表達外源基因的重組流感病毒及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種表達外源基因的重組流感病毒及其 制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 流感病毒是分節(jié)段的單股負鏈RNA病毒，屬于正粘病毒科（Orthomyxoviridae)流 感病毒屬（Influenza virus)。A型流感是目前最主要的威脅人類及動物健康的疾病之一， 它可以在數(shù)月內(nèi)感染全世界30 %的人口，致死率保守的估計達2 %。但流感的大流行一般 較少發(fā)生，平均每10-50年發(fā)生一次。二十世紀以來，歷史上發(fā)生了五次流感大流行，分別 是1918年的西班牙流感、1957年亞洲流感、1968年香港流感和1977年的俄國流感、2009年 的Pademic H1N1流感。每次流感的爆發(fā)都給人類的健康和社會經(jīng)濟造成了巨大的損失。為 了預防和控制流感病毒，新的抗流感病毒藥物的開發(fā)勢在必行。
[0003] Tokiko Watanabe等在通過構(gòu)建一系列缺失質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后檢驗比較包裝效率后，確 定了對于病毒包裝所需要的HA vRNA利用的HA包裝信號。表達外源基因的流感病毒可用 于篩選抗病毒藥物、中和抗體、用作疫苗、以及用于體內(nèi)病毒傳播和致病性研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決目前缺乏高效的抗流感病毒藥物的技術(shù)問題，提供一種表達外源基 因的重組流感病毒，該重組流感病毒不僅能用于研制新型的病毒疫苗，而且能用于篩選抗 病毒藥物。
[0005] 此外，還需要提供一種上述表達外源基因的重組流感病毒的制備方法和應(yīng)用。
[0006] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0007] 在本發(fā)明的一個方面，提供了一種表達外源基因的重組流感病毒，該重組流感病 毒是在PR8流感病毒的HA基因包裝信號序列中插入外源基因的重組病毒。
[0008] 優(yōu)選的，所述外源基因包括：海腎熒光素酶基因、鴨坦布蘇病毒E蛋白第三結(jié)構(gòu)域 基因序列、或J19N2亞型SH441毒株HA基因。
[0009] 在本發(fā)明的另一方面，提供了一種核酸分子，包含PR8流感病毒的HA基因序列，在 該HA基因的包裝信號序列中插入有外源基因序列。
[0010] 所述外源基因包括：海腎熒光素酶基因、鴨坦布蘇病毒E蛋白第三結(jié)構(gòu)域基因序 列、或H9N2亞型SH441毒株HA基因。
[0011] 在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種包含上述核酸分子的重組載體。
[0012] 在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種表達外源基因的重組流感病毒的制備方法， 包括以下步驟：
[0013] 構(gòu)建含PR8流感病毒HA基因的重組載體，所述HA基因的包裝信號序列中插入有 外源基因序列；
[0014] 將所述重組載體，與分別轉(zhuǎn)錄PR8病毒PB1、PB2、PA、NP、NA、M、NS基因的質(zhì)粒、以 及瞬時表達PB1、PB2、PA、NP和HA的質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染293T細胞，拯救獲得表達外源基因的重 組流感病毒。
[0015] 在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種上述重組流感病毒的應(yīng)用，用于制備抗病毒 疫苗。
[0016] 在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種上述重組流感病毒的應(yīng)用，用于篩選抗病毒 藥物。當本發(fā)明重組流感病毒中插入的外源基因是熒光蛋白基因如海腎熒光素酶基因時， 該重組流感病毒可用于篩選新的抗病毒藥物。
[0017] 本發(fā)明表達外源基因的重組流感病毒，不僅能用于研制新型的病毒疫苗，而且能 用于篩選抗病毒藥物。
【附圖說明】
[0018] 下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步詳細的說明。
[0019] 圖1是本發(fā)明實施例2含EDIII肽段重組病毒HA-EDIII-HA表達外源基因的 Western Blot鑒定結(jié)果圖；
[0020] 圖2是本發(fā)明實施例2激光共聚焦顯微鏡觀察外源蛋白定位結(jié)果圖；
[0021] 圖3是本發(fā)明實施例2病毒傳代培養(yǎng)后外源基因檢測結(jié)果圖；
[0022] 圖4是本發(fā)明實施例2的HA-EDIII-HA病毒在MDCK-HA2細胞上生長曲線圖；
[0023] 圖5是本發(fā)明實施例2的HA-EDIII-HA肌肉注射接種免疫動物實驗結(jié)果圖；
[0024] 圖6是本發(fā)明實施例2的HA-EDIII-HA靜脈注射接種免疫動物實驗結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0025] 下列實施例中，未注明具體條件的實驗方法，通常按常規(guī)條件，如《精編分子生物 學實驗指南》(F.M.奧斯伯，R.E.金斯頓，J.G.塞德曼等主編，馬學軍，舒躍龍的譯.北京： 科學出版社，2004)中所述的方法進行。
[0026] 本發(fā)明利用反向遺傳操作技術(shù)和穩(wěn)定表達HA蛋白的細胞系，在PR8-HA包裝信號 內(nèi)插入不同外源基因，構(gòu)建嵌合重組病毒。并對在MDCK-HA2細胞系中穩(wěn)定表達外源基因的 重組病毒HA-EDIII-HA，免疫實驗動物，跟蹤監(jiān)測動物血液內(nèi)針對外源蛋白的抗體情況，從 而進一步確定其具有免疫保護效果。
[0027] 本發(fā)明首先將PR8的HA基因包裝信號插入到RNA轉(zhuǎn)錄載體，然后在包裝信號之 間分別插入海腎熒光素酶基因（Renilla luciferase)、鴨坦布蘇病毒（DTMUV)密碼子優(yōu)化 的或野生的E基因、鴨坦布蘇病毒密碼子優(yōu)化或野生的EDIII序列、密碼子優(yōu)化或野生的 H9N2亞型SH441毒株的HA基因，利用流感病毒反向遺傳操作系統(tǒng)拯救病毒。結(jié)果顯示：含 有HA-Renilla-HA、HA-EDIII-HA、HA-441-HA-HA的重組病毒可以拯救成功，通過RT-PCR方 法證明外源基因存在于重組病毒中。
[0028] 本發(fā)明進一步將表達外源EDIII肽段的重組HA-EDIII-HA病毒感染MDCK-HA2細 胞進行傳代后，用l〇〇y ll〇3TCID5(l感染細胞后，60h后血凝價達到最高為25,48h病毒滴度 最高達到10 5_°TCID5(l/100iil。通過激光共聚焦和Western Blot方法，發(fā)現(xiàn)在HA-EDIII-HA 病毒感染細胞中，可同時在胞質(zhì)檢測到NP蛋白和EDIII蛋白的表達。
[0029] 本發(fā)明以四周齡的SPF麻鴨為實驗動物模型，經(jīng)肌肉、靜脈接種HA-EDIII-HA、 HA-Renilla-HA，同時設(shè)陰性對照，免疫兩次，用間接ELISA方法跟蹤測定麻鴨體內(nèi)EDIII的 抗體水平。結(jié)果顯示：HA-EDIII-HA組在二免一周內(nèi)EDIII抗體快速上升，隨后下降，靜脈 免疫抗體高于肌肉免疫。第二次免疫后2周，肌肉接種10 3 5ELD5Q的鴨坦布蘇病毒FX2010， 攻毒后l、2、3、4d采血，熒光定量PCR檢測麻鴨血液中病毒核酸拷貝數(shù)，分析病毒在麻鴨體 內(nèi)的增殖情況。結(jié)果顯示：攻毒后第一天，HA-Renilla-HA組的病毒核酸拷貝數(shù)和對照組相 近，HA-EDIII-HA組較低；第二天，HA-EDIII-HA組病毒核酸拷貝數(shù)明顯低于HA-Reni 11 a-HA 和PBS組；第三天和第四天，所有組別的鴨子病毒核酸拷貝數(shù)含量下降，而HA-EDIII-HA組 明顯低于其他組。這些實驗結(jié)果表明，本發(fā)明表達外源基因EDIII的重組流感病毒能在動 物體內(nèi)激發(fā)有效的抗體反應(yīng)，起到免疫保護作用。
[0030] 實施例1表達海腎熒光素酶（Renilla luciferase)蛋白的流感病毒株
[0031] 1?將Renilla luciferase基因插入含有HA包裝信號質(zhì)粒的構(gòu)建
[0032]以 pIRES-Renilla 質(zhì)粒為模板，用 xhoI-Renilla-F 和 NheI-Reni11a-R(xhoI-Reni11a-F ：CTACTCGAGGCCACCATGACTTCGAAAGTTTATGATCC(SEQ ID 引物擴增海腎熒光素酶基因Renilla luciferase序列（SEQ ID NO. 1)。并用XhoI、NheI雙 酶切連接于同樣雙酶切的roC19-HA-packaging signals載體上（本實驗室構(gòu)建，其中，HA 基因的包裝信號序列如SEQ ID NO. 21所示，在SEQ ID NO. 21中，43-100位核苷酸序列是插 入的酶切位點），轉(zhuǎn)化，PCR鑒定，提取陽性質(zhì)粒pUC19-HA-Renilla-HA，用M13-47, RV-M測 序引物測序，
[0033] M13-47 :5, -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3,（SEQ ID N0. 6)，
[0034] RV-M:5,-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3,（SEQ ID NO. 7)。
[0035] 測序正確后，內(nèi)毒素抽提質(zhì)粒，于-20°C備用。
[0036] 2?含有 Renilla luciferase 病毒的搖救
[0037] 轉(zhuǎn)染前12_24h，將293T細胞鋪于6孔板上，當單層細胞的密度達到80%以上時進 行轉(zhuǎn)染。用轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine?2000，（除 4 個輔助質(zhì)粒 pCAGGS-PB2、pCAGGS-PBl、 pCAGGS-PA 和 pCAGGS-NP 每個轉(zhuǎn)染 1 ii g，其余 9 個質(zhì)粒