提高水稻苗期耐冷性的基因Os09g0410300及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提高水稻苗期耐冷性的基因Os09g0410300及其應(yīng)用。水稻苗期耐冷性的基因Os09g0410300的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。本發(fā)明首次證明了水稻基因Os09g0410300是水稻苗期耐冷功能基因。前人報道該基因是BR信號途徑中的基因。該基因的克隆和生物學功能驗證對于水稻苗期耐冷的分子機制研究，以及BR信號途徑在水稻耐冷中發(fā)揮的作用的研究有重要的參考意義。
【專利說明】提高水稻苗期耐冷性的基因0s09g0410300及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明屬于基因領(lǐng)域，具體涉及一種提高水稻苗期耐冷性的基因0s09g0410300
及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】:
[0002]水稻是重要的糧食作物，是我國第一大糧食作物。水稻起源于熱帶、亞熱帶，是喜溫植物，因此對低溫冷害非常敏感。水稻冷害是目前世界水稻栽培中一個嚴重而又普遍的問題，每年全世界因冷害減產(chǎn)的稻谷達30-50億公斤。同時，水稻的耐冷性差嚴重影響了水稻在全球的種植面積，限制了水稻在高緯度地區(qū)和高海拔地區(qū)的種植。
[0003]在我國南方地區(qū)，水稻的冷害問題同樣非常嚴重。在我國南方的雙季稻產(chǎn)區(qū)，每年3-4月都有可能出現(xiàn)的低溫陰雨天氣，是我國南方地區(qū)早稻播種育秧期的主要災(zāi)害天氣。苗期的低溫會嚴重影響秧苗的生長，造成秧苗生長緩慢，甚至造成爛秧。根據(jù)廣東省氣候與農(nóng)業(yè)氣象中心的資料，廣東春季低溫陰雨平均每年出現(xiàn)1-3次，常造成早稻大面積爛秧死苗，不但損失大量種子，而且延誤播種季節(jié)，使早稻成熟期延遲，影響晚稻播種，使晚稻在抽穗揚花期延遲而可能受到9-10月的寒露風影響。近年來隨著全球氣候變化，極端和異常天氣出現(xiàn)的頻率增加，對水稻冷害的防治顯得更加重要?？梢?，水稻苗期的耐冷性問題是華南雙季稻地區(qū)急待解決的問題。因此，研究解決水稻苗期耐冷性問題對促進水稻生產(chǎn)、確保我國的糧食安全有重大意義。
[0004]前通過資源篩選機遺傳分析，已經(jīng)定位了大量水稻苗期耐冷數(shù)量性狀位點(QTL)，但只有少數(shù)幾個被克隆。因此能應(yīng)用于實際生產(chǎn)的基因非常少，目前尚未見這些QTL應(yīng)用于分子育種改良水稻耐冷性的報道。另一方面，通過分子生物學及反向遺傳學的方法，目前已經(jīng)鑒定了大量水稻耐冷相關(guān)的基因及其分子機制。如水稻中的DREB(dehydration-responsive element binding)基因家族，能夠通過結(jié)合下游基因啟動子中的DRE順式元件，激活下游耐冷相`關(guān)基因的表達，是水稻耐冷信號途徑的上游信號基因。實驗證明，在水稻中過表達OsDREBI可以明顯提高水稻的耐冷性(Functional Analysisof Rice DREBl/CBF-type Transcription Factors Involved in Cold-responsive GeneExpression in Transgenic Rice)。過表達某些冷脅迫響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，如0sNAC5等，也被證明能夠通過提高下游冷響應(yīng)信號途徑的基因表達而提高水稻的耐冷性。其他通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)提供水稻耐冷性的基因包括糖代謝途徑過程的酶(Overexpression of thetrehalose-6-phosphate synthase gene OsTPSlenhances abiotic stress tolerancein rice)，自由基清除的酶(Enhanced chilling tolerance at the booting stage inrice by transgenic overexpression of the ascorbate peroxidase gene，OsAPXa)，月旨肪酸合成途徑的基因(A rice microsomal delta~12fatty acid desaturase canenhanceresistance to cold stress in yeast and Oryza sativa)等等。因此，通過轉(zhuǎn)基因的技術(shù)能夠快速的改良水稻的耐冷性。但是很多這些通過反向遺傳學得到的耐冷功能基因，由于很多是信號途徑上游的基因，因此轉(zhuǎn)這些基因的轉(zhuǎn)基因水稻很多都表現(xiàn)出不正常的生長表型或不好的農(nóng)藝性狀，因此不能應(yīng)用于實際生產(chǎn)中。
[0005]油菜素類固醇(BR)是一種多功能的植物激素，在植物生長、發(fā)育以及脅迫響應(yīng)中起重要作用。外源使用BR能夠提高水稻對多種非生物脅迫的抗性，包括冷脅迫，干旱脅迫，鹽脅迫等(Brassinosteroid signaling network:1mplications on yield and stresstolerance)。雖然目前包括擬南芥和水稻等植物的BR合成及信號傳導途徑已經(jīng)比較清楚，但是對BR在植物脅迫響應(yīng)中起作用的分子機理了解得還非常少。

【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0006]本發(fā)明的第一個目的是提供一種水稻苗期耐冷性基因0s09g0410300。
[0007]本發(fā)明的水稻苗期耐冷性基因0s09g0410300，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID N0.1 所示。
[0008]本發(fā)明的第二個目的是提供一種水稻苗期耐冷性蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0009]所述的編碼水稻苗期耐冷性蛋白的基因的核苷酸序列優(yōu)選如SEQ ID N0.1所示。
[0010]本發(fā)明通過試驗證明，將本發(fā)明的基因0s09g0410300轉(zhuǎn)入水稻中，獲得的轉(zhuǎn)基因株系相比于野生型植株，其耐冷性明顯提高，由此說明，本發(fā)明的基因0s09g0410300是水稻苗期耐冷性功能基因。
[0011]因此，本發(fā)明的第三個目的是提供基因0s09g0410300在提高水稻苗期耐冷性中的應(yīng)用。
[0012]本發(fā)明相比于現(xiàn)有技 術(shù)，其有益效果如下:
[0013]1.本發(fā)明首次證明了水稻基因0s09g0410300是水稻苗期耐冷功能基因。前人報道該基因是BR信號途徑中的基因。該基因的克隆和生物學功能驗證對于水稻苗期耐冷的分子機制研究，以及BR信號途徑在水稻耐冷中發(fā)揮的作用的研究有重要的參考意義。
[0014]2.本發(fā)明提供了利用Camv35S啟動子過表達基因0s09g0410300的水稻轉(zhuǎn)化載體。該載體轉(zhuǎn)化水稻后能大幅提高基因0s09g0410300的表達量，伴隨著表達量的提高，轉(zhuǎn)化植株的苗期耐冷性有明顯的提高，并且轉(zhuǎn)基因植株在生長狀態(tài)及農(nóng)藝性狀上沒有明顯的改變。因此，本發(fā)明通過Camv35S啟動子過表達基因0s09g0410300的技術(shù)可以應(yīng)用于水稻的基因遺傳工程育種，并能夠應(yīng)用于生產(chǎn)實踐中，改良水稻的苗期耐冷性，從而保障目前極端氣候現(xiàn)象頻發(fā)的氣候條件下的水稻生產(chǎn)安全。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0015]圖1是pHQSN載體的載體圖；
[0016]圖2是基因0s09g0410300的表達水平圖，其中CK為野生型植株，Tl、T2和T3為
轉(zhuǎn)基因純合株系；
[0017]圖3是幼苗存活率圖，其中CK為野生型植株，Tl、T2和T3為轉(zhuǎn)基因純合株系?！揪唧w實施方式】:
[0018]以下實施例是對本發(fā)明進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0019]實施例1:[0020]1.基因0s09g0410300的克隆，過表達載體構(gòu)建
[0021]取水稻品種日本晴的幼苗葉片部位，用TriZol Reagent (Invitrogen公司，其貨號為:15596026)提取葉片總RNA，采用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測總RNA的純度及量，取I P g的總RNA做起始逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，所采用的逆轉(zhuǎn)錄酶為PrimeScript (TAKARA公司)，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的步驟參考該逆轉(zhuǎn)錄酶的使用說明。以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，采用引物(引物F:5’ aaaagtcgacATGTCAGTGGATGCACCTATGA，R:5’ aaaagaattcTTATCTTTGCAGAGGCTTGAC):進行PCR擴增，PCR所用的聚合酶為KOD FX (Toyobo公司)。反應(yīng)體系為50uL，按照KOD FX的說明書配制PCR反應(yīng)體系。反應(yīng)條件為:94°C 5min ；94°C 30sec，60°C 30sec，68°C 90sec,35個循環(huán)；68°C IOmin0 PCR擴增獲得約675bp的片段。
[0022]采用瓊脂糖凝膠電泳回收該片段后，用Sal I和Ecor I對片段和pHQSN載體(載體圖如圖1所示)(載體PHQSN是由表達載體pCAMBIA1390改造而來的，該載體由華南師范大學李洪清教授改造而來，載體PHQSN的文章詳細出處:Improvement ofTorenia fournieri salinity tolerance by expression ofArabidopsis AtNHX5.Le-YiShi，Hong-Qing Li,Xiao-Ping Pan,Guo-Jiang Wu and Me1-RuL1.Functional PlantBiology, 2008-CSIR0.，公眾可以參考該文獻構(gòu)建載體pHQSN，其載體圖如圖1所示。載體pHQSN的信息還可以參考專利《ATPase蛋白在植物耐逆性中的應(yīng)用》，CN102952816A)分別進行雙酶切，酶切后分別回收目標片段和載體片段，用T4連接酶(NEB公司)16°C連接16小時，連接體系為:T4連接酶luL，10XbufferluL，回收的PCR片段6ul (200ng)，pHQSN載體2uL(50ng)。取IuL連接產(chǎn)物，用電擊法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a中，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布卡那霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基。37°C培養(yǎng)過夜，挑10個單克隆進行提取質(zhì)粒，酶切鑒定。選擇兩個陽性克隆進行測序檢測。測序結(jié)果表明，所插入的PCR產(chǎn)物的序列如SEQ ID N0.1所示，其含有675bp的堿基，該序列命名為基因0s09g0410300。其編碼蛋白具有224個氨基酸殘基，其序列如SEQ ID N0 .2所示。由此得到含有基因0s09g0410300的pHQSN載體。
[0023]2.米用農(nóng)桿菌EHA105介導的遺傳轉(zhuǎn)化方法將過表達載體-含有基因0s09g0410300的pHQSN載體轉(zhuǎn)入正常粳稻品種中花-11中。轉(zhuǎn)化原代(TO代)通過PCR及定量PCR檢測，從DNA水平和RNA水平鑒定陽性轉(zhuǎn)化植株。陽性植株自交得到轉(zhuǎn)基因I代(Tl代)株系，每個株系選擇10株經(jīng)PCR檢測為陽性的植株繁種，得到T2代植株，T2代株系再進行PCR檢測，找到來源于不同TO代植株的T2代純合株系3個。
[0024]對3個轉(zhuǎn)基因純合株系的幼苗葉片進行熒光定量PCR，檢測目標基因0s09g0410300的表達量，以野生型結(jié)果為對照。
[0025]熒光定量PCR鑒定基因0s09g0410300在轉(zhuǎn)基因植株中過表達效果程序如下:
[0026]取PCR檢測陽性的轉(zhuǎn)基因植株三葉期幼苗葉片進行總RNA提取，采用的試劑為TriZol R eagent (Invitrogen公司，其貨號為:15596026),根據(jù)該試劑的說明書的步驟進行，并用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測總RNA的純度及量，取I μ g的總RNA做起始逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，所采用的逆轉(zhuǎn)錄酶為PrimeScript (Takara公司)，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的步驟參考該逆轉(zhuǎn)錄酶的使用說明。以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，利用定量PCR技術(shù)，采用引物064203F和064203R (064203F:5’ CTAGAAGTAGTCTCCACAAGCT,064203R:5’ ATCTACTGGCGTACCCACA)對檢測基因0s09g0410300的表達情況，采用水稻持家基因EFla基因的EFlaF和EFlaR引物(EFla F5’ TTTCACTCTTGGTGTGAAGCAGAT ；EFla R5’ GACTTCCTTCACGATTTCATCGTAA)對檢測水稻EFla基因的表達作為內(nèi)參，定量PCR試劑為SYBRk Premix Ex Ta a TM (TAKARA.)，定量PCR儀器為CFX96 (BioRAD公司)表達水平如圖2所示。
[0027]結(jié)果證明3個轉(zhuǎn)基因純合株系相對于野生型，基因0s09g0410300的表達量都大幅度提高30-100倍。
[0028]3.基因0s09g0410300過表達轉(zhuǎn)基因純合株系植株苗期耐冷性鑒定
[0029]把上述純合的3個過表達轉(zhuǎn)基因T2代株系(轉(zhuǎn)基因0s09g0410300純合株系)和野生型種子在中37°C萌發(fā)，7天后將幼苗分別移至裝有泥土的塑料盤中播種，每個株系及野生型分別播種30粒，一個塑料盤包含3個轉(zhuǎn)基因株系和野生型株系，3個生物學重復(fù)。生長條件為:12小時光照，12小時黑暗，光照強度為15000LUX，光照時溫度28°C，黑暗時溫度24°C，濕度70%。種子在塑料盤中生長到3葉期，轉(zhuǎn)移到人工氣候箱(Conviixm)中進行耐冷鑒定。耐冷鑒定條件為12小時光照，12小時黑暗，光照強度為15000LUX，光照時溫度5°C，黑暗時溫度5°C，濕度70%。冷處理6天后取出，轉(zhuǎn)移到正常生長條件下恢復(fù)生長，生長條件為:12小時光照，12小時黑暗，光照強度為15000LUX，光照時溫度28°C，黑暗時溫度24°C，濕度70%。幼苗在正常生長條件下生長7天后以存活幼苗數(shù)量除以總幼苗數(shù)量計算幼苗存活率。結(jié)果如圖3所示:
[0030]由圖3可以看出，野生型幼苗冷處理后全部死亡，3個轉(zhuǎn)基因株系幼苗有30-50%存活率，證明基因0s09g0410300過表達的轉(zhuǎn)基因植株苗期耐冷性明顯高于野生型。由此說明基因0s09g0410300能 提高水稻苗期耐冷性。
【權(quán)利要求】
1.一種水稻苗期耐冷性基因0s09g0410300，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.一種水稻苗期耐冷性蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的水稻苗期耐冷性蛋白，其特征在于，所述的編碼水稻苗期耐冷性蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
4.權(quán)利要求1所述的水稻苗期耐冷性基因0s09g0410300在提高水稻苗期耐冷性中的應(yīng)用。`
【文檔編號】C12N15/29GK103820468SQ201410070190
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年2月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月27日
【發(fā)明者】趙均良, 劉斌, 張少紅, 楊梯豐 申請人:廣東省農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所