一株高耐受性拜氏梭菌及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株高耐受性拜氏梭菌Clostridium?beijerinckii?M17?CCTCC?NO：M?2013425及其在生產丁醇中的應用。該菌株通過常溫等離子體誘變和篩選獲得，對未脫毒木質纖維酸解糖液中的毒素物質具有高度耐受性，在酚濃度高達2.0g/L的發(fā)酵液中，能非常好地發(fā)酵生產丁醇，其總溶劑產量和丁醇產量分別達到了10.9g/L和7.9g/L，即使酚濃度高達2.4g/L，本發(fā)明菌株仍具有可觀的產丁醇能力，說明本發(fā)明菌株拜氏梭菌M17不僅對甘蔗渣酸解糖液具有高效利用率，且對其中的毒素抑制物，尤其是酚類化合物具有高度耐受性，是一種適合利用甘蔗渣發(fā)酵產丁醇的優(yōu)良菌種。
【專利說明】一株高耐受性拜氏梭菌及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一株能利用未脫毒甘蔗渣酸解糖液發(fā)酵產丁醇的高耐受性拜氏梭菌及其應用，屬于生物發(fā)酵【技術領域】。
【背景技術】
[0002]丁醇是無色液體，有酒味，與乙醇/乙醚及其他多種有機溶劑混溶；已廣泛應用于增塑劑等各種精細化學品的制造。丁醇具有能量密度大、可與汽油任意比混合、可直接用于內燃機、運輸方便等優(yōu)點；作為可再生的新型液體燃料受到越來越多的重視。
[0003]隨著化石能源的日益枯竭和價格飛漲，利用可再生的木質纖維質原料(如秸桿、甘鹿洛等)發(fā)酵生產丁醇，成為研究的重點和熱點之一。Thaddeus Ezeji等(BioresourceTechnology.2008, 99: 5915-5922)利用拜氏梭菌突變株 BA101，以 XAD-4 resin 脫毒的玉米芯酸解和酶解糖液為底物發(fā)酵，總溶劑產量為9.30 g/L ;但突變株BAlOl不能利用未脫毒的酸解糖液發(fā)酵產丁醇。龐浩等(生物技術，2011，21(5)，79-82)報道拜氏梭菌13-2株對甘蔗渣水解液具有較高的發(fā)酵效率，在0.5%硫酸用量條件下，它的丁醇發(fā)酵量最高可達到4.5g /L0中國專利ZL 201110020102.6報道:通過粒子束誘變育種得到的拜氏梭菌iflostridium beijerinckii) IB4對酹類化合物具有較高的抗逆性,其能以未脫毒的玉米芯酸解糖液作為碳源，在2L發(fā)酵罐中總溶劑產量和丁醇產量分別達到了 10.3g/L和 7.1 g/L ;同時，以未脫毒的甘蔗渣酸解糖液作為碳源，在2L發(fā)酵罐中總溶劑產量和丁醇產量分別達到了 10.6 g/L和 7.3 g/L。然而,郭亭等(J Ind Microbiol Biotechnol., 2012,39(3)，401-407)研究發(fā)現(xiàn)，當玉米芯和甘蔗渣酸解糖液中的酚類化合物的濃度提升到1.5g/L以上時,拜氏梭菌{Clostridium bei jerinckii) IB4基本不生長。
[0004]甘蔗渣是一種重要的可再生木質纖維原料，利用蔗渣生產丁醇，不僅節(jié)約資源，還促進制糖產業(yè)節(jié)能減排，產業(yè)升級。但是，甘蔗渣等原料經稀酸處理后，會產生有機酸、糠醛、酚類等抑制物，這些抑制物的去除成本較高、并對微生物生長有一定的抑制作用；Thaddeus Ezeji 等(Biotechnology & Bioengineering.2007, 97 (6): 1460-1469)研究發(fā)現(xiàn)有機酸、糠醛等抑制物不影響丁醇的發(fā)酵，而酚類抑制物對丁醇發(fā)酵有明顯的抑制效果。基于此，甘蔗渣酸解糖液中的毒素抑制物(尤其是酚類化合物)嚴重抑制產丁醇梭菌的發(fā)酵性能；而菌種改良是提高菌株對抑制物的耐受性、發(fā)酵經濟性的關鍵手段之一。

【發(fā)明內容】

[0005]為了解決上述存在的問題，本發(fā)明通過誘導突變和篩選的方法獲取一株不僅對甘蔗渣酸解糖液具有高效利用率，且對其中的毒素抑制物(尤其是酚類化合物)具有高度耐受性的突變菌株。
[0006]本發(fā)明的目的在于提供一株新菌種:拜氏梭菌iClos tridium beijerincki?)M17。
[0007]本發(fā)明的另一個目的在于提供上述菌株在丁醇生產中的應用。[0008]本發(fā)明所采取的技術方案是:
申請人:將菌株保藏在位于武漢市武昌珞珈山武漢大學的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏中心于2013年9月14日收到 申請人:提供的菌株。保藏中心給予該培養(yǎng)物的保藏號為CCTCC NO:M 2013425，提議的分類命名為知clostridium beijerinckiim17，已于2013年9月23日鑒定保藏的菌株是存活的。
[0009]一種生產丁醇的方法，其特征在于:包括以下步驟:
1)平板培養(yǎng):將拜氏梭菌{Clostridiumbeijerinckii) Ml7接種至平板培養(yǎng)基上,進行厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度33~37 °C，培養(yǎng)時間12~24 h，使菌種活化；
2)種子培養(yǎng):將平板培養(yǎng)活化的拜氏梭菌{Clostridiumbeijerinckii) M17接種到種子培養(yǎng)基中，100 mL的厭氧瓶裝液量40~60mL，充氮氣3~5min，培養(yǎng)溫度33~37 °C,培養(yǎng)時間12~24h ；
3)發(fā)酵產丁醇:將種子培養(yǎng)后的拜氏梭菌ijOlostridiumbeijerinckii) M17菌液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量按5~15%的體積百分比，充氮氣3~5min，發(fā)酵溫度33~37°C，發(fā)酵培養(yǎng)時間為70~90 h，即可發(fā)酵產出丁醇。
[0010]進一步的，步聚I)所述的平板培養(yǎng)基包含如下質量百分比的組分:碳源0.3%~1%、氮源0.5%~1%、無機鹽0.5%~0.8%、瓊脂1.5%~2%、其余為水；其中，碳源選自葡萄糖、淀粉、甘蔗渣酸解糖液、玉米芯酸解糖液中至少一種；氮源選自乙酸銨、氯化銨、蛋白胨、酵母粉、玉米漿中的至少一種；無機鹽選自鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、磷酸鹽、亞鐵鹽中的至少一種。
[0011]進一步的，步聚2)所述的種子培養(yǎng)基包含如下質量百分比的組分:碳源0.5%~1%、氮源0.5%~1%、無機鹽0.5%~0.8%、其余為水；其中，碳源選自淀粉、葡萄糖中至少一種；氮源選自乙酸銨、氯化銨、蛋白胨、酵母粉、玉米漿中至少一種；無機鹽選自鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、磷酸鹽、亞鐵鹽中至少一種。
[0012]進一步的，步聚3)所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包含如下質量百分比的組分:碳源3%~6%、氮源0.1%~0.3%、無機鹽0.1%~0.2%、生長因子0.05%~0.1%、其余為水；其中，碳源選自葡萄糖、木糖、甘蔗渣酸解糖液、玉米芯酸解糖液中至少一種；氮源選自乙酸銨、氯化銨、酵母粉中至少一種；無機鹽選自鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽、磷酸鹽、亞鐵鹽中至少一種；生長因子選自對氨基苯甲酸、維生素B1、生物素和玉米漿中至少一種。
[0013]本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明菌株拜氏梭菌beijerinckii M17對未脫毒木質纖維酸解糖液中的毒素物質具有高度耐受性，在酚濃度高達2.0 g/L的發(fā)酵液中，能非常好地發(fā)酵生產丁醇，其總溶劑產量和丁醇產量分別達到了 10.9 g/L和7.9 g/L，即使酚濃度高達2.4 g/L，本發(fā)明菌株仍具有可觀的產丁醇能力，說明本發(fā)明菌株拜氏梭菌M17對毒素物質耐受性強、溶劑產量和丁醇產量高、重復性好，是一種適合利用甘蔗渣發(fā)酵產丁醇的優(yōu)良菌種。
[0014]本發(fā)明菌株拜氏梭菌CViosirii/iw? beijerinckii M17對甘鹿洛酸解糖液具有高效的利用率，且對其中的毒素抑制物(尤其是酚類化合物)具有高度的耐受性，這不僅有利于丁醇的生產，還有利于資源的節(jié)約，促進制糖產業(yè)的節(jié)能減排，促進產業(yè)升級。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為拜氏梭菌的等離子體誘變存活率曲線?！揪唧w實施方式】
[0016]根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結果僅用于說明本發(fā)明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。
[0017]實施例1
一、等離子體誘變原始拜氏梭菌株
拜氏梭菌原始菌株進行第一步等離子體誘變的方法如下:
將拜氏梭菌NCMB 8052原始菌株活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度33~37°C，50ml肖特厭氧瓶裝液量為15~20ml，充氮氣3min，培養(yǎng)時間12~18 h，得到生長旺盛的菌液；取新鮮培養(yǎng)的細胞稀釋至細胞濃度OD6tltl=0.1~1.0，滴加在滅菌冷卻后的載片上，用無菌空氣吹干；以氦氣為放電氣體，以100W作為射頻功率，以10SLM作為氣體流量，以10~240s作為輻照時間對菌株進行等離子體誘變，誘變后，將載體上的菌膜洗脫下來，計算存活率。實驗結果如附圖1所示；由圖1可知，180s是最佳的誘變輻照時間。
[0018]二、篩選誘變后的目的拜氏梭菌株 (I)培養(yǎng)基配方(％為質量百分比):
1.甘蔗渣酸解糖 液平板培養(yǎng)基:酵母粉0.3%，蛋白胨0.5%，可溶性淀粉1%，乙酸銨0.2%，氯化鈉0.2%，七水合硫酸鎂0.3%，磷酸二氫鉀0.1%，磷酸氫二鉀0.1%，七水合硫酸亞鐵0.01%,瓊脂1.5%，刃天青0.02%,甘蔗渣酸解糖液25% (v/v)，其余為水，pH 6。
[0019]2.種子培養(yǎng)基:酵母粉0.3%，蛋白胨0.5%，可溶性淀粉1%，乙酸銨0.2%，氯化鈉
0.2%，七水合硫酸鎂0.3%，磷酸二氫鉀0.1%，磷酸氫二鉀0.1%，七水合硫酸亞鐵0.01%,其余為水，pH 6。
[0020]3.搖瓶發(fā)酵初篩培養(yǎng)基:葡萄糖3%，乙酸銨0.22%，磷酸二氫鉀0.05%,磷酸氫二鉀0.05%,氯化鈉0.001%,七水合硫酸鎂0.02%,七水合硫酸亞鐵0.001%, 一水合硫酸錳
0.001%，玉米漿0.1%，其余為水，pH 6.6ο
[0021]5.搖瓶發(fā)酵復篩培養(yǎng)基:甘蔗渣酸解糖液3%，乙酸銨0.22%，磷酸二氫鉀0.05%，磷酸氫二鉀0.05%,氯化鈉0.001%,七水合硫酸鎂0.02%,七水合硫酸亞鐵0.001%, 一水合硫酸錳0.001%，玉米漿0.1%，其余為水，pH 6.6ο
[0022](2)篩選步驟:
1、甘蔗渣酸解糖液平板培養(yǎng)基培養(yǎng)
將誘變后的載片置于裝有I~2ml生理鹽水的具塞試管中，劇烈震蕩，將載片上的菌株洗脫，稀釋成不同濃度涂布于甘蔗渣酸解糖液平板培養(yǎng)基上，33~37°C厭氧培養(yǎng)12~36h，挑選出透明圈和菌落較大的菌落50株，分別編號Ml~M50，將其分別用種子培養(yǎng)基進行擴大培養(yǎng)，并保種。
[0023]2、搖瓶發(fā)酵初篩
將初篩的擴大培養(yǎng)后的50株菌落和原始菌株接種到搖瓶發(fā)酵初篩培養(yǎng)基中，接種量10% (v/v), 100 mL肖特厭氧瓶裝液量50 mL，發(fā)酵溫度35°C，發(fā)酵時間72 h后檢測各菌株的總溶劑產量和丁醇產量，結果顯示菌株M17、M39和M48可發(fā)酵產出較高的丁醇產量，如表I所示。[0024]表1各菌株的總溶劑產量和丁醇產量
【權利要求】
1.一株拜氏梭菌，其分類命名為CVo1Siribeijerinckii M17,已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號:CCTCC NO:M 2013425。
2.權利要求1所述的Clostridiumbeijerinckii M17在生產丁醇中的應用。
3.—種生產丁醇的方法，其特征在于:包括以下步驟: 1)平板培養(yǎng):將拜氏梭菌{Clostridiumbeijerinckii) Ml7接種至平板培養(yǎng)基上,進行厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度33~37 °C，培養(yǎng)時間12~24 h，使菌種活化； 2)種子培養(yǎng):將平板培養(yǎng)活化的拜氏梭菌{Clostridiumbeijerinckii) M17接種到種子培養(yǎng)基中，100 mL的厭氧瓶裝液量40~60mL，充氮氣3~5min，培養(yǎng)溫度33~37 °C,培養(yǎng)時間12~24h ； 3)發(fā)酵產丁醇:將種子培養(yǎng)后的拜氏梭菌ijOlostridiumbeijerinckii) M17菌液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量按5~15%的體積百分比，充氮氣3~5min，發(fā)酵溫度33~37°C，發(fā)酵培養(yǎng)時間為70~90 h，即可發(fā)酵產出丁醇。
4.根據(jù)權利要求3所述的一種生產丁醇的方法，其特征在于:步聚I)所述的平板培養(yǎng)基包含如下質量百分比的組分:碳源0.3%~1%、氮源0.5%~1%、無機鹽0.5%~0.8%、瓊脂1.5%~2%、其余為水；其中，碳源選自葡萄糖、淀粉、甘蔗渣酸解糖液、玉米芯酸解糖液中至少一種；氮源選自乙酸銨、氯化銨、蛋白胨、酵母粉、玉米漿中的至少一種；無機鹽選自鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、磷酸鹽、亞鐵鹽中的至少一種。
5.根據(jù)權利要求3 所述的一種生產丁醇的方法，其特征在于:步聚2)所述的種子培養(yǎng)基包含如下質量百分比的組分:碳源0.5%~1%、氮源0.5%~1%、無機鹽0.5%~0.8%、其余為水；其中，碳源選自淀粉、葡萄糖中至少一種；氮源選自乙酸銨、氯化銨、蛋白胨、酵母粉、玉米漿中至少一種；無機鹽選自鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、磷酸鹽、亞鐵鹽中至少一種。
6.根據(jù)權利要求3所述的一種生產丁醇的方法，其特征在于:步聚3)所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包含如下質量百分比的組分:碳源3%~6%、氮源0.1%~0.3%、無機鹽0.1%~0.2%、生長因子0.05%~0.1%、其余為水；其中，碳源選自葡萄糖、木糖、甘蔗渣酸解糖液、玉米芯酸解糖液中至少一種；氮源選自乙酸銨、氯化銨、酵母粉中至少一種；無機鹽選自鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽、磷酸鹽、亞鐵鹽中至少一種；生長因子選自對氨基苯甲酸、維生素B1、生物素和玉米漿中至少一種。
【文檔編號】C12P7/16GK103898010SQ201410086648
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年3月10日 優(yōu)先權日:2014年3月10日
【發(fā)明者】郭亭, 張九花, 梁達奉, 蟻細苗, 柳穎, 常國煒, 曾練強, 李雨虹 申請人:廣州甘蔗糖業(yè)研究所