一種大田馬鈴薯植株氮素營(yíng)養(yǎng)分子診斷方法及在施肥上的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種大田馬鈴薯植株氮素營(yíng)養(yǎng)分子診斷方法，具體以馬鈴薯植株氮素吸收相關(guān)基因硝酸還原酶基因(NR)作為衡量大田馬鈴薯植株氮素營(yíng)養(yǎng)狀況的分子標(biāo)記。診斷時(shí)以大田馬鈴薯植株的RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，進(jìn)行RealtimePCR檢測(cè)NR基因的表達(dá)量，根據(jù)NR基因的表達(dá)量，判斷大田馬鈴薯植株的氮素營(yíng)養(yǎng)狀況，進(jìn)而可以確定是否追施氮肥及其施用量。本診斷方法具有判斷準(zhǔn)確性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種大田馬鈴薯植株氮素營(yíng)養(yǎng)分子診斷方法及在施肥上的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于馬鈴薯的營(yíng)養(yǎng)與施肥管理【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種大田馬鈴薯植株氮素營(yíng)養(yǎng)的分子診斷方法，更具體地說(shuō)，采用Real time PCR的方法定量分析植株葉片硝酸還原酶NR基因的表達(dá)量，來(lái)判斷大田馬鈴薯植株的氮素營(yíng)養(yǎng)狀況，并確定是否需要施肥及具體的施肥量，為大田施氮管理提供指導(dǎo)。
【背景技術(shù)】
[0002]氮素是作物生長(zhǎng)發(fā)育不可缺少的營(yíng)養(yǎng)元素，它是植物體內(nèi)葉綠素、蛋白質(zhì)、核酸的組成部分，又是很多內(nèi)源激素的組成部分，占植物干重的1%~7%。葉綠素含量的高低，直接影響著光合作用的大小，并在一定的程度上反映了葉片含氮水平。氮肥管理對(duì)馬鈴薯種植效益和環(huán)境影響的起重要作用，而我國(guó)作物生產(chǎn)上普遍存在施氮水平過(guò)高，造成氮的浪費(fèi)和環(huán)境污染。氮肥供應(yīng)不足或過(guò)量，均會(huì)影響植物體內(nèi)的氮素代謝，從而破壞碳氮代謝平衡，降低作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。氮素供應(yīng)不足降低塊莖產(chǎn)量和大小，過(guò)多氮素供應(yīng)影響塊莖品質(zhì)如降低干物質(zhì)含量，硝酸鹽濃度增加，增加天冬酰胺積累，這會(huì)導(dǎo)致烹飪過(guò)程中形成丙烯酰胺。環(huán)境中的氮以硝酸鹽淋失和一氧化二氮排放方式流失。因此，最有效的方法是實(shí)現(xiàn)施氮與作物需氮的平衡，即根據(jù)作物的需要來(lái)施氮，但是在大田生產(chǎn)的情況下，要實(shí)現(xiàn)兩者的平衡存在很大的困難，因?yàn)椴煌攴荨⒉煌飰K之間的土壤供氮與作物需氮存在較大差異。目前常用的馬鈴薯氮素營(yíng)養(yǎng)診斷方法有植株外觀診斷、植株全氮診斷、土壤氮素測(cè)試、植株硝酸鹽快速 診斷和葉綠素含量測(cè)定等方法，其中最為常見(jiàn)的光學(xué)方法是用葉綠素儀(SPAD502)測(cè)定葉綠素的相對(duì)含量(SPAD值)，化學(xué)方法是硝態(tài)氮的含量，根據(jù)SPAD值和硝態(tài)氮的含量來(lái)評(píng)價(jià)植株氮素營(yíng)養(yǎng)狀況(Zebarth and Rosen，2007)，但是這些方法是間接測(cè)定方法，而且易受土壤中水分、養(yǎng)分等環(huán)境因素及馬鈴薯生育期的影響(Olfs et al.2005)。植物通過(guò)基因表達(dá)的變化響應(yīng)逆境脅迫(Hazen et al.，2003)，因此，基因定量表達(dá)可以提供一種衡量植株氮素充足與否更直接的措施。
[0003]當(dāng)土壤中供氮充足時(shí)，硝態(tài)氮作為非代謝物質(zhì)以一種半儲(chǔ)備狀態(tài)存在于植物液泡內(nèi)，因此植物體內(nèi)的硝態(tài)氮包括液泡中儲(chǔ)備的硝態(tài)氮(儲(chǔ)存庫(kù))和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的硝態(tài)氮(代謝庫(kù))，當(dāng)植物需氮增加或缺氮時(shí)，硝酸還原酶的活性增強(qiáng)，利用植物液泡中儲(chǔ)備的硝態(tài)氮，硝酸還原酶的活性與植物液泡中儲(chǔ)備的硝態(tài)氮存在對(duì)應(yīng)關(guān)系，硝酸還原酶的活性和液泡中儲(chǔ)備的硝態(tài)氮比植株硝態(tài)氮的含量更直接和靈敏地反映作物對(duì)氮的需求，而液泡中儲(chǔ)備的硝態(tài)氮很難單獨(dú)測(cè)定，因此，可以用硝酸還原酶的活性或硝酸還原酶基因的表達(dá)水平代替全氮、硝態(tài)氮作為氮素營(yíng)養(yǎng)診斷指標(biāo)，來(lái)更準(zhǔn)確地估計(jì)植株氮素營(yíng)養(yǎng)狀況。Li等通過(guò)水培方法發(fā)現(xiàn)在缺氮情況下3天內(nèi)馬鈴薯試管苗硝酸還原酶和亞硝酸還原酶基因表達(dá)下調(diào)，但是在人工溫室條件下，采用營(yíng)養(yǎng)液，氮為硝態(tài)氮，設(shè)置的氮濃度梯度較少(氮濃度突然減少或大幅減少，充足(7.5 mM NO3-),有限(0.75 mM NO3O，和缺氮(O mM NO3O，采用的植株為瘦弱的試管苗(株高8-lOcm，莖粗2-3mm)，僅進(jìn)行短時(shí)間(7天)的培養(yǎng)，沒(méi)有涉及馬鈴薯塊莖的形成、膨大，更沒(méi)有涉及到產(chǎn)量，需要的氮少，而馬鈴薯生產(chǎn)是在田間進(jìn)行，采用的是種薯切塊種植，植株健壯(株高50-70cm，莖粗10-15mm)，土壤中本身含有一定濃度的氮素，種薯上含有一定的營(yíng)養(yǎng)供植株生長(zhǎng)前期吸收，田間施用的氮為尿素或者復(fù)合肥，不同于水培的硝態(tài)氮，施肥水平采用的不是摩爾濃度，而是單位面積施肥量(我國(guó)南方馬鈴薯普遍采用的是畝施15kg純N)，種植的時(shí)間為一個(gè)較長(zhǎng)的生長(zhǎng)季，在80天以上，包括馬鈴薯出苗期、苗期、塊莖形成期、塊莖膨大期和塊莖成熟期等5個(gè)時(shí)期，涉及到產(chǎn)量的形成，需要大量的氮，所以大田環(huán)境下的馬鈴薯植株遠(yuǎn)比水培試管苗復(fù)雜，Li等的研究結(jié)果對(duì)大田馬鈴薯植株氮素 營(yíng)養(yǎng)診斷及施肥沒(méi)有任何借鑒意義。至今為止，還沒(méi)有以NR基因表達(dá)量作為衡量大田馬鈴薯植株氮素營(yíng)養(yǎng)狀況的研究報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是:針對(duì)現(xiàn)有間接測(cè)定方法的不足，提供一種高準(zhǔn)確率的M基因表達(dá)量作為衡量植株氮素營(yíng)養(yǎng)狀況的分子診斷方法。
[0005]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
一種大田馬鈴薯植株氮素營(yíng)養(yǎng)的分子診斷方法，是以馬鈴薯植株氮素吸收相關(guān)的硝酸還原酶基因NR的表達(dá)量作為診斷大田馬鈴薯植株氮素營(yíng)養(yǎng)狀況的分子標(biāo)記。
[0006]具體是包括Real time PCR在內(nèi)的方法檢測(cè)硝酸還原酶基因NR的表達(dá)，來(lái)診斷大田馬鈴薯植株氮素營(yíng)養(yǎng)狀況。
[0007]Real time PCR所用引物的序列如下:
正向引物:5’_ TGGACATATCTATGATGCCTCACG-3’ (SEQ ID N0.1),
反向引物:5’_ AGTTCACCAATCCTAAAGTCCTCCA-3’ (SEQ ID N0.2)。
[0008]管家基因?yàn)锳ctin
正向引物:5’_ AGGTCCTCTTCCAGCCATCCA-3’ (SEQ ID N0.3),
反向引物:5’_ CCACTGAGCACAATGTTACCGTAG -3’ (SEQ ID N0.4)。
[0009]本發(fā)明檢測(cè)方法具體包括以下步驟:
O馬鈴薯植株葉片RNA的獲得
田間取馬鈴薯植株頂端第一片完全展開(kāi)葉，通常是第四片葉，液氮處理并帶回實(shí)驗(yàn)室，采取trizol方法提取RNA ；
2)以步驟I)得到的RNA為模板，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA；
3)以步驟2)得到的cDNA為模板，進(jìn)行Realtime PCR擴(kuò)增；
4)以Actin基因?yàn)閮?nèi)參，通過(guò)分析、計(jì)算得出NR基因的相對(duì)表達(dá)量ACt。其中，ACt=CtNE-CtActin, Ctffl^PCtiktin分別表示硝酸還原酶基因NR和內(nèi)參基因肌動(dòng)蛋白基因Actin在Real time PCR擴(kuò)增過(guò)程中每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，而閾值是在擴(kuò)增曲線的指數(shù)增長(zhǎng)區(qū)域內(nèi)適當(dāng)位置上設(shè)定的熒光檢出界限，Ct值越大即擴(kuò)增所需的循環(huán)數(shù)越多，基因的表達(dá)量就越小，反之，基因的表達(dá)量越大；ACt值小于零，表示NR基因擴(kuò)增所需的循環(huán)數(shù)小于Actin基因，Actin基因的CtAc;tin比較穩(wěn)定，因此，Δ Ct值越小，NR基因的表達(dá)量越大，反之，表達(dá)量越小。
[0010]再根據(jù)擬合公式計(jì)算應(yīng)施氮肥的量，其中一個(gè)優(yōu)選的擬合公式為:N=-6.7891* Λ Ct2-37.622* Δ Ct-43.033，其中施氮量N的單位為純氮kg/667m2。[0011] 本發(fā)明通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)確定了施氮肥量的計(jì)算公式，將NR基因的表達(dá)量與施肥量進(jìn)行明確的量化，而能夠直接指導(dǎo)施氮量，具有實(shí)際意義。這在現(xiàn)有技術(shù)中尚未實(shí)現(xiàn)的，也是本發(fā)明突破的一個(gè)方面。
[0012]本發(fā)明用硝酸還原酶基因的表達(dá)水平代替全氮、硝態(tài)氮作為氮素營(yíng)養(yǎng)診斷指標(biāo)，來(lái)更準(zhǔn)確地估計(jì)植株氮素營(yíng)養(yǎng)狀況，確定施氮肥量。與目前常用的馬鈴薯氮素營(yíng)養(yǎng)診斷方法:植株外觀診斷、植株全氮診斷、土壤氮素測(cè)試、植株硝酸鹽快速診斷和葉綠素含量測(cè)定等間接測(cè)定方法相比，本發(fā)明方法不易受土壤中水分、養(yǎng)分等環(huán)境因素，以及馬鈴薯生育期的影響，更加準(zhǔn)確，操作更加方便快捷。
[0013]
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1 Real time PCR擴(kuò)增曲線，其中A為ActB基因；B為NR基因。
[0015]圖2 ACt與施氮量的擬合曲線。
[0016]圖3 SPAD與施氮量的擬合曲線。
[0017]
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地解釋?zhuān)唧w實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何限定。
[0019](I)試驗(yàn)設(shè)置7個(gè)施氮水平(0、3、6、9、12、18和24 kg/667m2) 7個(gè)處理，重復(fù)3次，小區(qū)面積24m2，隨機(jī)區(qū)組排列，其中9 kg/667m2為發(fā)達(dá)國(guó)家馬鈴薯生產(chǎn)上建議施氮水平。
[0020]所有小區(qū)于出苗后70天進(jìn)行收獲，測(cè)定和計(jì)算小區(qū)產(chǎn)量、單株結(jié)薯數(shù)等。
[0021]在馬鈴薯的塊莖膨大期，每小區(qū)隨機(jī)測(cè)定10株馬鈴薯植株第四片葉(完全展開(kāi)葉)的頂小葉SPAD值和凈光合速率，每小區(qū)隨機(jī)選取馬鈴薯植株第四片葉(完全展開(kāi)葉)的頂小葉10片，液氮保存帶回實(shí)驗(yàn)室，采用Trizol試劑盒提取總RNA，測(cè)定RNA濃度，各RNA樣品稀釋同一濃度0.2Pg/^l。
[0022](2)根據(jù)GenBank中馬鈴薯Actin與NR基因序列,用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物,覆蓋該基因部分編碼序列，NR基因(基因登錄號(hào)GenBank: U76701.1)引物序列為:
正向引物:5’_ TGGACATATCTATGATGCCTCACG-3’ (SEQ ID N0.1),
反向引物:5’_ AGTTCACCAATCCTAAAGTCCTCCA-3’ (SEQ ID N0.2)；
肌動(dòng)蛋白是真核生物細(xì)胞中普遍存在最保守的古老蛋白質(zhì)之一。在所有細(xì)胞中均有表達(dá)，其產(chǎn)物是對(duì)維持細(xì)胞基本生命活動(dòng)所必需的，基因表達(dá)水平受環(huán)境因素影響較小，在各生長(zhǎng)階段的大多數(shù)、或幾乎全部組織中持續(xù)表達(dá)，或變化很小，因而本發(fā)明采用肌動(dòng)蛋白基因作為內(nèi)參基因，以提聞準(zhǔn)確性和可罪性。
[0023]Actin基因引物序列如下:
正向引物:5’_ AGGTCCTCTTCCAGCCATCCA-3’ (SEQ ID N0.3),
反向引物:5’_ CCACTGAGCACAATGTTACCGTAG -3’ (SEQ ID N0.4)。
[0024]引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。[0025](3)用上述引物分別對(duì)提取的總RNA進(jìn)行real time RT-PCR擴(kuò)增。
[0026]第一步是反轉(zhuǎn)錄，
先配制RNA和反轉(zhuǎn)錄引物混合物(5μ 1):RNA 2μ1、[Oligo (dT) 15引物0.5 μ I(濃度為Ιθμ/M)、隨機(jī)引物(濃度為10μ/Μ) 0.5 μ 1、超純水補(bǔ)至5 μ I。混合物70°C變性5分鐘，4°C冷卻5分鐘；
隨后配置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液(5μ 1)，5X反應(yīng)緩沖液2 μ I, 25mM MgCl2溶液IylUOmMdNTPs 0.5 μ 1、RNA酶抑制劑0.25 μ 1、反轉(zhuǎn)錄酶0.5 μ 1、超純水補(bǔ)至5 μ I。
[0027]將5μ I反應(yīng)液加入到RNA/引物混合物中，混勻，42 °C延伸I小時(shí)，70°C變性15分鐘。
[0028]第二步熒光定量PCR
20 μ I 反應(yīng)體系:2X SYBR Green Real time-PCR mix 10 μ 1、模板(cDNA)2 μ 1、正向引物和反向引物各ι μ I (濃度為ιομ/Μ)、超純水補(bǔ)至所需體積。
[0029]PCR程序:95°C 2分鐘預(yù)變性后40個(gè)PCR循環(huán)參數(shù)為:95°C 5秒，60°C 30秒。
[0030]按照上述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行獲得試驗(yàn)數(shù)據(jù)，閾值與Ct值由熒光定量PCR儀自帶軟件自動(dòng)得出。NR基因的相對(duì)表達(dá)量Λ Ct=CtNK-CtArtin，Λ Ct值越小，NR基因的表達(dá)量越高，ACt值越大，NR基因的表達(dá)量越低。
[0031]其中:Λ Ct = CtNE-CtActin, CtNE和CtArtin分別表示硝酸還原酶基因NR和內(nèi)參基因肌動(dòng)蛋白基因Actin在Real time PCR擴(kuò)增過(guò)程中每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，而閾值是在擴(kuò)增曲線的指數(shù)增長(zhǎng)區(qū)域內(nèi)適當(dāng)位置上設(shè)定的熒光檢出界限，Ct值越大即擴(kuò)增所需的循環(huán)數(shù)越多，基因的表達(dá)量就越小，反之，基因的表達(dá)量越大；Δ Ct值小于零，表示NR基因擴(kuò)增所需的循環(huán)數(shù)小于Actin基因，Actin基因的Ctiktin比較穩(wěn)定，因此，ACt值越小，NR基因的表達(dá)量越大，反之，表達(dá)量越小。
[0032](4)根據(jù)各施氮處理NR基因的表達(dá)水平，通過(guò)建立擬合公式，可計(jì)算得出植株的氮素營(yíng)養(yǎng)狀況而需要添加氮肥的量，建立大田馬鈴薯植株氮素營(yíng)養(yǎng)分子診斷技術(shù)的量化。
[0033]試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1和表1，從表1中可以看出，隨著施氮水平的提高，葉綠素含量呈上升的趨勢(shì)；NR基因的ACt值隨施氮水平的提高而增加，NR基因的表達(dá)量隨施氮水平的提高降低。而馬鈴薯產(chǎn)量呈先上升后下降的趨勢(shì)，9 kg /667m2時(shí)產(chǎn)量最高，為1357.27 kg/667m2，但6-18 kg /667m2各處理產(chǎn)量差異不顯著。秋播馬鈴薯由于生長(zhǎng)季節(jié)短，溫度高，植株生長(zhǎng)和產(chǎn)量不及冬播馬鈴薯，因此，每畝需氮量較低，6 kg /667 m2就能滿足其生長(zhǎng)，并獲得1141.25 kg/667m2產(chǎn)量，不施氮或過(guò)低(3 kg /667m2)，植株生長(zhǎng)不良，葉綠素合成收到影響，葉色偏淡，產(chǎn)量顯著降低；施氮過(guò)高產(chǎn)量增加不顯著(12，18 kg /667m2)或顯著降低(24kg /667m2)，氮肥利用效率降低，造成浪費(fèi)。在生產(chǎn)中，隨著目標(biāo)產(chǎn)量提高，植株需氮量增加，土壤中供氮減少，需要追施氮肥。由于產(chǎn)量最高時(shí)的施氮水平和國(guó)外發(fā)達(dá)國(guó)家馬鈴薯生產(chǎn)建議的施氮水平均為9kg/667m2，根據(jù)表1中的ACt和施肥水平擬合曲線(見(jiàn)圖2)，得到追施氮的擬合方程I為N=-6.7891*ACt2-37.622* Δ Ct-43.033( R2=0.9895)，根據(jù)葉綠素含量SPAD值和施肥水平擬合曲線(見(jiàn)圖3)，得到追施氮的擬合方程2為N=-0.0887*SPAD2-5.7819*SPAD-85.518 (R2=0.9575)，可見(jiàn)ACt的擬合度R2大于SPAD的擬合度，說(shuō)明NR基因的表達(dá)更能直接反映植株氮素營(yíng)養(yǎng)狀況和土壤供氮狀況，根據(jù)擬合方程I和ACt值，求得施氮量N (純氮kg/667m2)，當(dāng)N大于零時(shí)，需追施氮肥，當(dāng)N小于零時(shí)，不用追施氮肥。因此，硝酸還原酶基因(NR)作為衡量馬鈴薯植株氮素營(yíng)養(yǎng)狀況的分子標(biāo)記，采取Real time PCR檢測(cè)植株氮素營(yíng)養(yǎng)具有判斷準(zhǔn)確性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。
[0034]表1不同施氮水平對(duì)秋馬鈴薯葉綠素含量、NR基因表達(dá)量及產(chǎn)量的影響
【權(quán)利要求】
1.一種大田馬鈴薯植株氮素營(yíng)養(yǎng)分子診斷方法，其特征在于，以馬鈴薯植株氮素吸收相關(guān)的硝酸還原酶基因NR的表達(dá)量來(lái)確定診斷大田馬鈴薯植株氮素營(yíng)養(yǎng)狀況。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大田馬鈴薯植株氮素營(yíng)養(yǎng)分子診斷方法，其特征在于，以肌動(dòng)蛋白基因Actin基因?yàn)閮?nèi)參，采用Real time PCR方法檢測(cè)硝酸還原酶基因NR的相對(duì)表達(dá)量，以判斷大田馬鈴薯植株氮素營(yíng)養(yǎng)狀況。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大田馬鈴薯植株氮素營(yíng)養(yǎng)的分子診斷方法，其特征在于，Real time PCR中用于擴(kuò)增NR基因的引物的序列為:正向引物如SEQ ID N0.1所示；反向引物如SEQ ID N0.2所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大田馬鈴薯植株氮素營(yíng)養(yǎng)的分子診斷方法，其特征在于，作為內(nèi)參基因的Actin基因的擴(kuò)增引物為:正向引物如SEQ ID N0.3所示；反向引物如SEQID N0.4 所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的大田馬鈴薯植株氮素營(yíng)養(yǎng)的分子診斷方法，其特征在于包括如下步驟: 1)馬鈴薯植株葉 片RNA的獲得:田間取馬鈴薯植株頂端第一片完全展開(kāi)葉，通常是第四片葉，液氮處理并帶回實(shí)驗(yàn)室，采取trizol方法提取RNA ; 2)以步驟I)得到的RNA為模板，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA； 3)以步驟2)得到的cDNA為模板，進(jìn)行Realtime PCR擴(kuò)增； 4)通過(guò)分析、計(jì)算得出NR基因的相對(duì)表達(dá)量，根據(jù)擬合公式計(jì)算施氮量。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述分子診斷方法在大田馬鈴薯植株施用氮肥中的應(yīng)用，其特征在于， 第一步，根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的大田馬鈴薯植株氮素營(yíng)養(yǎng)的分子診斷方法得到硝酸還原酶基因NR的相對(duì)表達(dá)量， 第二步，根據(jù)第一步所得到的表達(dá)量確定大田馬鈴薯植株氮素營(yíng)養(yǎng)狀況，并確定是否施用氮肥或其施肥量， 第三步，對(duì)所述大田馬鈴薯植株施用確定的氮肥。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的大田馬鈴薯植株氮肥的施肥方法，其特征在于， 第二步確定施氮量N按公式計(jì)算得到:N=-6.7891* Δ Ct2-37.622* Δ Ct-43.033 其中，施氮量N單位為純N kg/667m2，且當(dāng)N大于零時(shí)，需追施氮肥，當(dāng)N小于零時(shí)，不用追施氮肥；ACt = CtNK-CtArtin，CtNK和CtArtin分別表示硝酸還原酶基因NR和內(nèi)參基因肌動(dòng)蛋白基因Actin在Real time PCR擴(kuò)增過(guò)程中每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的大田馬鈴薯植株氮肥的施肥方法，其特征在于，施用確定的氮肥按下述擬合公式計(jì)算得到:N=-6.7891*ACt2-37.622* Δ Ct-43.033，其中施氮量N的單位為純氮kg/667m2。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103923978SQ201410094874
【公開(kāi)日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2014年3月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月14日
【發(fā)明者】胡新喜, 熊興耀, 劉明月, 馮燕青, 何長(zhǎng)征, 雷艷 申請(qǐng)人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)