水稻抗褐飛虱基因及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種水稻抗褐飛虱基因及其應(yīng)用。本發(fā)明通過對褐飛虱具有穩(wěn)定抗性的水稻品種BG1222和感蟲水稻品種TN1的研究找到一種水稻抗褐飛虱基因，記名為BGIOSGA015836，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。抗蟲品種與感蟲品種相比，BGIOSGA015836的基因表達量存在顯著差異：無論是否受到褐飛虱吸食，BG1222中的BGIOSGA015836的表達量都遠高于TN1的表達量。雜交F2后代驗證結(jié)果表明BGIOSGA015836的表達量與水稻抗蟲性成正相關(guān)，其表達量越高抗蟲性越強。
【專利說明】
水稻抗褐飛風(fēng)基因及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種水稻抗褐飛虱基因 BGI0SGA015836,同時還涉及該基因在水稻及水稻種子抗褐飛虱中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著人類進入后基因組時代，全面開展功能基因組研究已成為生命科學(xué)研究的前 沿領(lǐng)域。由于水稻的轉(zhuǎn)基因技術(shù)相對容易，并且與其它禾本科作物基因組具有共線性，因而 被視做模式植物。目前，水稻基因組精細遺傳圖和物理圖譜已完成，進一步對水稻功能基因 進行研究，對社會經(jīng)濟發(fā)展和生物學(xué)研究具有重大意義。
[0003] 目前世界上有超過一半的人以水稻為主食。糧食安全問題，是全世界人民面臨的 挑戰(zhàn)。20世紀(jì)50、60年代的矮化育種和70年代的雜交水稻培育兩次科技革命使水稻產(chǎn)量大 幅度提高。但近幾十年來水稻受到大面積的病蟲危害，使水稻生產(chǎn)受到威脅。褐飛虱是我國 水稻生產(chǎn)中的主要害蟲，其成蟲和若蟲以口針刺吸水稻汁液，引起黃葉或枯死，導(dǎo)致減產(chǎn)或 絕收。據(jù)中國農(nóng)業(yè)年鑒記載，褐飛虱蟲害在1966、1969、1973、1977、1983和2003年全國性 大發(fā)生，1987、1991、2005、2006和2007年全國性特大發(fā)生，危害面積達到水稻總面積的 50%以上，給我國水稻生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的損失。且褐飛虱的危害多發(fā)生在水稻成熟灌漿期， 此時大量使用殺蟲劑，對稻谷的污染也是非常嚴(yán)重的問題。
[0004] 利用抗褐飛虱基因培育抗蟲水稻品種是褐飛虱綜合防治中最為經(jīng)濟有效的方法。 國際水稻研究所（IRRI)的研究結(jié)果和東南亞的水稻生產(chǎn)實踐證明，即使是只有中等抗性 水平的水稻品種，也足以將褐飛虱的群體控制在造成危害的水平以下，不至于對水稻造成 實際的危害和產(chǎn)量損失。因此，挖掘水稻抗褐飛虱基因并在水稻育種項目中應(yīng)用是防治水 稻褐飛虱的根本措施。
[0005] 自20世紀(jì)60年代始，褐飛虱的抗性遺傳和育種研究就已經(jīng)開始進行，但是隨著新 生物型(或新致害型）的產(chǎn)生，抗蟲品種面臨著使用壽命縮短，抗性喪失的風(fēng)險。例如國際水 稻研究所于1973年推出具有Bphl基因的品種IR26,經(jīng)過2-3年后即出現(xiàn)能致害的生物型2; 1977-1978年推出具Bph2抗性基因的品種IR36和IR42,結(jié)果1982年相繼在一些國家出現(xiàn)了 褐飛虱新的生物型，不得不在1983年又培育出相應(yīng)的新抗性品種IR56和IR64。在2006年Seo 對韓國幾種攜帶不同抗飛虱基因的水稻品種進行測試，其中Cheongcheongbyeo(含Bphl基 因），ASD7與M63(含Bph2基因）的水稻的抗蟲性都有所下降，但是Gayabyeo(同時含有Bphl與 Bph2基因）的水稻還是具有很好的抗蟲性（Seo et al.，2009)。？仏33(同時含有Bph2與 Bph3基因）的致害水平較低，受害等級為2.5,品種表現(xiàn)抗蟲(張揚等，2011)。
[0006] 因此，繼續(xù)深入篩選與研究抗源材料、尋找新的抗性基因，并對其相關(guān)基因進行定 位與克隆，研發(fā)新的具有高抗性基因材料的水稻品種，具有非常重大的意義。
[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種水稻抗褐飛虱基因BGI0SGA015836及其應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： 水稻抗褐飛虱基因BGI0SGA015836編碼蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。
[0009] 水稻抗褐飛虱基因 BGI0SGA015836的cDNA序列。
[0010] 優(yōu)選的，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:3所示。
[0011] 水稻抗褐飛虱基因 BGI0SGA015836,其核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示，或該序 列經(jīng)替換、缺失或增加一個或多個核苷酸，且編碼相同氨基酸序列的核苷酸序列。
[0012] 其中抗蟲品種BG1222中的BGI0SGA015836基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:4所 示(包括外顯子和內(nèi)含子），感蟲品種TN1中的BGI0SGA015836基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示(包括外顯子和內(nèi)含子）。兩者編碼相同的氨基酸序列。
[0013] 所述基因BGI0SGA015836在水稻育種中的應(yīng)用。
[0014] 所述基因BGI0SGA015836在提高水稻抗褐飛虱抗性中的應(yīng)用。
[0015] -種提高水稻抗褐飛虱性能的方法，是通過分子育種方法或基因工程的方法，提 高BGI0SGA015836基因的表達量從而提高水稻抗褐飛虱性狀。
[0016] 本發(fā)明的有益效果是： 本發(fā)明通過對褐飛虱具有穩(wěn)定抗性的水稻品種BG1222和感蟲水稻品種TN1的研究找到 一種水稻抗褐飛虱基因，記名為BGI0SGA015836。抗蟲品種與感蟲品種相比BGI0SGA015836 的基因表達量存在顯著差異。
[0017] 在抗蟲品種BG1222中BGI0SGA015836的表達量比感蟲水稻品種TN1的表達量高十 倍以上。無論是否受到褐飛虱吸食，BG1222中的BGI0SGA015836的表達量都遠高于TN1的表 達量。
[0018] 雜交F2后代驗證表明BGI0SGA015836的表達量與水稻抗蟲性成正相關(guān)(表達量越 高抗蟲性越強）。后代中抗蟲性越強，其抗性分數(shù)值(Grade)越小，相對應(yīng)BGI0SGA015836的 表達量越高。
【附圖說明】
[0019] 圖1為受到褐飛虱吸食后的水稻品種BG1222和TN1的BGI0SGA015836表達量時間序 列變化； 圖2為雜交F2后代中BGI0SGA015836的表達量與水稻抗蟲性分數(shù)值的關(guān)系。
【具體實施方式】
[0020] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。
[0021] 褐飛虱是危害水稻生產(chǎn)的主要害蟲，近年來由于褐飛虱生物型發(fā)生變異及產(chǎn)生抗 藥性等原因，褐飛虱災(zāi)害發(fā)生日趨嚴(yán)重。生產(chǎn)實踐證明，利用抗性品種是最經(jīng)濟、安全而有 效的措施。按照"標(biāo)準(zhǔn)苗盤鑒定法"對BG1222進行了多年的苗期抗蟲級別檢測，發(fā)現(xiàn)其對褐 飛虱具有穩(wěn)定高抗性，且BG1222對白葉枯病也具有較高的抗性，因此在育種上具有較高的 利用價值。但是BG1222對褐飛虱有哪些關(guān)鍵的基因與抗蟲性表現(xiàn)相關(guān)聯(lián)，國內(nèi)外至今未見 文獻涉及。
[0022] TN1是國際公認不含任何抗蟲基因的感蟲水稻品種。
[0023] 本發(fā)明通過對褐飛虱具有穩(wěn)定抗性的水稻品種BG1222和感蟲水稻品種TN1的研究 找到水稻抗褐飛虱基因BGI0SGA015836。抗蟲品種與感蟲品種相比，BGI0SGA015836的基因 表達量存在顯著差異。在抗蟲品種BG1222中，BGI0SGA015836的表達量比感蟲水稻品種TN1 的表達量高十倍以上。無論是否受到褐飛虱吸食，BG1222中的BGI0SGA015836的表達量都遠 高于TN1的表達量。
[0024] 通過具有穩(wěn)定高抗性的水稻品種BG1222與感蟲品種TN1以及雜交?2后代的研究實 驗表明，BGI0SGA015836的表達量與水稻抗蟲性成正相關(guān)(表達量越高抗蟲性越強）后代 中抗蟲性越強，其抗性分數(shù)值(Grade)越小，相對應(yīng)BGI0SGA015836的表達量越高。
[0025] 實施例1抗蟲品種與感蟲品種相比BGI0SGA015836的基因表達量存在顯著差異 一.水稻基因RNA提取 1) 樣本分為組織以及細胞:細胞直接收集;液氮研磨組織樣本，加入500yl含4%P-巰基 乙醇的CTAB提取液，65度水浴30min; 2) 然后加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1)，混勻后10,000g離心10min; 3) 加入等體積的異丙醇，-20度放置lh，12,000g離心10min，棄上清； 4) 加入lOOOul Trizol重懸沉淀，然后加入200yl氯仿，用手劇烈振蕩15秒，室溫靜置 5min； 5) 4°C下，10，000g離心3min，溶液分為三層，RNA溶解在水相中，轉(zhuǎn)移水相至另一個新 的RNase free EP管； 6) 加入0.5倍體積異丙醇，渦旋充分混勻； 7) 4°C下，12，000g離心10min，離心后管底出現(xiàn)RNA沉淀，去上清； 8) 加入lml 75%乙醇，用手輕輕顛倒，12,000g離心5min，去上清； 9) 室溫晾干或真空干燥，加入60yl DEPC水溶解沉淀。
[0026] 二.去基因組 使用RNase-free的DNase I，按以下體系配置反應(yīng)液：
37 °C 消化 30min，65 °C 滅活 10min。
[0027]然后按以下步驟操作： 1) 加入等體積的苯酚，上下顛倒混勻后10，〇〇〇rpm，離心5min，取上清； 2) 加入等體積的氯仿，上下顛倒混勾后10,000rpm，離心10min，取上清； 3 )加入等體積異丙醇，輕柔地充分混勻，-20 °C靜置15min; 4) 4°C下，10,000g離心10min，收集RNA沉淀，去上清； 5) 用75%乙醇洗滌兩次，超凈臺風(fēng)干； 6) 加入10yl DEPC水溶解沉淀。
[0028]三.純度檢測及電泳檢測 純度檢測:取2yl RNA樣品60倍稀釋，在微量分光光度計k2800(北京凱奧)上測定0D值， OD260/OD280的比值大于1 ? 8，說明制備的RNA較純，無蛋白質(zhì)污染。
[0029] 四.逆轉(zhuǎn)錄 1)在PCR管中加入模板RNA、引物混合物，總量12yl。反應(yīng)體系如下：
70°C保溫lOmin后迅速在冰上冷卻2min。
[0030] 2)在該PCR管中加入下列試劑
將上述20yl反應(yīng)溶液42°C保溫60min;72°C保溫15mn;-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0031] 五?定量 利用下列引物對進行BGIOSGAO15836的基因表達量的分析，其堿基序列如下所示： RE-f：CCAACAGCTCTGCGCTCATC(SEQ ID N0：6), RE-r：ACTCCAGCCAAAAGAAACCCA(SEQ ID N0：7)〇 [0032] 1)反應(yīng)體系：cDNA稀釋3倍
[0033] 2)反應(yīng)條件：使用ViiA7 software 95 °C 30S； 95°C 3S，60°C 34S(收集熒光信號）；45個循環(huán)。
[0034]融解曲線分析:溫度60°C_95°C，每分鐘讀1次。
[0035] 結(jié)果見圖1。
[0036]圖1中橫坐標(biāo)為水稻受到褐飛虱吸食的小時數(shù)，縱坐標(biāo)為BGI0SGA015836的相對表 達量：以在〇小時(h)，TNl中基因BGI0SGA015836的表達量標(biāo)準(zhǔn)化為數(shù)值1，其它時間與材料 的基因表達量都是基于此，由于表達量的差異值有幾十倍之多，所以將表達量數(shù)值取以10 為底的對數(shù)最終得到相對表達量。
[0037]從圖1可以看出受到褐飛虱吸食的情況下，植株受到外來刺激，BGI0SGA015836的 表達量會提高，說明該基因在BG1222和TN1中既具有組成型(沒有受到外界刺激也有表達差 異）表達差異，也具有誘導(dǎo)型（受到外界刺激引起表達差異）表達差異。在不同時間點， BGI0SGA015836基因在BG1222的表達量都會顯著高于TN1的表達量。
[0038] 圖1結(jié)果表明在抗蟲品種BG1222中BGI0SGA015836的表達量比感蟲水稻品種TN1的 表達量高十倍以上。無論是否受到褐飛虱吸食，BG1222中的BGI0SGA015836的表達量都遠高 于TN1的表達量。
[0039] 實施例2 BGI0SGA015836的基因的克隆，以及多肽分析 分別對抗蟲品種BG1222以及感蟲品種TN1的BGI0SGA015836基因進行克隆，進行分析。 [0040] 其中抗蟲品種BG1222中的BGI0SGA015836基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:4所 示(包括外顯子和內(nèi)含子），感蟲品種TN1中的BGI0SGA015836基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所不(包括外顯子和內(nèi)含子）。
[0041 ] 其中抗蟲品種BG1222中BGI0SGA015836基因的cDNA序列如SEQ ID N0:2所示；而 感蟲品種TN1中BGI0SGA015836基因的cDNA序列如SEQ ID N0:3所示。上述cDNA有5處堿基 有所不同，但是編碼得到的水稻抗褐飛虱的多肽序列是相同的，其氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。
[0042] 實施例3抗蟲品種與感蟲品種進行雜交F2代 通過BG1222與TN1的雜交建立?2后代群體，其中？2后代群體的樣本n=512。從中選取了 60個不同抗性分數(shù)值的個體檢測，并對不同抗性級別表型的F2后代個體分別檢測其 BGI0SGA015836的表達量，以確定BGI0SGA015836的表達量與水稻抗蟲表型的相關(guān)性。
[0043] 結(jié)果見圖2。
[0044] 圖2結(jié)果表明：雜交F2后代驗證表明BGI0SGA015836的表達量與水稻抗蟲性成正相 關(guān)（表達量越高抗蟲性越強）。后代中抗蟲性越強，其抗性分數(shù)值越小，相對應(yīng) 8610364015836的表達量越高?？剐苑謹?shù)值(6瓜(16)分為0，1，3,5,7,9;分數(shù)值越小代表其抗 蟲性越強。
[0045]上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 水稻抗褐飛虱基因 BGI0SGA015836編碼蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示。2. 水稻抗褐飛虱基因 BGI0SGA015836的cDNA序列。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的cDNA序列，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID N0:2或 SEQ ID NO:3 所示。4. 水稻抗褐飛虱基因 BGI0SGA015836,其核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示，或該序列 經(jīng)替換、缺失或增加一個或多個核苷酸，且編碼相同氨基酸序列的核苷酸序列。5. 權(quán)利要求4所述基因 BGI0SGA015836在水稻育種中的應(yīng)用。6. 權(quán)利要求4所述基因 BGI0SGA015836在提高水稻抗褐飛虱抗性中的應(yīng)用。7. -種提高水稻抗褐飛虱性能的方法，其特征在于:通過分子育種方法或基因工程的 方法，提高BGI0SGA015836基因的表達量從而提高水稻抗褐飛虱性狀。
【文檔編號】C12N15/82GK105820222SQ201610289474
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年5月3日
【發(fā)明人】李怡峰, 肖漢祥, 張振飛, 李燕芳, 張揚
【申請人】廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所