 34中第276-1405位(pHTR4_6 (1130bp))所示的核苷酸序列的多核苷酸；或SEQ ID N0:34所示的核苷酸序列的多核苷酸。
[0021]在另一優(yōu)選例中，(5)中，包括:SEQID NO:3 中第201-521 位(pHTR711_2 (521bp))所示的核苷酸序列的多核苷酸；SEQ ID NO:35中第624-1369位(pHTR711_4(746bp))所示的核苷酸序列的多核苷酸；SEQ ID NO: 35中第416-1369位(pHTR711_5 (954bp))所示的核苷酸序列的多核苷酸；SEQ ID NO: 35中第200-1369位(pHTR711_6 (1170bp))所示的核苷酸序列的多核苷酸；或SEQ ID N0:35所示的核苷酸序列的多核苷酸。
[0022]在本發(fā)明的另一方面，提供所述的多核苷酸的用途，用于作為啟動子元件。
[0023]在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的啟動子元件用于指導(dǎo)目的基因強(qiáng)表達(dá)。
[0024]在另一優(yōu)選例中，所述的目的基因是結(jié)構(gòu)基因。
[0025]在另一優(yōu)選例中，所述的目的基因可編碼具有特定功能的蛋白。
[0026]在另一優(yōu)選例中，所述的目的基因是外源基因。
[0027]在本發(fā)明的另一方面，提供一種載體，所述的載體含有所述的多核苷酸，作為啟動子元件。
[0028]在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的載體還含有與所述的多核苷酸操作性連接的目的基因。
[0029]在另一優(yōu)選例中，所述的目的基因位于所述多核苷酸的下游。
[0030]在另一優(yōu)選例中，所述的目的基因位于所述多核苷酸的下游，且與所述多核苷酸的間隔小于1000bp ;優(yōu)選的，小于500bp ;更優(yōu)選的，小于200bp。[0031]在另一優(yōu)選例中，所述的目的基因位于所述多核苷酸的下游，且與所述多核苷酸的間隔小于lOObp，更佳地小于50bp。
[0032]在另一優(yōu)選例中，所述的載體是真核表達(dá)載體。
[0033]在另一優(yōu)選例中，在所述多核苷酸的下游包含多克隆位點(diǎn)或至少一個(gè)酶切位點(diǎn)。
[0034]在本發(fā)明的另一方面，提供一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞(較佳地，所述的宿主細(xì)胞不是動植物繁殖材料)，所述的細(xì)胞:
[0035]含有所述的載體；或其基因組中整合有外源的所述的多核苷酸。
[0036]本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0037]圖1、擬南芥基因HTRl和HTR4啟動子驅(qū)動⑶S基因表達(dá)圖。
[0038]A:pCambial300-CaMV35S-GUS轉(zhuǎn)化煙草，在愈傷組織中⑶S組織化學(xué)染色結(jié)果；
[0039]B:pCambial300-pHTRl-GUS轉(zhuǎn)化煙草，在愈傷組織中⑶S組織化學(xué)染色結(jié)果；
[0040]C:pCambial300-pHTR4-GUS轉(zhuǎn)化煙草，在愈傷組織中⑶S組織化學(xué)染色結(jié)果。
[0041]圖2、擬南芥基因HTRl和HTR4啟動子驅(qū)動⑶S基因表達(dá)圖。
[0042]A:pCambial300-pHTRl-GUS轉(zhuǎn)化煙草，在煙草葉片中⑶S組織化學(xué)染色結(jié)果；
[0043]B:pCambial300-pHTR4-GUS轉(zhuǎn)化煙草，在煙草葉片中⑶S組織化學(xué)染色結(jié)果；
[0044]C:pCambial300-CaMV35S-GUS轉(zhuǎn)化煙草，在煙草葉片中⑶S組織化學(xué)染色結(jié)果。
[0045]圖3、擬南芥基因HTRl和HTR4啟動子驅(qū)動⑶S基因表達(dá)圖。
[0046]Al，A2:pCambial300-pHTRl-GUS轉(zhuǎn)化擬南芥，在擬南芥蓮座葉、莖生葉和花序中的GUS組織化學(xué)染色結(jié)果；
[0047]BI, B2:pCambial300-pHTR4-GUS轉(zhuǎn)化擬南芥，在擬南芥蓮座葉、莖生葉和花序中⑶S組織化學(xué)染色結(jié)果；
[0048]Cl，C2:pCambial300-CaMV35S-GUS轉(zhuǎn)化擬南芥，在擬南芥蓮座葉、莖生葉和花序中⑶S組織化學(xué)染色結(jié)果。
[0049]圖4、轉(zhuǎn)基因擬南芥中HTR1，HTR4和YFP的Ct值差異圖。橫坐標(biāo)為三株樣本，分別是35S-l，35S-2，35S-3 ;縱坐標(biāo)為Ct值。
[0050]圖5、水稻基因HTR711和HTR712啟動子驅(qū)動⑶S基因表達(dá)圖。
[0051]A:pCambial300-CaMV35S-GUS轉(zhuǎn)化中花11愈傷組織，⑶S組織化學(xué)染色結(jié)果；
[0052]B:pCambial300-pHTR711-GUS轉(zhuǎn)化中花11愈傷組織，⑶S組織化學(xué)染色結(jié)果；
[0053]C:pCambia l300-pHTR712-GUS轉(zhuǎn)化中花11愈傷組織，⑶S組織化學(xué)染色結(jié)果。
[0054]圖6、水稻基因HTR711和HTR712啟動子驅(qū)動GFP基因表達(dá)在亞細(xì)胞水平的定位圖。
[0055]A:水稻基因HTR711和HTR712啟動子驅(qū)動GFP基因在三葉期狐尾草葉片細(xì)胞核中的表達(dá)情況；
[0056]B:在單個(gè)狐尾草葉片細(xì)胞中GFP基因的表達(dá)情況；
[0057]C:狐尾草植株(Green foxtail, Setaria viridis (L.)P.Beauv) ?
[0058]圖7、7個(gè)擬南芥基因HTR4啟動子片段示意圖。其中，pHTR4_l (116bp)代表SEQID NO: 2 序列中第 548-663 位；pHTR4-2 (263bp)代表 SEQ ID NO: 2 序列中第 401-663 位；PHTR4-3 (453bp)代表 SEQ ID NO: 2 序列中第 211-663 位；pHTR4_4 (663bp)即 SEQ ID NO: 2序列；pHTR4-5 (942bp)序列如 SEQ ID NO: 34 中第 464-1405 位;pHTR4_6 (1130bp)序列如SEQ ID NO:34 中第 276-1405 位；pHTR4-7(1405bp)序列如 SEQ ID NO:34 序列。
[0059]圖8、7個(gè)水稻基因HTR711啟動子片段示意圖。其中，pHTR711_l (201bp)代表 SEQ ID N0:3 序列中第 321-521 位；pHTR711-2(321bp)代表 SEQ ID N0:3 序列中第201-521 位；pHTR711-3(521bp)代表 SEQ ID NO:3 序列;pHTR711_4(746bp)序列如 SEQID NO:35 中第 624-1369 位；pHTR711-5(954bp)序列如 SEQ ID NO:35 中第 416-1369 位;pHTR711-6(1170bp)序列如 SEQ ID NO:35 中第 200-1369 位;pHTR711_7 序列如 SEQ IDNO:35序列。
[0060]圖9、7個(gè)擬南芥基因HTR4啟動子的熒光圖。
[0061]A:pHTR4-l啟動子的熒光圖；
[0062]B:pHTR4-2啟動子的熒光圖；
[0063]C:pHTR4-3啟動子的熒光圖；
[0064]D:pHTR4-4啟動子的熒光圖；
[0065]E:pHTR4-5啟動子的熒光圖；
[0066]F:pHTR4-6啟動子的熒光圖；
[0067]G:pHTR4_7啟動子的熒光圖。
[0068]圖10、7個(gè)水稻基因HTR711啟動子的熒光圖。
[0069]A:pHTR711-l啟動子的熒光圖；
[0070]B:pHTR711-2啟動子的熒光圖；
[0071]C:pHTR711-3啟動子的熒光圖；
[0072]D:pHTR711-4啟動子的熒光圖；
[0073]E:pHTR711-5啟動子的熒光圖；
[0074]F:pHTR711-6啟動子的熒光圖；
[0075]G:pHTR711_7啟動子的熒光圖。
[0076]圖11、7個(gè)擬南芥基因HTR4和7個(gè)水稻基因HTR711啟動子熒光值的箱體圖。
[0077]A:7個(gè)擬南芥基因HTR4啟動子熒光值的箱體圖；
[0078]B:7個(gè)擬南芥基因HTR711啟動子熒光值的箱體圖。
[0079]圖12、擬南芥基因HTR1、HTR4啟動子及CaMV35S啟動子驅(qū)動⑶S基因表達(dá)圖。
[0080]A:pCambial300-pHTRl-GUS轉(zhuǎn)化擬南芥，在整株中⑶S組織化學(xué)染色結(jié)果；
[0081]B:pCambial300-CaMV35S-GUS轉(zhuǎn)化擬南芥，在整株中⑶S組織化學(xué)染色結(jié)果；
[0082]C:pCambial300-pHTR4-GUS轉(zhuǎn)化擬南芥，在整株中⑶S組織化學(xué)染色結(jié)果。
[0083]圖13、玉米基因HTR101、HTR102、HTR104和HTR113啟動子驅(qū)動⑶S基因表達(dá)圖。
[0084]Al, A2:pCambial300-pHTR101-GUS轉(zhuǎn)化擬南芥，在擬南芥莖生葉和蓮座葉中⑶S組織化學(xué)染色結(jié)果；
[0085]BI, B2:pCambial300-pHTR102-GUS轉(zhuǎn)化擬南芥，在擬南芥莖生葉和蓮座葉中⑶S組織化學(xué)染色結(jié)果；
[0086]Cl，C2:pCambial300-pHTR104-GUS轉(zhuǎn)化擬南芥，在擬南芥莖生葉和蓮座葉中⑶S組織化學(xué)染色結(jié)果；
[0087]Dl, D2:pCambial300-pHTR113-GUS轉(zhuǎn)化擬南芥，在擬南芥莖生葉和蓮座葉中⑶S
組織化學(xué)染色結(jié)果。
[0088]圖14、水稻基因HTR706啟動子驅(qū)動⑶S基因表達(dá)圖。
[0089]A:pCambial300-pHTR706-GUS轉(zhuǎn)化擬南芥，在莖生葉中⑶S組織化學(xué)染色結(jié)果；
[0090]B:pCambial300-pHTR706-GUS轉(zhuǎn)化擬南芥，在蓮座葉中⑶S組織化學(xué)染色結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0091]本發(fā)明人通過廣泛而深入的研究，揭示一種核酸，將其作為啟動子元件，可指導(dǎo)目的基因高水平表達(dá)。本發(fā)明的啟動子來源于HiStone3.3基因的啟動子區(qū)域。本發(fā)明的啟動子具有廣泛的活性，能夠指導(dǎo)目的基因高水平表達(dá)(強(qiáng)表達(dá))。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0092]如本文所用，所述的“啟動子”或“啟動子區(qū)(域)”是指一種核酸序列，其通常存在于目的基因編碼序列的上游(5’端)，能夠引導(dǎo)核酸序列轉(zhuǎn)錄為mRNA。一般地，啟動子或啟動子區(qū)提供RNA聚合酶和正確起始轉(zhuǎn)錄所必需的其它因子的識別位點(diǎn)。在本文中，所述的啟動子或啟動子區(qū)包括啟動子的變體，其通過插入或刪除調(diào)控區(qū)域，進(jìn)行隨機(jī)或定點(diǎn)突變等來獲得。
[0093]如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然 環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
[0094]如本文所用，所述的“可操作地連接”或“操作性連接”是指兩個(gè)或多個(gè)核酸區(qū)域或核酸序列的功能性的空間排列。例如:啟動子區(qū)被置于相對于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的轉(zhuǎn)錄受到該啟動子區(qū)域的引導(dǎo)，從而，啟動子區(qū)域被“可操作地連接”到該核酸序列上。
[0095]如本文所用，所述的“高水平表達(dá)”是指:利用本發(fā)明的啟動子指導(dǎo)一目的基因(如GUS基因)的表達(dá)與CaMV35S啟動子指導(dǎo)該目的基因表達(dá)相比，利用本發(fā)明的啟動子所得的表達(dá)量顯著更高。蛋白表達(dá)量的檢測是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)。
[0096]如本文所用，所述的“SEQ ID NO:34中(1-743)~1405位所示的核苷酸序列”也即指所述序列可起始于SEQ ID NO:34中第I位至第743位中的任一位的堿基，終止于SEQID NO:1中第1405位的堿基。
[0097]如本文所用，所述的“SEQ ID NO:35中(1-1076)~1369位所示的核苷酸序列”也即指所述序列可起始于SEQ ID NO: 35中第I位至第1076位中的任一位的堿基，終止于SEQID NO:1中第1369位的堿基。
[0098]啟動子及其指導(dǎo)的基因表達(dá)
[0099]基于本發(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)，提供一種分離的核酸，所述的核酸具有SEQ ID NO:2,SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQID NO: 17所示的核苷酸序列或這些序列的片段以及含有這些序列的長度更長的核苷酸序列，所述的核酸可作為指導(dǎo)目的基因表達(dá)的啟動子元件。[0100]此外,本發(fā)明還包括上述核酸的一些具有相同功能的變異體。包括:
[0101]序列在嚴(yán)格條件下能夠與SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4、SEQ IDNO: 13,SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 16,SEQ ID NO: 17 所示的核苷酸序列或其片段或延長序列雜交且具有指導(dǎo)目的基因高水平表達(dá)功能的核酸；或
[0102]序列與SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 16,SEQ ID NO: 17所示的核苷酸序列或其片段或延長序列有80%以上同源性且具有指導(dǎo)目的基因高水平表達(dá)功能的核酸；或
[0103]序列與SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17所示的核苷酸序列或其片段或延長序列互補(bǔ)(優(yōu)選完全互補(bǔ))的核酸。
[0104]多核苷酸的雜交是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)，特定的一對核酸的雜交特性指示它們的相似性或同一性。因此，本發(fā)明還涉及與SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17 所示的核苷酸序列或其片段或延長序列雜交且兩個(gè) 序列之間具有至少50%，較佳地至少70%，更佳地至少80%(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%)相同性的核酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述核酸可雜交的多核苷酸。
[0105]在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指:(1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2XSSC，0.1%SDS，60°C;或⑵雜交時(shí)加有變性劑，如50%(v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.l%Ficoll，42°C等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90%以上，更好是95%以上時(shí)才發(fā)生雜交。并且，可雜交的核酸也具有指導(dǎo)目的基因高水平表達(dá)的功能。
[0106]在本發(fā)明的實(shí)例中，在本發(fā)明的啟動子的指導(dǎo)下，可以使GUS基因或GFP基因高水平地表達(dá)。因此可見，本發(fā)明的啟動子是一種特別適合于指導(dǎo)目的基因表達(dá)的啟動子，在基因表達(dá)的研究中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
[0107]本發(fā)明的啟動子可以被可操作地連接到目的基因上，該目的基因相對于啟動子而言可以是外源(異源)的。所述的目的基因通?？梢允侨魏魏怂嵝蛄?如一種結(jié)構(gòu)性核酸序列)，所述的目的基因優(yōu)選編碼具有特定功能的蛋白，例如某些具有重要特性或功能的蛋白。
[0108]例如，所述的目的基因包括但不限于:GUS基因、GFP基因、熒光素酶基因等。GUS作為一種代表性的指示基因表達(dá)狀況的工具，可良好地指示由啟動子指導(dǎo)的基因表達(dá)情況。而由本發(fā)明的啟動子可指導(dǎo)GUS高表達(dá)這一實(shí)例，可顯而易見地得知本發(fā)明的啟動子作為基因調(diào)控兀件，可指導(dǎo)其它任何合適的基因的聞表達(dá)。
[0109]作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的目的基因可以是一種對于某一植物或特定植物組織或器官而言缺失或表達(dá)量不足的基因，可將該目的基因與本發(fā)明的啟動子可操作地連接，或?qū)⒛康幕蚺c本發(fā)明的啟動子可操作的連接入合適的載體中，采取適當(dāng)?shù)姆绞綄?dǎo)入到適當(dāng)?shù)募?xì)胞內(nèi)，并傳遞到該植物或特定植物組織或器官內(nèi)，從而驅(qū)動目的基因高水平地表達(dá)。
[0110]所述的“植物”沒有特別的限制，只要該植物適合進(jìn)行基因的轉(zhuǎn)化操作(轉(zhuǎn)基因操作)，如各種農(nóng)作物、花卉植物、或林業(yè)植物等。所述的植物比如可以是:雙子葉植物、單子葉植物、或裸子植物。例如但不限于:十字花科(如蕓薹屬的大白菜、小白菜)，十字花科(如鼠耳芥屬植物(如擬南芥))，禾本科(如水稻)，茄科(如煙草)，此外還包括瓜果、蔬菜、油菜等等。更具體地，所述的植物包括(但不限于):小麥、大麥、黑麥、水稻、玉米、高梁、甜菜、蘋果、梨、李、桃、杏、樓桃、草莓、木莓、黑莓、豆、扁豆、豌豆、大豆、油菜、芥、Il粟、齊墩果、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、花生、葫蘆、黃瓜、西瓜、棉花、亞麻、大麻、黃麻、柑桔、梓檬、葡萄柚、菠菜、苘苣、蘆笑、洋白菜、大白菜、小白菜、胡蘿卜、洋蔥、土豆、西紅柿、青椒、鱷梨、桂皮、樟腦、煙葉、堅(jiān)果、咖啡、茄子、甘蔗、茶葉、胡椒、葡萄樹、蠔麻草、香蕉、天然橡膠樹和觀賞植物等。
[0111]本發(fā)明的啟動子還可以被可操作地連接到被改進(jìn)的目的基因序列上，該目的基因相對于啟動子是外源(異源)的。所述的目的基因可以被改進(jìn)來產(chǎn)生各種期望的特性。例如，目的基因可以被改進(jìn)來增加必需氨基酸的含量，提高氨基酸序列的翻譯，改變翻譯后的修飾(如磷酸化位點(diǎn))，將翻譯產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，改善蛋白的穩(wěn)定性，插入或刪除細(xì)胞信
V寸O
[0112]此外，啟動子和目的基因可以設(shè)計(jì)成下調(diào)特定基因。這一般是通過將啟動子連接到目的基因序列上來實(shí)現(xiàn)，該序列以反義反向被引導(dǎo)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟悉這種反義技術(shù)。任何核酸序列可以以這種方式被調(diào)節(jié)。
[0113]本發(fā)明的啟動子和目的基因序列可被包含在重組載體中。 [0114]所述的重組載體一般包括(從5’到3’方向):引導(dǎo)目的基因轉(zhuǎn)錄的啟動子，和目的基因。如果需要，所述的重組載體還可以包括3’轉(zhuǎn)錄終止子，3’多聚核苷酸化信號，其它非翻譯核酸序列，轉(zhuǎn)運(yùn)和靶向核酸序列、抗性選擇標(biāo)記、增強(qiáng)子或操作子。
[0115]作為一種方式，所述的重組載體包括本發(fā)明的啟動子，在所述啟動子的下游包含多克隆位點(diǎn)或至少一個(gè)酶切位點(diǎn)。當(dāng)需要表達(dá)目的基因時(shí)，將目的基因連接入適合的多克隆位點(diǎn)或酶切位點(diǎn)內(nèi)，從而將目的基因與啟動子可操作地連接。
[0116]用于制備重組載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。術(shù)語“表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、病毒或其他載體。總之，只要其能夠在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都是可以被采用的。優(yōu)選的，所述的表達(dá)載體是真核表達(dá)載體。
[0117]本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含有本發(fā)明所述的啟動子和/或目的基因序列的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。
[0118]此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如二氫葉酸還原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及綠色熒光蛋白O^FP)、⑶S 等。
[0119]重組載體中除了含有本發(fā)明的啟動子，還可含有一種或多種其它啟動子。所述的其它啟動子例如是:組織特異性的、組成型的或誘導(dǎo)型的。例如甘露氨酸合成酶的花椰菜花葉病毒 19S 和 35S(CaMV19S CaMV35S)、增強(qiáng)的 CaMV、煙草 RB7 等。
[0120]作為本發(fā)明的一種實(shí)例,所述的載體是pCambia系列載體。即利用pCambia上的多克隆位點(diǎn)，可將本發(fā)明的啟動子區(qū)域構(gòu)建到報(bào)告基因如GUS或GFP的前面，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，啟動子激活GUS或GFP編碼基因的表達(dá)，所述啟動受到啟動子區(qū)各順式作用元件的調(diào)控，模擬了基因在體內(nèi)被激活轉(zhuǎn)錄的狀況。
[0121]包含上述適當(dāng)?shù)膯幼雍湍康幕虻妮d體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
[0122]宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如植物細(xì)胞。代表性例子有:大腸桿菌，酵母，動物的組織細(xì)胞，植物細(xì)胞等。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體和宿主細(xì)胞。
[0123]本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，如果在載體中插入增強(qiáng)子序列時(shí)將會使轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個(gè)堿基對，作用于啟動子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄。
[0124]本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動子、增強(qiáng)子或宿主細(xì)胞。
[0125]用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法:磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。轉(zhuǎn)化植物也可使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化或基因槍轉(zhuǎn)化等方法，例如葉盤法、幼胚轉(zhuǎn)化法、花芽浸泡法等。對于轉(zhuǎn)化的植物組織或器官可以用常規(guī)方法再生成植株，從而獲得轉(zhuǎn)基因的植物。
[0126]作為一種方式，制備轉(zhuǎn)基因植物的方法是:將攜帶啟動子和目的基因(兩者可操作地連接)的雙元載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，農(nóng)桿菌再將含啟動子和目的基因的載體片段整合到植物的染色體上。涉及的轉(zhuǎn)基因受體植物例如是擬南芥、煙草和水稻。
[0127]本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于:
[0128](I)揭示一種可指導(dǎo)目的基因高水平表達(dá)的啟動子，利用本發(fā)明的啟動子可以高強(qiáng)度地啟動目的基因的大量表達(dá)。
[0129](2)本發(fā)明為外源基因表達(dá)導(dǎo)致相關(guān)基因沉默的現(xiàn)象以及水稻育種過程中引進(jìn)的外源啟動子如Cauliflower Mosaic Virus35S Promoter (CaMV35S)存在潛在的生物安全性風(fēng)險(xiǎn)等問題提供了一種新的解決途徑。
[0130]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。
[0131]除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。
[0132]實(shí)施例1、啟動子的獲得
[0133]本發(fā)明分別克隆了擬南芥組蛋白變體H3.3基因HTR4(AT4G40030)以及水稻組蛋白基因 HTR711(L0C_0s03g27310)和 HTR712 (L0C_0s06g04030)的 5’端調(diào)控區(qū)啟動子。擬南芥基因HTR4啟動子序列如SEQ ID NO:2 ;水稻基因HTR711啟動子序列如SEQ ID NO:3 ;水稻基因HTR712啟動子序列如SEQ ID NO:4 ;擬南芥基因HTRl啟動子序列如SEQ ID NO:1,作為對照。 [0134]上述啟動子序列可用于構(gòu)建報(bào)告基因表達(dá)載體。
[0135]實(shí)施例2、擬南芥基因HTR4啟動子驅(qū)動⑶S基因表達(dá)的活性檢測[0136]1、轉(zhuǎn)基因煙草GUS組織化學(xué)染色檢測啟動子活性
[0137]在擬南芥基因HTRl和HTR4啟動子、CaMV35S的驅(qū)動下，以⑶S為報(bào)告基因構(gòu)建植物表達(dá)載體 pHTRl-GUS、pHTR4-GUS 及 CaMV35S_GUS。
[0138]擬南芥基因HTR1、HTR4啟動子、CaMV35S序列分別插入到pCambial300表達(dá)載體(購自Cambia公司)的HindIII和BamHI酶切位點(diǎn)中(即位于⑶S報(bào)告基因的上游)。⑶S兀件插入到pCambial300的BamHI和SacI酶切位點(diǎn)。
[0139]獲得的重組載體分別命名為:pCambial300-pHTRl-GUS、pCambial300-pHTR4_GUS及 pCambial300-CaMV35S-GUS。 [0140]將構(gòu)建的重組載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105 (參見Hood, E.E.等，TransgenicRes.，1993，2，208 - 218)，篩選陽性克隆。以獲得的含有目的基因質(zhì)粒的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染煙草葉片，共培養(yǎng)2天后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基，去除殘余的農(nóng)桿菌。大約I個(gè)月左右將感染了農(nóng)桿菌的陽性愈傷組織進(jìn)行組織化學(xué)染色，檢測GUS基因的瞬時(shí)表達(dá)。待煙草長出抗性不定芽之后，將芽切下轉(zhuǎn)入含有抗性的生根培養(yǎng)基中，約一個(gè)月左右將生根的煙草小苗轉(zhuǎn)入盆中，在溫室中培養(yǎng)，I個(gè)月左右取葉片進(jìn)行組織化學(xué)染色檢測GUS基因的瞬時(shí)表達(dá)。
[0141]將共培養(yǎng)的愈傷組織或葉片用滅菌蒸餾水漂洗后置于1.5ml離心管中，加入沒過愈傷組織的GUS染色液并混勻，使愈傷組織與染色液充分接觸；于37°C溫浴2小時(shí)或過夜；以70%的乙醇為脫色液對愈傷組織進(jìn)行脫色并觀察藍(lán)色斑點(diǎn)。
[0142]HTR4(H3.3)的啟動子主要在細(xì)胞間期高度表達(dá)，在營養(yǎng)器官高水平組成性表達(dá)。HTRl (H3.1)的表達(dá)是與DNA復(fù)制緊密相關(guān)的，在DNA復(fù)制過程中即S期H3.1大量合成。⑶S組織化學(xué)染色結(jié)果表明了在煙草愈傷組織中擬南芥基因HTRl啟動子驅(qū)動的GUS基因的表達(dá)活性明顯高于HTR4和CaMV35S驅(qū)動的⑶S表達(dá)活性，如圖1所示。
[0143]在轉(zhuǎn)基因煙草葉片中，擬南芥基因HTR4啟動子驅(qū)動的⑶S基因的表達(dá)活性明顯高于HTRl驅(qū)動的⑶S表達(dá)活性，如圖2所示。但是，在不同時(shí)期，擬南芥基因HTRl和HTR4啟動子的驅(qū)動活性均比常用的組成型啟動子CaMV35S的活性高。
[0144]2、轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS組織化學(xué)染色檢測啟動子活性
[0145]將構(gòu)建的植物表達(dá)載體pCambial300-pHTRl-GUS、pCambial300-pHTR4_GUS 及pCambial300-CaMV35S-GUS轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101 (Invitrogen)，篩選陽性克隆。以獲得的含有目的基因質(zhì)粒的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染擬南芥花序，用保鮮膜包裹擬南芥苗后暗培養(yǎng)2天，之后轉(zhuǎn)入光培養(yǎng)，在溫室培養(yǎng)約I個(gè)半月后收集種子。在篩選培養(yǎng)基上篩選TO代種子，鑒定Tl代苗后轉(zhuǎn)入盆中，在溫室培養(yǎng)2周后，取葉片進(jìn)行組織化學(xué)染色檢測GUS基因的瞬時(shí)表達(dá)。
[0146]在轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片(尤其在花序)中，擬南芥基因HTR4啟動子驅(qū)動的GUS基因的表達(dá)活性明顯高于HTRl和CaMV35S驅(qū)動的⑶S表達(dá)活性，⑶S染色最明顯，如圖3所示。以上實(shí)驗(yàn)說明在不同生長時(shí)期，擬南芥基因HTR4啟動子的驅(qū)動活性較常用的組成型啟動子CaMV35S的活性高。
[0147]3、定量RT-PCR(qRT-PCR)方法檢測啟動子活性
[0148]構(gòu)建植物表達(dá)載體pCambial301-CaMV35S-Copl-YFP:將CaMV35S啟動子片段克隆到載體pCambial301 (購自Cambia公司)的HindIII和BamHI酶切位點(diǎn)；之后將cop I (以擬南芥 cDNA 為模板，以 sall-copl-5:CCCGTCGACATGGAAGAGATTTCGACGGATCCGG(SEQ IDNO:5) ；spe1-copl-3:CCCACTAGTCGCAGCGAGTACCAGAACTTTG (SEQ ID NO:6)為引物的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物)片段克隆到載體上的SalI和SpeI位點(diǎn)；將YFP片段克隆到載體的SpeI和SacI位點(diǎn)。
[0149]將構(gòu)建的植物表達(dá)載體pCambial301-CaMV35S-Copl_YFP轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101 (Invitrogen)，篩選陽性克隆。以獲得的含有目的基因質(zhì)粒的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染擬南芥花序，用保鮮膜包裹擬南芥苗后暗培養(yǎng)2天，之后轉(zhuǎn)入光培養(yǎng)，在溫室培養(yǎng)約I個(gè)半月后收集種子。在篩選培養(yǎng)基上篩選TO代種子，鑒定Tl代苗后轉(zhuǎn)入盆中，在溫室培養(yǎng)2周后，取葉片抽提RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后做定量PCR反應(yīng)。
[0150]HTRl和HTR4啟動子(內(nèi)源)的表達(dá)水平可以通過檢測HTRl和HTR4基因cDNA的表達(dá)來反映，因?yàn)镃opl是擬南芥的內(nèi)源基因，所以通過檢測YFP的活性來反映CaMV35S啟動子的表達(dá)水平。
[0151]RT-PCR檢測引物如下:
[0152]HTRl:F:CGTACCAAGCAAACCGCAAGGAAA(SEQ ID NO:7)；
[0153]R:AGGACGGAATCTGTGTGGCTTCTT(SEQ ID NO:8)；
[0154]HTR4:F:TGCACCAACTACTGGTGGAGTCAA(SEQ ID NO:9)；
[0155]R:AGCTAAGACAGCATGGCTCTGGAA(SEQ ID NO:10)；
[0156]YFP:F:TGACCCTGAAGTTCATCTGCACCA(SEQ ID NO:11)；
[0157]R:TCTTGTAG TTGCCGTCGTCCTTGA(SEQ ID NO:12)。
[0158]圖4顯示了 HTR1，HTR4，YFP基因Ct值的差異圖，本發(fā)明人選取了 3株轉(zhuǎn)pCamb i a 1301 -CaMV3 5 S-Cop 1-YFP的轉(zhuǎn)基因擬南芥苗作為材料，橫坐標(biāo)為3個(gè)樣本(35S-1，35S-2，35S-3)，縱坐標(biāo)為 Ct 值。
[0159]定量的結(jié)果顯示三個(gè)材料中，HTR4基因的Ct值最小，HTRl比YFP略低。這就反映了在三株轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片中，HTR4啟動子的表達(dá)是最強(qiáng)的。
[0160]實(shí)施例3、水稻基因HTR711和HTR712啟動子驅(qū)動⑶S基因表達(dá)
[0161]在水稻基因HTR711和HTR712啟動子的驅(qū)動下，以⑶S為報(bào)告基因構(gòu)建植物表達(dá)載體 pCambial300-pHTR711-GUS、pCambial300-pHTR712_GUS 及 pCambial300-CaMV35S_GUS，將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，篩選陽性克隆。
[0162]水稻基因HTR711和HTR712啟動子、CaMV35S序列分別插入到pCambial300表達(dá)載體的HindIII和BamHI酶切位點(diǎn)中(即位于⑶S報(bào)告基因的上游)。⑶S元件插入到pCambial300 的 BamHI 和 SacI 酶切位點(diǎn)。
[0163]以獲得的含有目的質(zhì)粒的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染水稻轉(zhuǎn)化受體(中花11)的愈傷組織，共培養(yǎng)兩天后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基，去除殘余的農(nóng)桿菌；三天后將感染了農(nóng)桿菌的陽性愈傷組織進(jìn)行組織化學(xué)染色檢測⑶S基因的瞬時(shí)表達(dá)。將共培養(yǎng)的愈傷組織用滅菌蒸餾水漂洗后置于1.5ml離心管中，加入沒過愈傷組織的GUS染色液并混勻，使愈傷組織與染色液充分接觸；于37°C溫浴2小時(shí)或過夜；以70%的乙醇為脫色液對愈傷組織進(jìn)行脫色并觀察藍(lán)色斑點(diǎn)。
[0164]⑶S組織化學(xué)染色結(jié)果表明，水稻基因HTR711和HTR712啟動子驅(qū)動的⑶S基因的表達(dá)活性較CaMV35S驅(qū)動的⑶S表達(dá)活性高，如圖5所示。
[0165]以上實(shí)驗(yàn)說明，水稻基因HTR711和HTR712啟動子的驅(qū)動活性較常用的組成型啟動子CaMV35S的活性高。
[0166]實(shí)施例4、水稻基因HTR711和HTR712啟動子驅(qū)動GFP基因瞬間表達(dá)分析[0167]在水稻基因HTR711和HTR712啟動子驅(qū)動下，以綠色熒光蛋白(GFP)為報(bào)告基因，構(gòu)建植物表達(dá)載體 pCambial300-pHTR711-GFP 和 pCambial300-pHTR712_GFP。
[0168]水稻基因HTR711和HTR712啟動子、CaMV35S序列分別插入到pCambial300表達(dá)載體的HindIII和BamHI酶切位點(diǎn)中(即位于GFP基因的上游)。GFP元件插入到pCambial300的BamHI和SacI酶切位點(diǎn)。
[0169]將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，篩選陽性克隆。選擇三葉期的狐尾草(Green foxtail, Setaria viridis (L.)P.Beauv)為瞬間表達(dá)受體材料。挑取pCamb ial 300-pHTR711-GFP 和 pCambial300-pHTR712_GFP 陽性菌株 EHA105 的單克隆在280C，200rpm培養(yǎng)至OD600為0.8左右。取1.5ml菌液于1.5ml滅菌離心管中，4°C，2000rpm離心5分鐘，棄上清；向收集的菌體中加入1ml滅菌蒸餾水，重懸菌液，4°C，2000rpm離心5分鐘，棄上清。向收集的菌體中加入滅菌蒸餾水至0D_為0.8左右用于注射植物葉片。取較健康幼嫩的三葉期狐尾草葉片進(jìn)行注射實(shí)驗(yàn)，將注射葉片區(qū)域作好標(biāo)記。兩天后取注射區(qū)域的葉片進(jìn)行顯微觀察實(shí)驗(yàn)。以去卷積熒光顯微鏡觀察pCamb ial 300-pHTR711-GFP和pCambial300-pHTR712-GFP質(zhì)粒在狐尾草葉片中的表達(dá)狀況。取注射區(qū)域I~2cm2大小的葉片置于加有一滴蒸餾水的載玻片上，以放大倍數(shù)為60倍的水鏡鏡頭觀察GFP的表達(dá)情況。
[0170]如圖6，在水稻基因HTR711和HTR712啟動子的驅(qū)動下，GFP基因在狐尾草葉片細(xì)胞核內(nèi)有強(qiáng)的表達(dá)。
[0171]實(shí)施例5、擬南芥基因HTR4以及水稻基因HTR711啟動子關(guān)鍵位點(diǎn)分析
[0172]對于PHTR4和pHTR711兩個(gè)啟動子，分別取長短不一的7個(gè)片段，以鑒定其關(guān)鍵位點(diǎn)。pHTR4和pHTR711兩個(gè)啟動子各自構(gòu)建了 7個(gè)片段，見圖7和8。分別以擬南芥和水稻基因組為模板，以表1引物(注:應(yīng)用正向引物為pHTR4-(l~7)-KpnI時(shí)，反向引物均是反向PHTR4-R-BamHI ;應(yīng)用正向引物為PHTR711_(1~7)_HindIII時(shí)，反向引物均是反向PHTR711-R-BamHI)來擴(kuò)增所述片段，以黃色熒光蛋白(YFP)為報(bào)告基因的植物表達(dá)載體，各自構(gòu)建7個(gè)載體，引物序列見表1。
[0173]表1、7個(gè)擬南芥基因HTR4和7個(gè)水稻基因HTR711啟動子引物序列
[0174]
【權(quán)利要求】
1.分離的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸是: (1)SEQID N0:2所示的核苷酸序列的多核苷酸； (2)SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列的多核苷酸； (3)SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列的多核苷酸； (4)SEQ ID NO: 34中(1-743)~1405位所示的核苷酸序列的多核苷酸； (5)SEQ ID NO: 35中(1-1076)~1369位所示的核苷酸序列的多核苷酸； (6)SEQ ID NO: 13所示的核苷酸序列的多核苷酸； (7)SEQ ID NO: 14所示的核苷酸序列的多核苷酸； (8)SEQ ID NO: 15所示的核苷酸序列的多核苷酸； (9)SEQ ID NO: 16所示的核苷酸序列的多核苷酸； (10)SEQID NO: 17所示的核苷酸序列的多核苷酸； (11)核苷酸序列在嚴(yán)格條件下能夠與(I)-(IO)任一限定的多核苷酸序列雜交且具有(I)-(IO)任一限定的多核苷酸功能的多核苷酸；或 (12)核苷酸序列與(I)-(IO)任一限定的多核苷酸序列有80%以上相同性且具有(I)-(IO)任一限定的多核苷酸功能的多核苷酸。
2.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，(4)中，包括: SEQ ID NO: 34中第464-1405位(pHTR4_5 (942bp))所示的核苷酸序列的多核苷酸； SEQ ID NO: 34中第276-1405位(pHTR4_6 (1130bp))所示的核苷酸序列的多核苷酸；或 SEQ ID NO:34所示的核苷酸序列的多核苷酸。
3.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，(5)中，包括: SEQ ID NO: 3中第201-521位(pHTR711_3 (521bp))所示的核苷酸序列的多核苷酸； SEQ ID NO:35中第624-1369位(pHTR711_4(746bp))所示的核苷酸序列的多核苷酸； SEQ ID NO: 35中第416-1369位(pHTR711_5 (954bp))所示的核苷酸序列的多核苷酸； SEQ ID NO: 35中第200-1369位(pHTR711_6 (1170bp))所示的核苷酸序列的多核苷酸；或 SEQ ID NO:35所示的核苷酸序列的多核苷酸。
4.權(quán)利要求1所述的多核苷酸的用途，用于作為啟動子元件。
5.如權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述的啟動子元件用于指導(dǎo)目的基因強(qiáng)表達(dá)。
6.—種載體，其特征在于，所述的載體含有權(quán)利要求1所述的多核苷酸，作為啟動子兀件。
7.如權(quán)利要求6所述的載體，其特征在于，所述的載體還含有與所述的多核苷酸操作性連接的目的基因。
8.如權(quán)利要求7所述的載體，其特征在于，所述的目的基因位于所述多核苷酸的下游。
9.如權(quán)利要求8所述的載體，其特征在于，所述的目的基因位于所述多核苷酸的下游，且與所述多核苷酸的間隔小于lOObp，更佳地小于50bp。
10.如權(quán)利要求8所述的載體，其特征在于，所述的載體是真核表達(dá)載體。
11.如權(quán)利要求8所述的載體，其特征在于，在所述多核苷酸的下游包含多克隆位點(diǎn)或至少一個(gè)酶切位點(diǎn)。
12.—種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的細(xì)胞: 含有權(quán)利要求6-11任一所述的載體；或 其基因組中整合有外源 的權(quán)利要求1所述的多核苷酸。
【文檔編號】C12N15/113GK104004761SQ201410066961
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年2月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月26日
【發(fā)明者】方玉達(dá), 夏溪 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院