專利名稱：一種快速檢測(cè)人白細(xì)胞抗原b27的方法及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬臨床醫(yī)學(xué)生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速人白細(xì)胞抗原 B27 (HLA-B27)的試劑盒及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
在組織或器官移植中，供者與受者之間相容(不排斥)還是不相容(排斥)都是由它們組織特異性所決定的。這種代表個(gè)體特異性的組織抗原稱組織相容性抗原，一套這樣的抗原系統(tǒng)稱主要組織相容性系統(tǒng)(major histocompatibility system, MHS)。編碼MHS 的基因群稱為主要組織相容性復(fù)合體MHC即指某一染色體上一群緊密連鎖的基因群。人的MHC就稱人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)，HLA作為抗原研究時(shí)，稱HLA抗原系統(tǒng)；HLA作為基因研究時(shí)稱HLA復(fù)合體，它位于第6號(hào)染色體短臂上 6p21. 3，全長(zhǎng)40001Λ。它是為200個(gè)以上基因座位組成的基因復(fù)合體；是迄今已知基因中等位基因多態(tài)性最高的基因復(fù)合體；其多態(tài)性與疾病的遺傳易感性有明顯關(guān)系。HLA有I類、 II類和III類基因，HLA-B是I類HLA的三個(gè)位點(diǎn)(HLA-A、HLA-B, HLA-C)之一。HLA-B27是位于人第6號(hào)染色體HLA基因B座位的一個(gè)等位基因。強(qiáng)直性脊柱炎 (ankylosing spondylitis, AS)患者HLA-B27陽(yáng)性率高達(dá)94%，而正常人群僅為9%。對(duì)疑似AS患者進(jìn)行HLA-B27檢測(cè)，已成為臨床重要的輔助診斷手段。目前HLA-B27檢測(cè)手段主要有血清學(xué)方法如微量淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)(CDC)、流式細(xì)胞儀檢測(cè)、ELISA法、引物特異性聚合酶鏈反應(yīng)(SSP-PCR)等。傳統(tǒng)的血清學(xué)方法，由于很難獲得高質(zhì)量單價(jià)抗血清，單份血清很容易漏檢或出現(xiàn)假陽(yáng)性，而采用多份血清又常常會(huì)遇到部分血清陽(yáng)性時(shí)難以判斷結(jié)果的現(xiàn)象。ELISA法操作繁瑣，費(fèi)時(shí)，不利于大批量臨床標(biāo)本檢測(cè)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)具有較高的靈敏度和特異性，但需要配置流式細(xì)胞儀，硬件需求高，且檢測(cè)結(jié)果受標(biāo)本的質(zhì)量、抗體的效價(jià)影響，容易產(chǎn)生假陽(yáng)性或假陰性。SSP-PCR靈敏度和特異性均較好，但產(chǎn)物需電泳，操作繁瑣，且也有一定的假陽(yáng)性或假陰性。實(shí)時(shí)焚光定量 PCR 技術(shù)(Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction 簡(jiǎn)稱Real Time PCR)是在定性PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的核酸定量技術(shù)，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品中的DNA(or cDNA)的起始濃度進(jìn)行定量的方法，分染料法和探針?lè)▋深悪z測(cè)方法。 探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光定量PCR在特異性引物的基礎(chǔ)上加入了一條與目的基因特異性匹配的探針(帶有熒光基團(tuán))，能顯著提高檢測(cè)的特異性，是目前確定樣品中DNA(或cDNA)拷貝數(shù)最敏感、最準(zhǔn)確的方法。該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)DNA/RNA模板的定量，而且具有靈敏度和特異性高、能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)、自動(dòng)化程度高、無(wú)污染、實(shí)時(shí)和準(zhǔn)確等特點(diǎn)，該技術(shù)在醫(yī)學(xué)臨床檢驗(yàn)及臨床醫(yī)學(xué)研究方面有著重要的意義。目前已有多種運(yùn)用探針?lè)ǘ縋CR技術(shù)的試劑盒應(yīng)用于臨床疾病相關(guān)的病原體檢測(cè)、基因分型、突變研究等。本試劑盒通過(guò)設(shè)計(jì)與HLA-B27基因完全匹配的1對(duì)特異性引物和1條Taqman水解熒光探針，用于快速準(zhǔn)確的檢測(cè)HLA-B27基因。該方法相比目前應(yīng)用于臨床的其它方法，具有特異性強(qiáng)、敏感性高、省時(shí)、省力、成本低廉及高通量等優(yōu)點(diǎn)，可快速準(zhǔn)確的檢測(cè)患者 HLA-B27基因陰陽(yáng)性，用于臨床強(qiáng)直性脊柱炎、Reiter綜合癥、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎伴關(guān)節(jié)病、急性前葡萄膜炎等許多嚴(yán)重危害人類健康的脊柱性關(guān)節(jié)病的輔助診斷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種HLA-B27快速檢測(cè)的試劑盒。本發(fā)明還要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供上述試劑盒的檢測(cè)方法。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種HLA-B27快速檢測(cè)的試劑盒，它包括(1) 1對(duì)擴(kuò)增HLA-B27的特異性引物，其特征在于如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2 所示引物對(duì)；條HLA-B27特異性熒光探針，其特征在于如SEQ ID NO :3所示核苷酸序列， 在其5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，在其3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)TAMRA ；在一次檢測(cè)中共同使用。上述HLA-B27快速檢測(cè)的試劑盒，具體包括如下試劑(I)DNA 提取液 A :0. 32M 蔗糖，IOmM Tris-HCl pH 7. 5,5mM MgCl2,0. 1 % (ν/ν) Triton X-100，室溫保存；(2) DNA 提取液 B:30mM Tricine pH 8.5，210mM 辛酸鈉，2. 5 % (m/v) Chelex-100，_20°C保存；(3)PCR反應(yīng)液0. 2 μ M引物對(duì)SEQ ID NO 1 和 2，0. 04 μ M熒光探針SEQ ID NO :3， 30mM Tricine pH 8. 9,0. 05% (v/v)Tween-20,0. 01% (m/v)明膠，0· 03% (m/v)BSA,6. 5mM MgCl2, _20°C保存；(4) 5U/ μ ITaq DNA 聚合酶，_20°C保存；(5)陽(yáng)性對(duì)照品 IOOng/ μ 1,-20 V保存；(6)陰性對(duì)照品 IOOng/ μ 1,-20 V保存。一種HLA-B27快速檢測(cè)的試劑盒，它包括上述的所有核苷酸序列的堿基互補(bǔ)序列，也就是包括(1) 1對(duì)擴(kuò)增HLA-B27的特異性引物，其特征在于如SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5 所示引物對(duì)；條HLA-B27特異性熒光探針，其特征在于如SEQ ID NO :6所示核苷酸序列， 在其5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，在其3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)TAMRA ；在一次檢測(cè)中共同使用。上述HLA-B27快速檢測(cè)的試劑盒，具體包括如下試劑(I)DNA 提取液 A :0. 32Μ 蔗糖，IOmM Tris-HCl pH 7. 5,5mM MgCl2,0. 1 % (ν/ν) Triton X-100，室溫保存；(2) DNA 提取液 B :30mM Tricine pH 8.5，210mM 辛酸鈉，2. 5 % (m/v) Chelex-100，_20°C保存；(3) PCR 反應(yīng)液0. 2μ M引物對(duì) SEQ ID NO :4 和 5，0. 04 μ M 熒光探針 SEQ IDNO :6， 30mM Tricine pH 8. 9,0. 05% (v/v)Tween-20,0. 01% (m/v)明膠，0· 03% (m/v)BSA,6. 5mMMgCl2, _20°C保存；(4) 5U/ μ ITaq DNA 聚合酶，_20°C保存；(5)陽(yáng)性對(duì)照品 IOOng/ μ 1,-20 V保存；
(6)陰性對(duì)照品 IOOng/ μ 1,-20 V保存。上述HLA-B27快速檢測(cè)的檢測(cè)方法包括如下步驟(1)提取外周血人基因組DNA ；(2)以步驟⑴所得DNA為模板，利用特異性引物和熒光探針進(jìn)行HLA-B27的檢測(cè)；(3)參考陰陽(yáng)性對(duì)照品，得出臨床標(biāo)本HLA-B27結(jié)果。步驟⑵中所述的熒光定量PCR檢測(cè)體系為PCR反應(yīng)液(0.2μΜ引物對(duì)SEQ IDNO I^PSEQ ID NO :2，0. 04μ M熒光探針SEQ ID NO :3,30mM Tricine pH 8. 9,0. 05% (ν/ ν) Tween-20,0. 01% (m/v)明膠，0.03% (m/v)BSA,6. 5mM MgCl2) 22. 7 μ 1, Taq DNA 聚合酶 (5U/ μ 1) 0. 3 μ 1，DNA 模板 2 μ 1 ；PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?MV 3 分鐘，94°C 20 秒，61°C 40 秒，40 個(gè)循環(huán)。熒光采集點(diǎn)在ere，檢測(cè)模式設(shè)置為單色雜交探針，反應(yīng)體積設(shè)置為25?；蛘邔?SEQ ID NO :4 替換上述 SEQ ID N0:lJfSEQ ID NO 5 替換上述 SEQ ID NO :2，同時(shí)將 SEQ ID NO :6替換上述SEQ ID NO :3，其它條件相同。有益效果本試劑盒運(yùn)用1對(duì)HLA-B27特異性引物和1條特異性熒光探針能快速準(zhǔn)確的檢測(cè)人外周血等樣本中的HLA-B27基因，具有特異性強(qiáng)、敏感性高、省時(shí)、省力、成本低廉和高通量等優(yōu)點(diǎn)，可用于臨床強(qiáng)直性脊柱炎、Reiter綜合癥、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎伴關(guān)節(jié)病、急性前葡萄膜炎等許多嚴(yán)重危害人類健康的脊柱性關(guān)節(jié)病的輔助診斷。


圖1為陽(yáng)性對(duì)照品檢測(cè)結(jié)果圖，Ct值為23. 67，。圖2為陰性對(duì)照品檢測(cè)結(jié)果圖，Ct值為大于40。圖3為1例患者HLA-B27基因檢測(cè)結(jié)果圖，陽(yáng)性對(duì)照品Ct值為23. 67，陰性對(duì)照品 Ct值為大于40，體系合格；患者標(biāo)本號(hào)“sample 50”，Ct值為22. 74，結(jié)果為HLA-B27基因陽(yáng)性。圖4為1例患者HLA-B27基因檢測(cè)結(jié)果圖，陽(yáng)性對(duì)照品Ct值為23. 67，陰性對(duì)照品 Ct值為大于40，體系合格；患者標(biāo)本號(hào)“sample 55”，Ct值為大于40，結(jié)果為HLA-B27基因陰性。圖中英文字母對(duì)應(yīng)的中文名稱為cycles 循環(huán)數(shù)；Fluorescence 熒光值； mplification Curves 擴(kuò)增曲線；select 選擇；Zoom 放.大。
具體實(shí)施例方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。實(shí)施例1 檢測(cè)HLA-B27的引物和探針序列。委托上海英駿生物技術(shù)有限公司合成SEQ ID NO 1 5' -GGGTCTCACACCCTCCAGAAT-3‘
SEQ ID NO 2 5' -CGGCGGTCCAGGAGCT-3‘SEQ ID NO 3 5' -FAM-CGTTCAGGGCGATGTAATCCTTGC-TAMRA-3‘SEQ ID NO 4 5' -ATTCTGGAGGGTGTGAGACCC-3‘SEQ ID NO 5 5' -AGCTCCTGGACCGCCG-3‘SEQ ID NO 6 5' -FAM-GCAAGGATTACATCGCCCTGAACG-TAMRA-3‘實(shí)施例2 試劑盒的制備方法。(I)DNA 提取液 A 0. 32M 蔗糖(購(gòu)于美國(guó) Sigma 公司)，IOmM Tris-HCl pH 7. 5 (購(gòu)于美國(guó) Sigma 公司)，5mM MgCl2 (購(gòu)于美國(guó) Sigma 公司)，0· (v/v) Triton X-100 (購(gòu)于美國(guó) Sigma 公司)；O) DNA 提取液 B:30mM Tricine pH 8. 5 (購(gòu)于美國(guó)Sigma公司)，210mM辛酸鈉(購(gòu)于美國(guó)Sigma公司)，2. 5% (m/v) Chelex-IOO (購(gòu)于美國(guó) Bio-rad 公司)；(3) PCR 反應(yīng)液0. 2μΜ 引物對(duì) SEQ ID Ν0:1 禾口 2(或 SEQ ID NO :4 和 5)，0. 04 μ M 熒光探針 SEQ ID Ν0:3(或 SEQ ID NO 6) ,30mM pH 8. 9Tricine (購(gòu)于美國(guó) Sigma 公司)，0. 05% (ν/ν) Tween-20(購(gòu)于美國(guó)Sigma公司)，0·01% (m/v)明膠(購(gòu)于美國(guó)Sigma公司)，0· 03% (m/ ν) BSA (購(gòu)于美國(guó)Sigma公司)，6. 5mM MgCl2 (購(gòu)于美國(guó)Sigma公司)；(4) 5U/ μ ITaq DNA 聚合酶(購(gòu)于美國(guó)！^ermentas 公司)，_20°C保存；(5)陽(yáng)性對(duì)照品IOOng/ μ 1，HLA-B27陽(yáng)性患者外周血提取DNA后定量；(6)陰性對(duì)照品IOOng/ μ 1，HLA-B27陰性患者外周血提取DNA后定量。實(shí)施例3 檢測(cè)方法。儀器RocheLightCyclery 480熒光定量 PCR檢測(cè)儀，BECKMAN Microfuge 2 臺(tái)式微量冷凍離心機(jī)，太倉(cāng)華利達(dá)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備公司W(wǎng)H-866型渦旋振蕩器。(1)提取外周血人基因組DNA，具體包括如下步驟(Ia)用無(wú)菌注射針頭采3ml靜脈血于含EDTA-K2的密閉無(wú)菌玻璃管中，輕輕混勻， 3000rpm離心5min，吸取300ul中間的白細(xì)胞層及Iml DNA提取液A加到1. 5ml離心管中， 混合均勻，于室溫下孵育3-lOmin (在此期間翻轉(zhuǎn)離心管10次)，讓其紅細(xì)胞破壞，液體呈透明。(lb) 13000rpm離心30s，小心吸棄上清液，留下可見(jiàn)的白細(xì)胞沉淀層。加入 500ulDNA提取液A，顛倒混勻10次。(Ic) 13000rpm離心30s，小心吸棄上清液及殘留的血紅蛋白，留下可見(jiàn)的白細(xì)胞沉淀層，加入500ul生理鹽水，顛倒混勻10次。(ld) 13000rpm離心30s，小心吸棄上清液及殘留的血紅蛋白，留下的白細(xì)胞沉淀中加入50ul DNA提取液B，2400rpm渦旋震蕩1 混勻。(Ie) 100°C煮沸IOmin, 13，OOOrpm離心5min，上清作為PCR反應(yīng)模板備用。(2)以步驟(1)所得基因組DNA為模板，利用1對(duì)特異性引物和1條特異性熒光探針進(jìn)行HLA-B27 基因的熒光檢測(cè)，具體包括如下步驟；(2a)試劑配制從-20°C冰箱取出HLA-B27PCR反應(yīng)液，室溫融化，放冰盒上備用。 加樣前10分鐘之內(nèi)，按比例(HLA-B27PCR反應(yīng)液22. 7ul/人份+Taq酶0. 3ul/人份)取PCR
7反應(yīng)液和Taq酶，振蕩混勻后，2000rpm離心5秒，按2!3ul/人份分裝到PCR反應(yīng)管中(反應(yīng)管要求放冰上)，傳至樣本制備區(qū)備用。(2b)加樣向準(zhǔn)備好試劑的反應(yīng)管中，分別加入處理后的樣本模板2ul(若樣本裂解產(chǎn)物保存在_20°C，使用前置室溫解凍，以13，OOOrpm離心5min)，陰陽(yáng)性對(duì)照品直接加入 2ul，加樣過(guò)程要求冰上操作。貼好封口膜或蓋好管蓋，3000rpm離心30秒，放入儀器進(jìn)樣槽。(2c) PCR擴(kuò)增Roche LightCyclery 480熒光定量PCR儀進(jìn)行 HLA-B27 基因檢測(cè)，程序設(shè)計(jì)如下94°C 3分鐘，94°C 20秒一61°C 40秒一40個(gè)循環(huán)。熒光采集點(diǎn)在61°C，檢測(cè)模式設(shè)置為單色雜交探針，反應(yīng)體積設(shè)置為25。保存文件，運(yùn)行。Qd)結(jié)果分析，具體包括如下步驟Roche LightCyclery 480熒光PCR檢測(cè)儀點(diǎn)擊分析，選取定量模式，進(jìn)入分析窗
口，選定噪音線項(xiàng)，閾值設(shè)定為剛好超過(guò)正常陰性對(duì)照品擴(kuò)增曲線(無(wú)規(guī)則的噪音線)的最高點(diǎn)(可根據(jù)實(shí)際情況適當(dāng)調(diào)整)，且陽(yáng)性曲線無(wú)拐點(diǎn)，保證噪音線項(xiàng)下的數(shù)值和分析項(xiàng)下的域值一致。點(diǎn)擊計(jì)算，自動(dòng)計(jì)算得到每個(gè)測(cè)試的CT值。(2e)陰陽(yáng)性對(duì)照品結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)及處理，具體按照如下步驟判定陰性對(duì)照品PCR擴(kuò)增的Ct值應(yīng)無(wú)數(shù)值且增長(zhǎng)曲線不規(guī)則；陽(yáng)性對(duì)照品PCR擴(kuò)增增長(zhǎng)曲線呈S型曲線且CT值小于35。(3)步驟(2)所得的臨床樣本HLA-B27基因檢測(cè)結(jié)果判斷，具體按照如下標(biāo)準(zhǔn)(3a)如果增長(zhǎng)曲線不呈S型曲線或Ct值為空白，則判樣本HLA-B27為陰性。(3b)如果增長(zhǎng)曲線呈S型曲線且Ct值<40，則按以下方法判斷若樣本的CT < 30，則判樣本HLA-B27為陽(yáng)性；檢測(cè)樣本Ct ^ 30，重新提取樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增。提取時(shí)要注意白細(xì)胞沉淀是否夠多(要能肉眼看見(jiàn)離心管底白色塊狀沉淀)，復(fù)查結(jié)果如果增長(zhǎng)曲線不呈S型曲線或Ct值為空白，則判樣本HLA-B27為陰性。如果增長(zhǎng)曲線呈S型曲線判樣本HLA-B27為陽(yáng)性。將本發(fā)明所述的試劑盒及方法用于96例臨床疑似AS患者HLA-B27基因快速檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)合SSP-PCR進(jìn)行比對(duì)，檢測(cè)結(jié)果如下表
權(quán)利要求
1.一種快速檢測(cè)人白細(xì)胞抗原B27的試劑盒，其特征在于它包括(1) 1對(duì)擴(kuò)增HLA-B27的特異性引物，其特征在于如SEQ ID NO :1禾口 SEQ ID NO 2所示引物對(duì)；條HLA-B27特異性熒光探針，其特征在于如SEQ ID NO :3所示核苷酸序列，在其 5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，在其3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)TAMRA ；(1)所述的引物對(duì)和( 所述的特異性熒光探針在一次檢測(cè)中共同使用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)人白細(xì)胞抗原B27的試劑盒，其特征在于它包括如下試劑(1)DNA提取液 A :0. 32M 蔗糖，IOmM Tris-HCl pH 7. 5,5mM MgCl2,0. 1% (v/v) Triton X-IOO，室溫保存；(2)0嫩提取液8:301111Tricine pH 8. 5，210mM辛酸鈉，2. 5% (m/v) Chelex-100,-20°C 保存；(3)PCR 反應(yīng)液0. 2μ M 引物對(duì) SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO :2，0. 04 μ M 熒光探針 SEQ ID NO :3,30mM Tricine pH 8. 9,0. 05% (v/v)Tween-20,0. 01% (m/v)明膠，0· 03% (m/v) BSA，6. 5mM MgCl2, _20°C保存；(4)5U/ μ ITaq DNA 聚合酶，_20°C保存；(5)陽(yáng)性對(duì)照品IOOng/μ1, _20°C保存；(6)陰性對(duì)照品IOOng/μ1, -20°C保存。
3.一種快速檢測(cè)人白細(xì)胞抗原B27的試劑盒，其特征在于它包括權(quán)利要求1所述的所有核苷酸序列的堿基互補(bǔ)序列，也就是包括(1) 1對(duì)擴(kuò)增HLA-B27的特異性引物，其特征在于如SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5所示引物對(duì)；條HLA-B27特異性熒光探針，其特征在于如SEQ ID NO :6所示核苷酸序列，在其 5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，在其3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)TAMRA ；(1)所述的引物對(duì)和( 所述的特異性熒光探針在一次檢測(cè)中共同使用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的快速檢測(cè)人白細(xì)胞抗原B27的試劑盒，其特征在于它包括如下試劑(1)DNA提取液 A :0. 32M 蔗糖，IOmM Tris-HCl pH 7. 5,5mM MgCl2,0. 1% (v/v) Triton X-IOO，室溫保存；(2)0嫩提取液8:301111Tricine pH 8. 5，210mM辛酸鈉，2. 5% (m/v) Chelex-100,-20°C 保存；(3)PCR 反應(yīng)液0. 2μ M 引物對(duì) SEQ ID NO 4 禾口 SEQ ID NO :5，0. 04 μ M 熒光探針 SEQ ID NO :6,30mM Tricine pH 8. 9,0. 05% (v/v)Tween-20,0. 01% (m/v)明膠，0· 03% (m/v) BSA，6. 5mM MgCl2, _20°C保存；(4)5U/ μ ITaq DNA 聚合酶，_20°C保存；(5)陽(yáng)性對(duì)照品IOOng/μ1, _20°C保存；(6)陰性對(duì)照品IOOng/μ1, -20°C保存。
5.一種快速檢測(cè)人白細(xì)胞抗原B27的方法，其特征在于它包括如下步驟(1)提取外周血人基因組DNA;(2)以步驟⑴所得DNA為模板，利用特異性引物和熒光探針進(jìn)行HLA-B27的熒光定量 PCR檢測(cè)；(3)參考陰陽(yáng)性對(duì)照品，得出臨床標(biāo)本HLA-B27結(jié)果。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的快速檢測(cè)人白細(xì)胞抗原B27的方法，其特征在于步驟(2)中所述的熒光定量PCR檢測(cè)的檢測(cè)體系為PCR 反應(yīng)液 22. 7μ1 :0. 2μ M 引物對(duì) SEQ ID NO :1 禾口 SEQ ID NO :2，0. 04 μ M 熒光探針 SEQ ID NO :3,30mM Tricine pH 8. 9,0. 05% v/v Tween-20，0· 01 % m/v 明膠，0· 03% m/v BSA，6. 5mM MgCl2,5U/ μ 1 的 Taq DNA 聚合酶 0. 3 μ 1，DNA 模板 2 μ 1 ；PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C 3分鐘，94°C 20秒，61°C 40秒，40個(gè)循環(huán)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的快速檢測(cè)人白細(xì)胞抗原B27的方法，其特征在于步驟(2)中所述的熒光定量PCR檢測(cè)體系為PCR 反應(yīng)液 22. 7μ 1 :0. 2μ M 引物對(duì) SEQ ID NO 4 禾口 SEQ ID NO :5，0. 04 μ M 熒光探針 SEQ ID NO :6,30mM Tricine pH 8. 9,0. 05% v/v Tween-20，0· 01 % m/v 明膠，0· 03% m/v BSA，6. 5mM MgCl2,5U/ μ ITaq DNA 聚合酶 0· 3 μ 1，DNA 模板 2 μ 1 ；PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C 3分鐘，94°C 20秒，61°C 40秒，40個(gè)循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種快速檢測(cè)人白細(xì)胞抗原B27(HLA-B27)的方法及體外診斷試劑盒，屬于醫(yī)學(xué)生物技術(shù)領(lǐng)域。該試劑盒采用用一對(duì)HLA-B27特異性引物和一條特異性熒光探針快速檢測(cè)HLA-B27。本試劑盒運(yùn)用1對(duì)HLA-B27特異性引物和1條特異性熒光探針能快速準(zhǔn)確檢測(cè)人外周血等樣本中的HLA-B27基因，具有特異性強(qiáng)、敏感性高、省時(shí)、省力、成本低廉和高通量等優(yōu)點(diǎn)，可用于臨床強(qiáng)直性脊柱炎、Reiter綜合癥、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎伴關(guān)節(jié)病、急性前葡萄膜炎等許多嚴(yán)重危害人類健康的脊柱性關(guān)節(jié)病的輔助診斷。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102443625SQ20111027816
公開(kāi)日2012年5月9日 申請(qǐng)日期2011年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月19日
發(fā)明者商純爾, 張偉林 申請(qǐng)人:浙江夸克生物科技有限公司