一種基于lamp技術(shù)快速檢測(cè)多菌靈高抗核盤菌菌株的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速檢測(cè)多菌靈高抗核盤菌菌株的方法，可用于田間核盤菌對(duì)多菌靈抗性群體的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)及流行預(yù)警。本發(fā)明是以環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)為基礎(chǔ)建立起來(lái)的一種快速檢測(cè)核盤菌對(duì)多菌靈高抗菌株的分子技術(shù)。該檢測(cè)方法通過(guò)在多菌靈高抗核盤菌菌株的β-微管蛋白上(包括198位氨基酸突變位點(diǎn))設(shè)計(jì)2對(duì)LAMP特異性引物，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增；根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)物顏色判定是否為多菌靈高抗核盤菌菌株；如果顏色為天藍(lán)色(有擴(kuò)增產(chǎn)物)為多菌靈高抗核盤菌菌株；如果顏色為紫色(無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物)則為多菌靈敏感核盤菌菌株。本發(fā)明簡(jiǎn)便、快速、成本低，對(duì)菌核病抗性監(jiān)測(cè)及合理用藥具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
【專利說(shuō)明】—種基于LAMP技術(shù)快速檢測(cè)多菌靈高抗核盤菌菌株的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明是基于環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermalamplification, LAMP)對(duì)多菌靈高抗核盤菌菌株的快速分子檢測(cè),可用于核盤菌對(duì)多菌靈抗性群體發(fā)展的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)與抗性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，進(jìn)行抗藥性油菜菌核病的流行預(yù)警，為油菜菌核病的防治提供用藥指導(dǎo)。
【背景技術(shù)】
[0002]環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)(LAMP)是2000年由日本學(xué)者Notomi等發(fā)明的一種新穎的恒溫核酸體外擴(kuò)增技術(shù)，廣泛應(yīng)用于動(dòng)物、植物等疾病的基因診斷。該技術(shù)原理是:利用一套(4種)特異性引物，在一種高活性鏈置換DNA聚合酶的作用下引起自循環(huán)鏈置換反應(yīng)，60~65 °C范圍60min內(nèi)，大量合成目標(biāo)DNA的同時(shí)伴隨有副產(chǎn)物——白色的焦磷酸鎂沉淀產(chǎn)生。羥基萘酚藍(lán)(HNB)是一種金屬離子指示劑，根據(jù)反應(yīng)液中鎂離子的變化而呈現(xiàn)出不同的顏色，陰性(沒(méi)有擴(kuò)增出產(chǎn)物)時(shí)為紫色，陽(yáng)性(有產(chǎn)物擴(kuò)增)時(shí)為天藍(lán)色。LAMP方法的最大特點(diǎn)就是實(shí)現(xiàn)恒溫?cái)U(kuò)增，不需要循環(huán)儀等昂貴的儀器；擴(kuò)增反應(yīng)極快，一般在I小時(shí)內(nèi)完成；擴(kuò)增產(chǎn)生的產(chǎn)物量大，通過(guò)肉眼即可判定結(jié)果，不需要繁瑣的電泳過(guò)程；靈敏度高、特異性強(qiáng)；操作簡(jiǎn)便、快捷，極適于病原的快速診斷及檢測(cè)。
[0003]油菜菌核病是由核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)引起的一種分布較廣、破壞性較強(qiáng)的世界性病害。該病菌 寄主范圍非常廣泛，能侵染包括75科278屬408種及42個(gè)變種或亞種植物，給農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。多年來(lái)一直使用以多菌靈為主的苯并咪唑類殺菌劑防治油菜菌核病，據(jù)報(bào)道，油菜菌核病菌已對(duì)多菌靈產(chǎn)生抗性，且抗性菌株分布范圍逐年擴(kuò)大，抗性群體比例不斷上升，最終導(dǎo)致了多菌靈田間防效下降。經(jīng)過(guò)多年的研究，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物藥理學(xué)和病害防控實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)核盤菌對(duì)多菌靈的抗藥性菌株主要是由微管蛋白基因(SS1G_04652.3)第198或200位氨基酸密碼子突變?cè)斐?，?98位氨基酸密碼子GAG(Glu) — GCG(Ala)的突變對(duì)多菌靈表現(xiàn)為高抗，第200位氨基酸密碼子TTC(Phe) — TAC(Tyr)的突變對(duì)多菌靈表現(xiàn)為低抗。其中第198位突變類型占所有抗藥性突變類型總量的90%以上，成為病原菌產(chǎn)生田間抗藥性的主要原因。
[0004]病原菌在自然界的數(shù)量巨大，抗藥性個(gè)體在群體中的比例達(dá)到3%時(shí)，即可引起抗藥性病害流行，導(dǎo)致藥劑防治失敗。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法需要分離培養(yǎng)病原菌，然后用含藥培養(yǎng)基上培養(yǎng)，再根據(jù)藥劑對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制作用鑒別抗藥性。本發(fā)明在抗藥性機(jī)制研究的基礎(chǔ)上，基于LAMP技術(shù)快速、準(zhǔn)確檢測(cè)核盤菌對(duì)多菌靈的抗藥性。該檢測(cè)方法具有簡(jiǎn)單、快速、成本低，靈敏性高等特點(diǎn)，能顯著提高檢測(cè)效率，對(duì)菌核病的有效防治、抗藥性流行預(yù)警具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。然而，經(jīng)檢索目前國(guó)內(nèi)外尚未有核盤菌對(duì)多菌靈抗性菌株的LAMP快速分子檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]已報(bào)道的核盤菌對(duì)多菌靈抗性菌株的鑒定及檢測(cè)方法存在費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、成本高等缺點(diǎn)。針對(duì)這一缺點(diǎn)，根據(jù)核盤菌對(duì)多菌靈抗性菌株的基因型，通過(guò)實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化，建立了一種快速檢測(cè)多菌靈高抗核盤菌菌株的方法。該方法具有簡(jiǎn)便、快速、省時(shí)省力、靈敏度高等特點(diǎn)，對(duì)菌核病的合理用藥、控制病害發(fā)生與流行、減少經(jīng)濟(jì)損失具有實(shí)用價(jià)值。
[0006]田間檢測(cè)的多菌靈高抗核盤菌菌株的突變類型是由核盤菌微管蛋白基因編碼的第198位氨基酸密碼子突變?cè)斐傻?。本發(fā)明所述的快速檢測(cè)多菌靈高抗核盤菌菌株的分子生物學(xué)方法，步驟是:
[0007](I)在多菌靈高抗核盤菌菌株的微管蛋白基因上(包括198位氨基酸的序列)設(shè)計(jì)I對(duì)外引物和I對(duì)內(nèi)引物，利用該引物在恒溫條件下，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增；
[0008]①LAMP反應(yīng)所用的外引物對(duì):
【權(quán)利要求】
1.一種基于LAMP技術(shù)快速檢測(cè)多菌靈高抗核盤菌菌株的方法，步驟是: (1)運(yùn)用2對(duì)特異性引物對(duì)待鑒定菌株的基因組DNA進(jìn)行LAMP恒溫?cái)U(kuò)增，其中所述的2對(duì)特異性引物的堿基序列分別是: LAMP反應(yīng)所用的外引物對(duì):
F3: TCGCCAAAGGTTTCCGATAC
B3:ACCAGGGAAACGGAGACAG LAMP反應(yīng)所用的內(nèi)引物對(duì)(含人為引入錯(cuò)配堿基):
FIP:GGCGTCAGAGTTCTCGACCAACGTCGTCGAGCCATATAACG BIP CGTCAGAGTTCTCGACCAACGTCGTCGAGCCATATAACG (2)對(duì)上述LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物觀察其顏色變化，并在3.0 %瓊脂糖凝膠電泳上分離，觀察擴(kuò)增結(jié)果； (3)鑒定是否為多菌靈高抗核盤菌菌株:如果LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物顯示天藍(lán)色，這時(shí)電泳圖譜應(yīng)為梯狀條帶，判定為多菌靈高抗核盤菌菌株；如果擴(kuò)增產(chǎn)物為紫色，這時(shí)電泳圖譜無(wú)條帶擴(kuò)增，判定為多菌靈敏感核盤菌菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述快速檢測(cè)多菌靈高抗核盤菌菌株的方法，其特征在于:步驟(1)所述的LAMP反應(yīng)體系及條件分別是: 反應(yīng)體系(10 μ L):5對(duì) DNA 聚合酶(8U/A)0.4 pLIOxThermoPol1.0 μ?MgCl2 (25mM)1.6 μ?^dNTP (IOmM)1.0 pLFIP (40 μΜ)0.4 pLBIP (40 μΜ)0.4 μ?F3 (10μΜ)0.2 μ?Β3 (10μΜ)0.2 μ?甜菜堿(8 Μ)1.2 uLHNB (2.5 mM)0.6 μΕ基因組DNA0.4 μL(IH2O (滅菌蒸饋水)2.6 pL 反應(yīng)條件:
63°C 60min,80°C IOmin0
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK103820563SQ201410089651
【公開日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2014年3月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月12日
【發(fā)明者】周明國(guó), 段亞冰, 葛常艷, 張曉柯 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)