一種大腸桿菌分泌表達(dá)外源蛋白的質(zhì)粒載體及其構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種大腸桿菌分泌表達(dá)外源蛋白的質(zhì)粒載體及其構(gòu)建方法。具體地，本發(fā)明公開了一種重組分泌型表達(dá)載體，該載體含有堿性磷酸酶PhoA分泌信號(hào)肽及多聚組氨酸序列，能夠在大腸桿菌BL21中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)外源重組蛋白。本發(fā)明還公開了上述表達(dá)載體的構(gòu)建、PhoA引導(dǎo)肽-外源蛋白融合基因克隆及融合蛋白表達(dá)與檢測(cè)技術(shù)。該載體能使外源蛋白在胞外穩(wěn)定表達(dá)，從而可應(yīng)用于常規(guī)蛋白的分泌表達(dá)。
【專利說明】一種大腸桿菌分泌表達(dá)外源蛋白的質(zhì)粒載體及其構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及用于蛋白的表達(dá)與純化【技術(shù)領(lǐng)域】，具體是涉及分泌表達(dá)外源蛋白的質(zhì)粒載體及其構(gòu)建方法。
技術(shù)背景
[0002]蛋白的表達(dá)純化技術(shù)在酶與活性蛋白的低成本提取、蛋白功能研究、蛋白結(jié)構(gòu)分析等多個(gè)領(lǐng)域有著較為重要的應(yīng)用。對(duì)所純化的蛋白最基本的要求是蛋白能較好的分散于相應(yīng)溶液并具備良好的生物活性。目前常規(guī)的表達(dá)載體多數(shù)基于大腸桿菌胞內(nèi)表達(dá)技術(shù)，其優(yōu)點(diǎn)是大腸桿菌易于培養(yǎng)和破碎，有利于蛋白的純化。不足是所表達(dá)外源蛋白局限于細(xì)胞內(nèi)部，由于空間所限可溶部分的蛋白產(chǎn)量有限，且有很多蛋白因此在胞內(nèi)形成聚集或包涵體，需要做進(jìn)一步的變、復(fù)性處理。而聚集或包涵體形式的蛋白往往由于各種分子修飾作用，難以重新分散于合適的體系。在尋找復(fù)性條件時(shí)需要更多的條件摸索過程因而形成成本消耗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]發(fā)明人通過克隆技術(shù)引入堿性磷酸酶PhoA的信號(hào)肽序列構(gòu)建了能夠分泌至大腸桿菌細(xì)胞外的外源蛋白表達(dá)載體，該載體具備Lac誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)、PhoA信號(hào)肽、多克隆位點(diǎn)、多聚組氨酸標(biāo)簽以及T7終止子，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了外源蛋白的誘導(dǎo)分泌表達(dá)能力。因此，本發(fā)明為胞外活性外源蛋白的提取提供了一種新的表達(dá)載體。
[0004]因此，本發(fā)明提供了一種以PhoA信號(hào)肽引導(dǎo)蛋白分泌表達(dá)的大腸桿菌克隆表達(dá)質(zhì)粒載體，所述質(zhì)粒載體含有Lac操縱子-堿性磷酸酶PhoA引導(dǎo)肽-TEV (煙草蝕蚊病毒蛋白酶)識(shí)別位點(diǎn)-多克隆位點(diǎn)-多聚組氨酸肽基因序列。
[0005]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多克隆位點(diǎn)是源于pET22b質(zhì)粒、位于TEV酶識(shí)別序列下游的NcoI至XhoI等系列限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列。
[0006]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多聚組氨酸肽的長度是6個(gè)氨基酸。優(yōu)選地，多聚組氨酸肽基因序列后有T7終止子序列。優(yōu)選地，所述質(zhì)粒載體以質(zhì)粒pET22b(例如其序列為 SEQ ID N0.3)構(gòu)建。
[0007]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述質(zhì)粒載體的序列是SEQ ID N0.6。
[0008]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明的表達(dá)質(zhì)粒載體的宿主菌,例如大腸桿菌BL21。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述質(zhì)粒載體的序列是SEQ ID N0.6。
[0009]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了一種構(gòu)建分泌型融合蛋白的表達(dá)質(zhì)粒載體的方法，所述方法通過PCR擴(kuò)增技術(shù)、限制性內(nèi)切酶切割和T4連接酶連接，在本發(fā)明的表達(dá)質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)上插入待表達(dá)的外源蛋白肽段基因序列。
[0010]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種誘導(dǎo)分泌型外源蛋白表達(dá)的方法，其中本發(fā)明的方法構(gòu)建的分泌型外源蛋白的表達(dá)質(zhì)粒載體在宿主菌受到IPTG (異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)后表達(dá)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述外源蛋白是表面免疫相關(guān)蛋白Sip蛋白。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，含所述表面免疫相關(guān)蛋白Sip蛋白的表達(dá)質(zhì)粒載體具有SEQID N0.9的序列。
[0011]在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，一種檢測(cè)分泌型外源蛋白方法，其中本發(fā)明的表達(dá)質(zhì)粒載體表達(dá)的外源蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳方法檢測(cè)到。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述外源蛋白是表面免疫相關(guān)蛋白Sip蛋白。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，含所述表面免疫相關(guān)蛋白Sip蛋白的表達(dá)質(zhì)粒載體具有SEQ ID N0.9的序列。
[0012]在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，用本發(fā)明的表達(dá)質(zhì)粒載體表達(dá)的外源蛋白能有效分泌至胞外，提高可溶外源蛋白的產(chǎn)量和得率。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述外源蛋白是表面免疫相關(guān)蛋白Sip蛋白。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，含所述表面免疫相關(guān)蛋白Sip蛋白的表達(dá)質(zhì)粒載體具有SEQ ID N0.9的序列。[0013]本發(fā)明針對(duì)目前大腸桿菌中表達(dá)的外源蛋白多為胞內(nèi)蛋白，從而部分蛋白易于形成包涵體、不利于純化的問題，設(shè)計(jì)和構(gòu)建了在大腸桿菌胞外表達(dá)外源蛋白的質(zhì)粒載體。該載體在商業(yè)質(zhì)粒pET22b的基礎(chǔ)上引入堿性磷酸酶PhoA的信號(hào)肽，在其下游設(shè)計(jì)多克隆位點(diǎn)，TEV酶識(shí)別切割序列和用于蛋白純化的多聚組氨酸肽段，實(shí)現(xiàn)外源蛋白基因的插入、外源蛋白的分泌表達(dá)和活性蛋白的提取。由于采用Lac誘導(dǎo)系統(tǒng)，在IPTG誘導(dǎo)的條件下即可啟動(dòng)外源蛋白的聞效表達(dá)。該質(zhì)粒表達(dá)體系為外源蛋白的表達(dá)和純化提供新的材料。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0014]圖1為PhoA-Sip融合蛋白表達(dá)的SDS-PAGE凝膠電泳圖。樣品順序?yàn)?M:分子量標(biāo)記(單位:kDa)。1-3:誘導(dǎo)前的菌液上清(I)、菌體破碎沉淀(2)、菌體破碎上清(3) ;4_6:誘導(dǎo)后的菌液上清(4)、菌體破碎沉淀(5)、菌體破碎上清(6) ;7、8為不含質(zhì)粒的BL21全菌(兩個(gè)重復(fù))。
[0015]圖2:商業(yè)大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET22b中用于外源蛋白基因克隆及表達(dá)的主要元件。
[0016]圖3:表達(dá)質(zhì)粒中用于外源蛋白基因克隆表達(dá)的元件示意圖。
[0017]圖4:測(cè)得序列與設(shè)計(jì)的質(zhì)粒pET22b_PhoA預(yù)測(cè)序列做blast比較的結(jié)果。
[0018]圖5:將測(cè)得序列與含PhoA-Sip序列的融合基因的預(yù)測(cè)序列做blast比較的結(jié)
果O
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面將結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】做進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例將有助于說明本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。
[0020]1.pET22b-PhoA 的構(gòu)建
[0021]設(shè)計(jì)上游引物pET22b_phoA-S:
[0022]GGAATTCCATATGAAACAAAGCACTATTGC(5’-3’)(SEQ ID N0.1 )，和下游引物 pET22b_phoA-AS:
[0023]CATGCCATGGCTCCCTGAAAATACAGGTTTTCGGCTTTTGTCACA GGG(5，-3，)(SEQ ID N0.2),以PhoA的基因模板擴(kuò)增PhoA信號(hào)肽基因序列，除了 PhoA信號(hào)肽的相應(yīng)匹配序列以外，上游引物帶有NdeI酶切位點(diǎn)(連接了相應(yīng)酶切保護(hù)堿基)，下游引物帶有NcoI酶切位點(diǎn)(連接了保護(hù)堿基)、以及TEV酶識(shí)別切割序列。擴(kuò)增PhoA基因序列按Primer Star HS DNA聚合酶(Takara)試劑盒說明書操作。用DNA瓊脂糖凝膠電泳方法檢測(cè)擴(kuò)增基因片段大小，按照膠回收試劑盒(OMEGA)說明書回收基因，溶解于溶解液或無菌水。
[0024]以NdeI和NcoI (Takara公司)分別對(duì)pET22b和所擴(kuò)增的PhoA信號(hào)肽基因酶切，條件參照廠商提供的說明書進(jìn)行。用DNA膠純化方法提純酶切后的片段，16°C下用T4連接酶對(duì)酶切后的載體和上述擴(kuò)增的PhoA信號(hào)肽基因序列片段過夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，具體方法參照《分子克隆》第三版的CaCl2熱激轉(zhuǎn)化法。以含有氨芐青霉素1001^/1^的1^平板(胰化蛋白胨1(^_1，酵母提取物58 ΙΛ NaCl IOg L—1，瓊脂粉20g L-1，下文LB培養(yǎng)基不含瓊脂)對(duì)菌落在37°C下進(jìn)行培養(yǎng)，16-24小時(shí)后以菌落PCR的方法對(duì)陽性菌落進(jìn)行篩選。方法如下:準(zhǔn)備200微升的PCR小管，加入5-10微升無菌水，以無菌槍頭挑取菌落，打散至無菌水中，加入DreamTaq MM試劑盒(Takara)提供的等體積2 X緩沖液和適量的DreamTaq MM聚合酶，在PCR儀中進(jìn)行菌落PCR (引物分別是:pET22b_phoA-S ；pET22b_phoA-AS),實(shí)驗(yàn)條件參照PCR酶試劑盒提供的說明書設(shè)置。
[0025]用DNA瓊脂糖凝膠電泳方法檢測(cè)擴(kuò)增的基因片段，將正確擴(kuò)增結(jié)果對(duì)應(yīng)的菌落經(jīng)行培養(yǎng)，送至測(cè)序公司測(cè)序，以確保質(zhì)粒的序列正確。抽提質(zhì)粒保存于_80°C。
[0026]大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET22b為商業(yè)購買，全長5493bp,環(huán)狀，序列如下(SEQ IDN0.3):
【權(quán)利要求】
1.一種以PhoA信號(hào)肽引導(dǎo)蛋白分泌表達(dá)的大腸桿菌克隆表達(dá)質(zhì)粒載體。
2.權(quán)利要求1的表達(dá)質(zhì)粒載體，所述質(zhì)粒載體包含Lac操縱子-PhoA引導(dǎo)肽-TEV識(shí)別位點(diǎn)-多克隆位點(diǎn)-多聚組氨酸肽基因序列。
3.權(quán)利要求1或2的表達(dá)質(zhì)粒載體，所述質(zhì)粒載體以質(zhì)粒pET22b構(gòu)建。
4.權(quán)利要求3的表達(dá)質(zhì)粒載體，所述質(zhì)粒pET22b的序列為SEQID N0.3。
5.權(quán)利要求4的表達(dá)質(zhì)粒載體，所述質(zhì)粒載體的序列是SEQID N0.6。
6.包含權(quán)利要求書1-5任一項(xiàng)所述的表達(dá)質(zhì)粒載體的宿主菌，例如大腸桿菌BL21。
7.—種分泌型外源蛋白的表達(dá)質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法，所述構(gòu)建方法通過PCR擴(kuò)增技術(shù)、限制性內(nèi)切酶切割和T4連接酶連接方法，在權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的表達(dá)質(zhì)粒載體的設(shè)計(jì)的多克隆位點(diǎn)上插入外源蛋白肽段基因序列。
8.一種分泌型外源蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)方法，其中將權(quán)利要求7的構(gòu)建方法構(gòu)建的外源蛋白在宿主菌受到IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)。
9.一種分泌型外源蛋白檢測(cè)方法，其中將權(quán)利要求8表達(dá)的外源蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳方法檢測(cè)。
10.權(quán)利要求7-9任一項(xiàng)的方法，所述外源蛋白是表面免疫相關(guān)蛋白Sip蛋白；優(yōu)選地，含所述表面免疫相關(guān) 蛋白Sip蛋白的表達(dá)質(zhì)粒載體具有SEQ ID N0.9的序列。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK103834676SQ201410070632
【公開日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2014年2月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月28日
【發(fā)明者】吳允昆, 張蕾, 孫麗芳, 趙艷和, 吳秀玲 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究所