專(zhuān)利名稱(chēng)：一種外源基因的示蹤體系及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及一種外源基因的示蹤體系及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在生物技術(shù)領(lǐng)域中，轉(zhuǎn)基因技術(shù)是最為常用且必不可少的手段。但在進(jìn)行外源基因的轉(zhuǎn)染后，如何觀察外源基因進(jìn)入細(xì)胞的效率，以及外源基因在細(xì)胞內(nèi)的存在或運(yùn)動(dòng)情況也是本領(lǐng)域需要關(guān)注的。通過(guò)PCR擴(kuò)增以及電泳鑒定盡管能夠鑒定外源基因是否轉(zhuǎn)入，但是其轉(zhuǎn)入后在細(xì)胞內(nèi)的存在情況卻沒(méi)有辦法得知，也即無(wú)法在活體的情況下根據(jù)需要?jiǎng)討B(tài)地觀察外源基因在不同階段在細(xì)胞中所處的位置和運(yùn)動(dòng)情況通過(guò)同位素、熒光素或染料來(lái)進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記也已經(jīng)被本領(lǐng)域人員使用。然而，目前用于進(jìn)行標(biāo)記的染料有許多種，有些染料對(duì)于細(xì)胞有一定的毒性。有些染料之間存在串色現(xiàn)象，在多于ー種染料同時(shí)應(yīng)用時(shí)常常分辨率不高，觀察效果并不理想。目前，對(duì)于非病毒基因輸送體系的研發(fā)是分子治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)。有效安全的基因輸送載體將突破基因治療的瓶頸給廣大患者帶來(lái)福音。在研究開(kāi)發(fā)新型的非病毒基因載體的過(guò)程當(dāng)中，確定非病毒基因載體及外源基因在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)動(dòng)及表達(dá)、尋找其中的限速歩驟借以改進(jìn)載體是ー個(gè)很重要的挑戰(zhàn)。在外源基因最終表達(dá)之前，幾個(gè)步驟最為關(guān)鍵①細(xì)胞內(nèi)吞外源DNA在胞質(zhì)內(nèi)的運(yùn)輸；(DDNA入核外源基因表達(dá)，這就需要利用標(biāo)記技術(shù)將外源基因進(jìn)行標(biāo)記，確定外源基因在細(xì)胞內(nèi)的分布、運(yùn)動(dòng)及表達(dá)。但目前尚無(wú)同時(shí)分別標(biāo)記外源基因、細(xì)胞膜、細(xì)胞核，利用共定位的方法研究外源DNA在細(xì)胞內(nèi)的分布、運(yùn)動(dòng)并不蹤外源基因表達(dá)的技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種外源基因的示蹤體系及其應(yīng)用。在本發(fā)明的第一方面，提供一種外源基因的細(xì)胞內(nèi)示蹤方法，所述方法包括(I)以Cy5熒光素標(biāo)記外源基因(或攜帯外源基因的質(zhì)粒載體)，將經(jīng)過(guò)標(biāo)記的外源基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)；(2)以染料Hochest標(biāo)記細(xì)胞的細(xì)胞核；(3)以染料 Alexa Fluor 594 麥胚凝集素(Alexa Fluor 594 wheatgermagglutinin)標(biāo)記細(xì)胞膜；和(4)以細(xì)胞中的灰色熒光標(biāo)記的細(xì)胞核以及紅色熒光標(biāo)記的細(xì)胞膜為參照，觀察藍(lán)色熒光標(biāo)記的外源基因在細(xì)胞內(nèi)的分布或運(yùn)動(dòng)情況。在另ー優(yōu)選例中，步驟⑵在步驟⑶之前；或步驟⑶在步驟⑵之前；或步驟
(2)和步驟(3)同時(shí)進(jìn)行。在另ー優(yōu)選例中，所述的外源基因存在于質(zhì)粒載體中。在另ー優(yōu)選例中，所述的以Cy5熒光素標(biāo)記外源基因的方法是
將Cy5 突光素(較佳地為 Label IT TrackerTM Reagent IntracellularNucleicAcid Localization Kit-Cy 5)與外源基因共孵育后，加入NaCl和無(wú)水こ醇，靜置、離心取沉淀，洗滌后收集沉淀，獲得Cy5熒光素標(biāo)記的外源基因。在另ー優(yōu)選例中，所述的以染料Hochest標(biāo)記細(xì)胞的細(xì)胞核的方法是在細(xì)胞中加入染料Hochest (較佳地為Hoechst 33342)標(biāo)記溶液(較佳地
2.0±0. 5 μ g/ml)，共孵育(較佳地孵育2-15分鐘，更佳地孵育8_10分鐘)，收集細(xì)胞并洗滌(較佳地用HBSS清洗)，獲得細(xì)胞核標(biāo)記染料Hochest的細(xì)胞。
在另ー優(yōu)選例中，所述的以染料Alexa Fluor 594麥胚凝集素標(biāo)記細(xì)胞膜的方法是在細(xì)胞中加入Alexa Fluor 594麥胚凝集素標(biāo)記溶液(較佳地4_13 μ g/ml ;更佳地5-11 μ g/ml ;更佳地5-10 μ g/ml),共孵育(較佳地孵育5_15分鐘,更佳地孵育8_10分鐘)，收集細(xì)胞并洗滌(較佳地用HBSS清洗)，獲得細(xì)胞膜標(biāo)記染料Alexa Fluor 594麥胚凝集素的細(xì)胞。在另ー優(yōu)選例中，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察或拍攝外源基因在細(xì)胞內(nèi)的分布、運(yùn)動(dòng)或表達(dá)情況。在另ー優(yōu)選例中，在標(biāo)記后0-4小時(shí)內(nèi)進(jìn)行觀察或拍攝；更優(yōu)選地，進(jìn)行活體實(shí)時(shí)跟足示拍攝。在另ー優(yōu)選例中，當(dāng)進(jìn)行拍照時(shí),采用Alexa Fluor 594麥胚凝集素標(biāo)記溶液的濃度是5±1 μ g/ml ;當(dāng)進(jìn)行攝像或?qū)崟r(shí)活體觀察時(shí),采用Alexa Fluor 594麥胚凝集素標(biāo)記溶液的濃度是lOiSyg/ml。在另一優(yōu)選例中，經(jīng)過(guò)標(biāo)記的細(xì)胞放在4 0C冰箱保存。在另ー優(yōu)選例中，熒光素Cy5的激發(fā)光波長(zhǎng)為649nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為670nm ；染料Hoechst的激發(fā)光波長(zhǎng)為350nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為461nm ;或染料Alexa Fluor 594麥胚凝集素的激發(fā)光波長(zhǎng)為591nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為618nm。在另ー優(yōu)選例中，所述的外源基因是綠色熒光蛋白的編碼基因；其表達(dá)后獲得的蛋白顯示綠色熒光。在另ー優(yōu)選例中，綠色熒光蛋白的激發(fā)光波長(zhǎng)為488nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為509nm。在另ー優(yōu)選例中，通過(guò)觀察細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光來(lái)分析蛋白的表達(dá)情況。在另ー優(yōu)選例中，將經(jīng)過(guò)標(biāo)記的外源基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)采用的轉(zhuǎn)染試劑選自但不限于PEI-25kDa、Lipo2000 或 PEI_-CyD。在本發(fā)明的另一方面，提供ー種試劑盒，所述試劑盒用于對(duì)外源基因進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)示蹤，其中含有Cy5熒光素、染料Hochest和染料Alexa Fluor 594麥胚凝集素。在另ー優(yōu)選例中，所述試劑盒中還含有選自以下的一種或多種試劑標(biāo)記緩沖液，滅菌水，氯化鈉，こ醇，洗滌劑或轉(zhuǎn)染試劑。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還含有使用說(shuō)明書(shū)。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。


圖I、PEI_25KDa同pEGFP復(fù)合物轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞系過(guò)程24小時(shí)動(dòng)態(tài)觀察。圖2、PEI-25kDa同pEGFP復(fù)合物轉(zhuǎn)染C5. 18細(xì)胞系過(guò)程24小時(shí)動(dòng)態(tài)觀察。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過(guò)深入的研究，優(yōu)化了ー種DNA細(xì)胞內(nèi)示蹤的方法，選擇到了多種顯色標(biāo)記來(lái)標(biāo)記DNA、細(xì)胞核以及細(xì)胞膜，從而利用共定位的方法研究外源基因在細(xì)胞內(nèi)的存在以及運(yùn)動(dòng)情況。如本文所用，所述的“外源基因”也稱(chēng)為“外源DNA”，其也廣義地包括攜帯有外源基因的構(gòu)建物、質(zhì)粒(載體)。如本文所用，所述的“非病毒基因載體”、“非病毒基因輸送體系”、“非病毒載體”可互換使用，是指將外源基因引導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的試劑(如轉(zhuǎn)染試劑，更具體地例如Lipo2000、PEI25-kD或PEI_-CyD)，且這種試劑并非病毒類(lèi)的。但是，它們不同于“質(zhì)?！?、“表達(dá)載體”或“質(zhì)粒載體”。本發(fā)明人已經(jīng)利用熒光素Cy5標(biāo)記質(zhì)粒，染料Hochest標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核，染料Alexa Fluor 594麥胚凝集素(wheat germ agglutinin)標(biāo)記細(xì)胞膜。通過(guò)本發(fā)明的方法構(gòu)建的染色標(biāo)記系統(tǒng)可在活體的情況下根據(jù)需要?jiǎng)討B(tài)地觀察外源基因在不同階段在細(xì)胞中所處的位置和運(yùn)動(dòng)情況。借助本發(fā)明的方法構(gòu)建的共轉(zhuǎn)系統(tǒng)還可以對(duì)外源基因在轉(zhuǎn)染過(guò)程中的限速步驟進(jìn)行較為全面的分析，并對(duì)改進(jìn)外源基因輸送體系提供可靠依據(jù)。本發(fā)明的標(biāo)記方法簡(jiǎn)單易行、穩(wěn)定可靠。因此，本發(fā)明提供了一種外源基因的細(xì)胞內(nèi)示蹤方法，所述方法包括(I)以Cy5熒光素標(biāo)記外源基因(或攜帯外源基因的質(zhì)粒載體)，將經(jīng)過(guò)標(biāo)記的外源基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)；⑵以染料Hochest標(biāo)記細(xì)胞的細(xì)胞核；(3)以染料Alexa Fluor594wheat germagglutitin標(biāo)記細(xì)胞膜；和(4)以細(xì)胞中的灰色熒光標(biāo)記的細(xì)胞核以及紅色熒光標(biāo)記的細(xì)胞膜為參照，觀察藍(lán)色熒光標(biāo)記的外源基因在細(xì)胞內(nèi)的分布或運(yùn)動(dòng)情況。其中，步驟(2)在步驟(3)之前；或步驟(3)在步驟(2)之前；或步驟(2)和步驟(3)同時(shí)進(jìn)行。本發(fā)明選用的試劑均可以在活體情況下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行顯微鏡下的觀察，對(duì)細(xì)胞沒(méi)有任何損傷。如果配合連續(xù)熒光顯微鏡照相系統(tǒng)，可以觀察整個(gè)DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞過(guò)程中，外源基因如何進(jìn)入細(xì)胞膜和細(xì)胞核的過(guò)程，這對(duì)研究分析外源基因在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)動(dòng)情況以及限速步驟等具有十分重要的意義。由于需要同時(shí)標(biāo)記三種不同的物質(zhì)外源基因，細(xì)胞膜和細(xì)胞核。這就需要選擇合適的、互不干擾的染料，以避免不同染料間發(fā)生“串色”現(xiàn)象而影響試驗(yàn)的可信度。本發(fā)明人經(jīng)過(guò)合理的選擇和反復(fù)地驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)三種染料Hochest, Alexa Fluor 594 wheat germagglutinin, Cy5之間并無(wú)“串色”現(xiàn)象。對(duì)于外源基因的標(biāo)記方法有很多種，本人以前曾經(jīng)嘗試過(guò)用量子點(diǎn)對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)該種方法比較繁瑣，而且需要后續(xù)的其它試驗(yàn)對(duì)標(biāo)記的情況進(jìn)行分析和確認(rèn)之后，方可用于示蹤分析。而本發(fā)明的方法對(duì)外源基因的標(biāo)記采用的方法較為簡(jiǎn)便，無(wú)需多余的分析確認(rèn)即可直接用于示蹤分析，而且經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的方法構(gòu)建的系統(tǒng)相對(duì)穩(wěn)定。對(duì)于細(xì)胞膜和細(xì)胞核的標(biāo)記方法，同樣也比較方便易行。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的以Cy5熒光素標(biāo)記外源基因的方法是將LabelIT Tracker Reagent Intracellular Nucleic Acid Localization Kit_Cy 5 與夕卜源基因共孵育后，加入NaCl和無(wú)水こ醇，靜置、離心取沉淀，洗滌后收集沉淀，獲得Cy5熒光素標(biāo)記的外源基因。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的以染料Hochest標(biāo)記細(xì)胞的細(xì)胞核的方法是在細(xì)胞中加入Hoechst 33342標(biāo)記溶液(較佳地2. O ±O. 5 μ g/ml)，共孵育(較佳地孵育2_15分鐘，更佳地孵育8-10分鐘)，收集細(xì)胞并洗滌，獲得細(xì)胞核標(biāo)記染料Hochest的細(xì)胞。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的以染料Alexa Fluor 5944麥胚凝集素標(biāo)記細(xì)胞的細(xì)胞膜的方法是在細(xì)胞中加入Alexa Fluor 5944麥胚凝集素標(biāo)記溶液，共孵育，收集細(xì)胞并洗滌，獲得細(xì)胞膜標(biāo)記染料Alexa Fluor 5944麥胚凝集素的細(xì)胞。本發(fā)明對(duì)不同操作條件下染料Alexa Fluor 5944麥胚凝集素的使用濃度進(jìn)行了優(yōu)化。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，當(dāng)進(jìn)行拍照時(shí)，采用Alexa Fluor 594麥胚凝集素標(biāo)記溶液的濃度是5± I μ g/ml ;當(dāng)進(jìn) 行攝像或?qū)崟r(shí)活體觀察時(shí)，由于需要長(zhǎng)時(shí)間的激發(fā)染料，避免染料淬滅，故而提高了用量，此時(shí)采用的濃度為10±3μ g/ml。以上條件下可以較大地增強(qiáng)染色效果，有效地提高觀察或拍攝的質(zhì)量?；诟鞣N細(xì)胞具有相同或類(lèi)似等結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞器，本發(fā)明對(duì)于涉及的細(xì)胞沒(méi)有特別的限制，包括但不限于原核細(xì)胞、真核細(xì)胞、高等生物細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述的細(xì)胞是真核細(xì)胞。將經(jīng)過(guò)標(biāo)記的外源基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞可以采用本領(lǐng)域人員已知的多種方法，當(dāng)細(xì)胞為原核生物如大腸桿菌時(shí)，可以采用CaCl2法或處MgCl2法理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知；如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體法等。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，將經(jīng)過(guò)標(biāo)記的外源基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)采用的轉(zhuǎn)染試劑是PEI600-CyD> PEI_25kDa 或 Lipof ectamine 2000Reagent。任何可觀察熒光標(biāo)記和/或染色標(biāo)記的儀器及方法都可應(yīng)用于本發(fā)明，以觀察外源基因在細(xì)胞內(nèi)的存在以及運(yùn)動(dòng)情況。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察外源基因在細(xì)胞內(nèi)的分布或運(yùn)動(dòng)情況。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的突光素Cy5的激發(fā)光波長(zhǎng)為649nm,發(fā)射光波長(zhǎng)為670nm ;染料Hoechst的激發(fā)光波長(zhǎng)為350nm,發(fā)射光波長(zhǎng)為461nm ;或染料Alexa Fluor594wheat germ agglutinin的激發(fā)光波長(zhǎng)為591nm,發(fā)射光波長(zhǎng)為618nm。本發(fā)明還提供了一種用于對(duì)外源基因進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)示蹤的試劑盒，所述試劑盒中含有Cy5 突光素、染料 Hochest 和染料 Alexa Fluor 594wheat germagglutinin。任何其它對(duì)于染色或轉(zhuǎn)染有用的試劑都可包含在所述的試劑盒中，其它對(duì)于質(zhì)粒的復(fù)制、細(xì)胞的培養(yǎng)有用的試劑或培養(yǎng)基也可包含在所述的試劑盒中。例如，所述的試劑盒中還含有選自以下的一種或多種試劑標(biāo)記緩沖液，滅菌水，氯化鈉，こ醇，洗滌劑或轉(zhuǎn)染試齊 。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的試劑盒中還含有使用說(shuō)明書(shū)。作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的方法可應(yīng)用于非病毒基因輸送體系中基因輸送情況的分析。所述的非病毒基因輸送體系例如是PEI25-kDa或PEI6tltl-CyD轉(zhuǎn)染的體系。本發(fā)明的方法利用不同的熒光素或染料分別標(biāo)記質(zhì)粒、細(xì)胞膜和細(xì)胞核，從而很容易共定位外源基因在細(xì)胞中所處的位置，分析出外源基因轉(zhuǎn)染的限速步驟，借以改進(jìn)非病毒基因輸送體系。該示蹤分析系統(tǒng)操作簡(jiǎn)便，穩(wěn)定性重復(fù)性好，可用于DNA給藥的示蹤分析。利用本發(fā)明的DNA藥物細(xì)胞內(nèi)示蹤分析方法，本發(fā)明人分析了三種非病毒基因輸送體系Lipo2000、PEI25-kDa和PEI6tltl-CyD的DNA轉(zhuǎn)染效率，同時(shí)將裸DNA作為對(duì)照。本發(fā)明人利用Cy5標(biāo)記質(zhì)粒(為藍(lán)色熒光)，Hochest標(biāo)記細(xì)胞核(為灰色熒光)，Alexa Fluor594wheat germ標(biāo)記細(xì)胞膜(為紅色突光)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過(guò)本發(fā)明的方法可在活體的情況下根據(jù)需要?jiǎng)討B(tài)地觀察外源基因在不同階段在細(xì)胞中所處的位置和運(yùn)動(dòng)情況，觀測(cè)效果良好。本發(fā)明采用不同的熒光素分別標(biāo)記外源DNA、細(xì)胞膜和細(xì)胞核，從而很容易共定位復(fù)合物在細(xì)胞中所處的位置及運(yùn)動(dòng)情況，觀察外源基因表達(dá)蛋白的初始時(shí)間及狀態(tài)，分析出外源基因轉(zhuǎn)染的限速步驟，借以改進(jìn)外源基因的輸送體系(如非病毒載體)，提高外源基因在靶細(xì)胞中的表達(dá)。本發(fā)明的主要?jiǎng)?chuàng)新與優(yōu)勢(shì)在于I)本發(fā)明的方法可以對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行染色并在顯微鏡下觀察，換而言之，如果配合連續(xù)熒光顯微鏡照相系統(tǒng)，可以觀察一段時(shí)間內(nèi)外源基因在細(xì)胞內(nèi)的分布與運(yùn)動(dòng)過(guò)程，記錄外源基因的表達(dá)，這對(duì)研究分析外源基因在細(xì)胞內(nèi)的限速步驟具有十分重要的意義。2)本發(fā)明的方法選擇的染料之間沒(méi)有“串色”現(xiàn)象，不影響實(shí)驗(yàn)的可信度。3)該系統(tǒng)并不會(huì)影響外源基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，換而言之，當(dāng)外源基因表達(dá)綠色熒光蛋白時(shí)，該系統(tǒng)可以直接發(fā)現(xiàn)外源基因在細(xì)胞內(nèi)初始表達(dá)的時(shí)間，并且也不會(huì)發(fā)生“串色現(xiàn)象”。這為理解外源基因在細(xì)胞內(nèi)的功能表達(dá)提供了更為詳細(xì)的信息。4)該方法比較簡(jiǎn)便易行且結(jié)果穩(wěn)定。5)本發(fā)明的方法可以用于建立新型非病毒載體開(kāi)發(fā)的有效簡(jiǎn)易示蹤體系，大大推進(jìn)相關(guān)實(shí)驗(yàn)室、制藥公司及生物試劑公司在此領(lǐng)域的研發(fā)進(jìn)程。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)ー步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人,分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(New York Cold Spring Harbor LaboratoryPress)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按
重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專(zhuān)業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例I、綠色熒光蛋白質(zhì)粒pEGFP的轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增與提純I、所需主要試劑與儀器設(shè)備(I)綠色突光蛋白質(zhì)粒pEGFP-Nl (簡(jiǎn)稱(chēng) pEGFP,購(gòu)自 Invotrogen)；(2)感受態(tài)菌DH5 α (上海生エ)；(3)LB培養(yǎng)基IOg胰蛋白凍，5g酵母提取物，IOgNaCl,用IL超純水配制，pH值調(diào)到7. 2-7. 4，高溫滅菌后備用； ⑷LB瓊脂培養(yǎng)基15g瓊脂加入I升LB培養(yǎng)基，高溫滅菌后待瓊脂未冷凝之吋，加入抗生素并在超凈臺(tái)中將培養(yǎng)基倒入細(xì)菌培養(yǎng)平板中，冷卻至凝固狀態(tài)后放置在4°C冰禮備用;(5)抗生素氨芐抗生素(Sigma)；(6) QIAGEN 質(zhì)粒大 抽試劑盒(QIAGEN，Plasmid Maxi Kits)；(7)水浴鍋DK_8D型電熱恒溫水槽(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；(8)立式搖床SCS_24 (上海市離心機(jī)械研究所)；(9)紫外分光光度儀Nanodrop2000 (Thermo)；(10)臺(tái)式水平離心機(jī)58IOR (Eppendorf)。2、質(zhì)粒pEGFP的轉(zhuǎn)化將I μ I質(zhì)粒(3_5ng/ μ I)加入100 μ I感受態(tài)菌DH5 α，混勻，靜置在冰上30分鐘，將感受態(tài)菌DH5 α放入42°C的水浴鍋中，熱激I. 5分鐘后立刻將感受態(tài)菌DH5 α放入冰上進(jìn)行冷卻3-5分鐘，最后將感受態(tài)菌涂于含有氨芐抗生素的瓊脂培養(yǎng)板上，放置在搖床過(guò)夜(37°C，12-16 小時(shí))。 3、質(zhì)粒pEGFP的擴(kuò)增從瓊脂培養(yǎng)板中挑取克隆后，放入含有氨芐抗生素的LB培養(yǎng)基中(氨芐抗生素終濃度100 μ g/ml)，放入搖床(37°C，300rpm，12-16 小時(shí))。4、質(zhì)粒pEGFP的提純收集菌液(4°C，6000g，15min)，打開(kāi)QIAGEN大抽試劑盒，加入IOml Pl重懸菌液沉淀后，加入IOml P2，來(lái)回?fù)u晃混勻4-6次后，室溫(15°C -25°C )靜置5min。加入IOml預(yù)冷的P3，立刻搖晃混勻4-6次，在冰上孵育20min。離心(4°C，20000g, 30min)后將上清吸到另外ー個(gè)抽提離心管，再離心(4°C，20000g，30min)取上清。利用IOmlQBT平衡QIAGEN_tip500質(zhì)粒吸附柱，然后將上清加入到吸附柱過(guò)濾。過(guò)濾之后，棄去濾液，再用30mlQC對(duì)吸附柱過(guò)柱清洗2遍。棄去濾過(guò)的清洗液QC，加入15mlQF對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行洗脫，收集洗脫液后,加入
10.5ml異丙醇,混勻離心(4で，15000g, 30min)。小心棄去上清，收集質(zhì)粒沉淀后，再用5ml70 % (v/v)こ醇重懸質(zhì)粒沉淀，室溫離心(15000g, IOmin)。得到質(zhì)粒沉淀后，室溫風(fēng)干5-10min，再用TE緩沖液溶解質(zhì)粒沉淀，利用紫外分光光度儀測(cè)量濃度和純度。純度A260/A280應(yīng)控制在I. 6-1. 8。放在_20°C冰箱保存。實(shí)施例2、質(zhì)粒DNA的熒光素標(biāo)記I、所需主要試劑與儀器設(shè)備(I)Label IT Tracker Reagent Intracellular Nucleic AcidLocalizationKit-Cy 5 (Mirus)；(2) NaCl (上海市化學(xué)試劑公司)；(3)無(wú)水こ醇(上海市化學(xué)試劑公司)(4)水浴鍋DK_8D型電熱恒溫水槽(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；(5)臺(tái)式水平離心機(jī)58IOR (Eppendorf)；(6)超凈臺(tái)VCM_420 (BI0-HAZARD)。2、質(zhì)粒DNA的熒光素標(biāo)記向 10 μ I I μ g/ μ I 的 pEGFP-Nl 中加入 IOXLabeling Buffer A (Mirus) 1()μ1，再加入滅菌的超純水7 μ1，最后加入Label IT Tracker Reagent (Mirus) 5 μ I,組成10()μ1反應(yīng)體系，在37°C水浴鍋中，避光孵育I小時(shí)進(jìn)行反應(yīng)。加入1/10體積的5M的NaCl和兩倍體積的無(wú)水こ醇，在-20°C冰箱中放置30分鐘后，12000rpm進(jìn)行離心10分鐘去除未參加反應(yīng)的 Label IT Tracker Reagent,用 500 μ I 70% (v/v)的こ醇清洗沉淀，12000rpm 離心 10
分鐘后重新收集沉淀，棄去上清。在超凈臺(tái)中吹干沉淀后，用超純水溶解沉淀，放置在-20°C冰箱，避光保存。實(shí)施例3、質(zhì)粒DNA與轉(zhuǎn)染試劑的復(fù)合I、轉(zhuǎn)染試劑 轉(zhuǎn)染試劑采用納米非病毒基因輸送體系，具體使用的材料是PEI_25kDa，為ー種商品化的轉(zhuǎn)染試劑，購(gòu)自Sigma公司。2、被轉(zhuǎn)染細(xì)胞Hela細(xì)胞系、C5. 18細(xì)胞系，購(gòu)自ATCC。3、PEI-25kDa同質(zhì)粒pEGFP的復(fù)合、轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染液的配制先將PEI_25kDa用超純水制備成4. 5μ g/μ I的儲(chǔ)存液，將質(zhì)粒稀釋成 O. 05 μ g/μ I 備用。然后根據(jù) 4. 5 μ g/ μ I PEI_25kDa = IOOnmoI/ μ I 有效“N”，I μ g/μ I質(zhì)粒=3nmol/y I有效“P”進(jìn)行計(jì)算。然后將40μ 1,0. 05μ g/μ I的pEGFP同相應(yīng)濃度(根據(jù)N/P算出的濃度)的40 μ I的PEI-25kDa進(jìn)行等體積混合，緩慢滴加并且在震蕩器上以最高速度震蕩20秒，室溫下靜置30分鐘，再加入Iml無(wú)血清培養(yǎng)基DMEM，混勻，靜置5分鐘后可用。對(duì)于Hela細(xì)胞系，PEI-25kDa N/P = 20 ;對(duì)于C5. 18細(xì)胞系，PEI_25kDa N/P = 10。將Hela細(xì)胞系以IXlO5/孔，每孔Iml種于12孔板。種板24小時(shí)之后，細(xì)胞密度接近90%以上，將培養(yǎng)基棄去，用PBS清洗一遍之后加入轉(zhuǎn)染液，每孔1ml。將C5. 18細(xì)胞系以2X IO5/孔，每孔Iml種于12孔板。種板24小時(shí)之后，細(xì)胞密度接近90%以上，將培養(yǎng)基棄去，用PBS清洗一遍之后加入轉(zhuǎn)染液，每孔1ml。實(shí)施例4、復(fù)合物中質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染后在細(xì)胞內(nèi)的示蹤分析I、所需主要試劑與儀器設(shè)備(I)HBSS 緩沖液(Invitrogen)；(2) PEI-25kDa (Sigma)；(3)Hoechst 33342 labeling solution(Invitrogen)；(4)Alexa Fluor 594 wneat germ agglutinin (Invitrogen)；(5)細(xì)胞培養(yǎng)箱HerA cell 150 (Heraeus)；(6)超凈臺(tái)VCM-420 (BIO-HAZARD)；(7)激光共聚焦顯微鏡Tcs sp5(Leica)。2、復(fù)合物中質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染后在細(xì)胞內(nèi)的示蹤PEI-25kDa 組 N/P = 10。轉(zhuǎn)染 30min，2h，4h，8h，12h，16h，20h，24h 后，分別棄去上清，利用HBSS將細(xì)胞清洗兩次，然后加入2. O μ g/ml Hoechst 33342和10 μ g/ml AlexaFluor 594wheat germ agglutinin的標(biāo)記溶液，37°C孵育10分鐘。棄去上清，并用HBSS緩沖液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行兩次清洗，再加入4%多聚甲醛，37°C孵育15分鐘后，棄去多聚甲醛，加入
I.5毫升HBSS。進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡的觀察。熒光素Cy5的激發(fā)光波長(zhǎng)為649nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為670nm。Hoechst33342的激發(fā)光波長(zhǎng)為350nm,發(fā)射光波長(zhǎng)為461nm。Alexa Fluor594wheat germagglutinin的激發(fā)光波長(zhǎng)為591nm,發(fā)射光波長(zhǎng)為618nm。綠色突光蛋白的激發(fā)光波長(zhǎng)為488nm,發(fā)射光波長(zhǎng)為509nm。利用上述體系，本發(fā)明人分析了非病毒基因載體PEI_25kDa在對(duì)于Hela細(xì)胞系和C5. 18細(xì)胞系轉(zhuǎn)染過(guò)程中，外源基因在細(xì)胞內(nèi)的分布、運(yùn)動(dòng)過(guò)程，并記錄記錄外源基因表達(dá)起始時(shí)間及表達(dá)情況。利用Cy5標(biāo)記外源基因(此處為藍(lán)色熒光，整個(gè)攜帶外源基因的質(zhì)粒載體為藍(lán)色熒光)，Hochest標(biāo)記細(xì)胞核(此處為灰色熒光)，Alexa Fluor 594wheatgerm agglutitin標(biāo)記細(xì)胞膜(此處為紅色突光)，外源基因表達(dá)后為綠色突光。通過(guò)該系統(tǒng)可在活體的情況下根據(jù)需要?jiǎng)討B(tài)地觀察外源基因在不同階段時(shí)期在細(xì)胞中所處的位置和運(yùn)動(dòng)情況，以及外源基因初始表達(dá)時(shí)間及表達(dá)情況。結(jié)果如圖I與圖2，可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)PEI_25kDa(N/P = 20)轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞系時(shí)，在轉(zhuǎn)染后4小時(shí)的時(shí)候就有細(xì)胞開(kāi)始表達(dá)綠色熒光蛋白(圖中，以箭頭標(biāo)示，而PEI-25kDa(N/P =20)轉(zhuǎn)染C5. 18細(xì)胞系時(shí)，在轉(zhuǎn)染后8小時(shí)的時(shí)候才有細(xì)胞開(kāi)始表達(dá)綠色熒光蛋白。而且相 比較轉(zhuǎn)染后4小時(shí)、8小時(shí)、12小時(shí)、16小時(shí)、20小時(shí)、24小時(shí)這6個(gè)時(shí)間點(diǎn)中，Hela細(xì)胞系中表達(dá)綠色熒光蛋白的陽(yáng)性細(xì)胞百分比都要高于C5. 18細(xì)胞系中表達(dá)綠色熒光蛋白的陽(yáng)性細(xì)胞百分比。轉(zhuǎn)染48小時(shí)以后，PEI-25kDa(N/P = 20)對(duì)于Hela細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染效率可以達(dá)到50%，而PEI-25kDa(N/P = 20)對(duì)于C5. 18細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染效率卻只有20%左右。這與本發(fā)明人之前通過(guò)細(xì)胞流式分析得到的PEI-25kDa對(duì)于Hela細(xì)胞系與C5. 18細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染效率定量分析結(jié)果相一致。類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)已重復(fù)3次以上，結(jié)果穩(wěn)定可靠。利用本發(fā)明的外源基因細(xì)胞內(nèi)運(yùn)動(dòng)表達(dá)分析技術(shù)，比較PEI_25kDa在不同細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染可以發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞系的過(guò)程中，在30min的時(shí)候就有質(zhì)粒已經(jīng)入核，而且基本上每ー個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中都發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒。這說(shuō)明PEI-25kDa在轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞系時(shí)，質(zhì)粒的入核過(guò)程十分迅速。然而對(duì)于C5. 18細(xì)胞系而言，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，雖然在30min的時(shí)候同樣在每一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中都可以發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒，但是入核的比例卻較之Hela細(xì)胞系中少了很多。而且在2小時(shí)的時(shí)候，發(fā)現(xiàn)C5. 18細(xì)胞系中的質(zhì)粒依然主要聚集在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)附近，而并沒(méi)有向細(xì)胞核運(yùn)輸。這說(shuō)明質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸很有可能是導(dǎo)致最終PEI-25kDa在C5. 18細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染效率低于Hela細(xì)胞系的限速步驟。但是如果需要進(jìn)ー步研究細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的限速原因，則需要結(jié)合其它手段進(jìn)行分析和討論。綜上實(shí)施例，本發(fā)明的技術(shù)方案包含如下改進(jìn)本發(fā)明所用的Cy5染料對(duì)質(zhì)粒中的外源基因的表達(dá)是不會(huì)影響的，這一點(diǎn)是優(yōu)于量子點(diǎn)標(biāo)記的方法的。所以，用此標(biāo)記方法，不僅可以觀察到質(zhì)粒的運(yùn)動(dòng)情況，還能夠觀察到質(zhì)粒的表達(dá)情況。這一點(diǎn)尤為關(guān)鍵，因?yàn)槿绻胍业僵`種外源基因輸送體系(如非病毒基因輸送體系，或稱(chēng)為非病毒基因載體)進(jìn)入細(xì)胞并最終表達(dá)的限速步驟，應(yīng)該是ー個(gè)循序漸進(jìn)的過(guò)程。首先需要先分清限速歩驟是發(fā)生在細(xì)胞外，細(xì)胞質(zhì)還是細(xì)胞核，其次再結(jié)合其它方法來(lái)細(xì)分這三個(gè)區(qū)域中的可能限速步驟。例如，如果發(fā)現(xiàn)某種外源基因輸送體系進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)很快，但是進(jìn)入細(xì)胞核很慢，那么就可以再結(jié)溶酶體染色的方法，來(lái)觀察是否是在細(xì)胞質(zhì)中的溶酶體對(duì)外源基因輸送體系起到了限速步驟。整個(gè)研究的過(guò)程是需要分開(kāi)的，獨(dú)立的，但是應(yīng)該是有ー個(gè)先后的順序，即先發(fā)現(xiàn)限速區(qū)域(細(xì)胞膜，細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核)，再找到每個(gè)區(qū)域內(nèi)的限速步驟。本發(fā)明所采用的試劑是比較低毒的，故可以在相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行活體實(shí)時(shí)跟蹤拍攝。當(dāng)然，由于激光的長(zhǎng)時(shí)間激發(fā)，也會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒性，以及對(duì)熒光染料會(huì)產(chǎn)生一定的淬滅。本發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在4小時(shí)以?xún)?nèi)的細(xì)胞毒性是可控的。為了提高拍攝的效果，本發(fā)明人對(duì)染料的用量也進(jìn)行了優(yōu)化。如Alexa Fluor 594 wheat germagglutitin的量采用約10 μ g/ml的終濃度，在沒(méi)有顯著提高對(duì)細(xì)胞的毒性的前提下，可以較大地增強(qiáng)染色效果，有效地提高拍攝質(zhì)量。對(duì)于樣品的保存上本發(fā)明也進(jìn)行了改進(jìn)。一般情況下，技術(shù)人員往往會(huì)利用4 %多聚甲醛固定的方法來(lái)保存樣品，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)利用這種方法來(lái)保存樣品，會(huì)使得染膜的染料Alexa Fluor 594隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸進(jìn)入細(xì)胞核,使得標(biāo)記的效果大大降低(這個(gè)方法的保存時(shí)間一般在3-5天)。而如果不采用4%多聚甲醛固定的方法，而是將制備好的樣品直接放在4°C下則可以大大延長(zhǎng)保存的時(shí)間，保存時(shí)間是在10天以上。本發(fā)明的方法可以同時(shí)使用4種熒光對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，不影響外源基因的表達(dá)，并且可進(jìn)行活體實(shí)時(shí)拍攝。 在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每ー篇文獻(xiàn)被単獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種外源基因的細(xì)胞內(nèi)示蹤方法，其特征在于，所述方法包括 (1)以Cy5熒光素標(biāo)記外源基因，將經(jīng)過(guò)標(biāo)記的外源基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)； (2)以染料Hochest標(biāo)記細(xì)胞的細(xì)胞核； (3)以染料AlexaFluor 594麥胚凝集素標(biāo)記細(xì)胞膜；和 (4)以細(xì)胞中的灰色熒光標(biāo)記的細(xì)胞核以及紅色熒光標(biāo)記的細(xì)胞膜為參照，觀察藍(lán)色熒光標(biāo)記的外源基因在細(xì)胞內(nèi)的分布或運(yùn)動(dòng)情況。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的外源基因存在于質(zhì)粒中。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的以Cy5熒光素標(biāo)記外源基因的方法是 將Cy5熒光素與外源基因共孵育后，加入NaCl和無(wú)水こ醇，靜置、離心取沉淀，洗滌后收集沉淀，獲得Cy5熒光素標(biāo)記的外源基因。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的以染料Hochest標(biāo)記細(xì)胞的細(xì)胞核的方法是 在細(xì)胞中加入染料Hochest標(biāo)記溶液，共孵育，收集細(xì)胞并洗滌，獲得細(xì)胞核標(biāo)記染料Hochest的細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的以染料AlexaFluor 594麥胚凝集素標(biāo)記細(xì)胞膜的方法是 在細(xì)胞中加入Alexa Fluor 594麥胚凝集素標(biāo)記溶液，共孵育，收集細(xì)胞并洗滌，獲得細(xì)胞膜標(biāo)記染料Alexa Fluor 594麥胚凝集素的細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察或拍攝外源基因在細(xì)胞內(nèi)的分布、運(yùn)動(dòng)或表達(dá)情況。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在干， 突光素Cy5的激發(fā)光波長(zhǎng)為649nm,發(fā)射光波長(zhǎng)為670nm ； 染料Hoechst的激發(fā)光波長(zhǎng)為350nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為461nm ;或 染料Alexa Fluor 594麥胚凝集素的激發(fā)光波長(zhǎng)為591nm,發(fā)射光波長(zhǎng)為618nm。
8.如權(quán)利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，所述的外源基因是綠色熒光蛋白的編碼基因；其表達(dá)后獲得的蛋白顯示綠色熒光。
9.ー種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒用于對(duì)外源基因進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)示蹤，其中含有Cy5突光素、染料Hochest和染料Alexa Fluor 594麥胚凝集素。
10.如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，其中還含有選自以下的ー種或多種試劑 標(biāo)記緩沖液，滅菌水，氯化鈉，こ醇，洗滌劑或轉(zhuǎn)染試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種外源基因的示蹤體系及其應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)化了一種DNA細(xì)胞內(nèi)示蹤的方法，選擇到了多種顯色標(biāo)記來(lái)標(biāo)記DNA、細(xì)胞核以及細(xì)胞膜，從而利用共定位的方法研究外源基因在細(xì)胞內(nèi)的存在以及運(yùn)動(dòng)情況，并優(yōu)化了顯色標(biāo)記的用法用量。借助本發(fā)明構(gòu)建的示蹤系統(tǒng)可以對(duì)外源基因在轉(zhuǎn)染過(guò)程中的運(yùn)動(dòng)情況、限速步驟進(jìn)行較為全面的分析，方法簡(jiǎn)單易行、穩(wěn)定可靠。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102643894SQ20111004028
公開(kāi)日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2011年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月17日
發(fā)明者張曉玲, 戴尅戎, 童海駿 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院