專利名稱：：利用基因工程技術(shù)獲得高抗病毒馬鈴薯植株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及利用基因工程技術(shù)獲得高抗病毒馬鈴薯植株的方法。
背景技術(shù)：
：馬鈴薯是世界上產(chǎn)量僅次于小麥、玉米和水稻的第四大糧食作物，其單位面積單位時(shí)間的產(chǎn)量高于前三種作物。馬鈴薯糧菜兼用，營養(yǎng)豐富，聯(lián)合國充分肯定了馬鈴薯在確保世界糧食安全和消除貧困中起的重大作用，并確定2008年為"國際馬鈴薯年"。但病毒侵染一直是導(dǎo)致馬鈴薯品種退化的主要因素，嚴(yán)重影響馬鈴薯的產(chǎn)量和品質(zhì)。傳統(tǒng)的育種方式已經(jīng)不能滿足馬鈴薯生產(chǎn)的需要，不能從根本上長期解決馬鈴薯病毒害問題。近年來，隨著基因工程的迅速發(fā)展和轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系的日益完善，基因工程技術(shù)在提高馬鈴薯抗病性方面(尤其是抗病毒)顯示了極大的潛力，必將成為馬鈴薯抗病毒育種的主要手段。由于馬鈴薯是同源四倍體作物，用常規(guī)的方法去改良品種非常緩慢，一般育成一個(gè)品種至少需要8IO年，因此病毒病就成為馬鈴薯生產(chǎn)育種中一個(gè)非常棘手的問題。而傳統(tǒng)的控制和防治病毒的方法有莖尖脫毒組織培養(yǎng)和農(nóng)藥噴施，其中莖尖脫毒組織培養(yǎng)技術(shù)有其成本高、受檢測條件制約、脫毒后栽培后易再感染病毒以及品種變異等局限性，而農(nóng)藥噴施又嚴(yán)重污染環(huán)境，所以這兩種方法都不能有效的解決馬鈴薯病毒害問題。Hamilton于20世紀(jì)80年代初首先提出了基因工程保護(hù)的設(shè)想，在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)病毒基因組序列可能是防御病毒侵染的途徑之一。于是1988年出現(xiàn)第一例成功抗PVX(馬鈴薯X病毒)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯，使得以后的20年間馬鈴薯抗病毒基因工程研究在廣度和深度上都進(jìn)展迅速，為防治馬鈴薯病毒病開辟了新途徑。盡管在馬鈴薯抗病毒基因工程中，轉(zhuǎn)基因的技術(shù)和方法已經(jīng)進(jìn)行了多次的改進(jìn)和完善，轉(zhuǎn)入的抗病目的基因也在朝多樣化發(fā)展，國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究也取得了很多可喜的成績，但還是存在一些問題亟待解決①在各種實(shí)驗(yàn)報(bào)道中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化馬鈴薯的體系都相對(duì)獨(dú)立，目前對(duì)大多數(shù)馬鈴薯品種和不同的外植體還沒有一個(gè)普遍適合的轉(zhuǎn)化模式，因此還需要研究者通過實(shí)驗(yàn)去進(jìn)一步優(yōu)化篩選。②高抗病毒馬鈴薯植株再生率較低且不穩(wěn)定，不同的研究報(bào)告中使用的轉(zhuǎn)化體系標(biāo)準(zhǔn)以及方法均不相同，這就讓其他研究者很難進(jìn)行對(duì)比分析以及評(píng)價(jià)借鑒。③目前采取農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化馬鈴薯的過程中，大多在導(dǎo)入目的基因的同時(shí)也導(dǎo)入了抗生素抗性基因，這種選擇標(biāo)記在轉(zhuǎn)化過程中有可能會(huì)轉(zhuǎn)移到其他生物如微生物或馬鈴薯植株體內(nèi)。④現(xiàn)今的許多實(shí)驗(yàn)研究中導(dǎo)入的異源基因即病毒基因作為轉(zhuǎn)化馬鈴薯的抗病毒基因，這些來源病毒的基因有的具有一定的潛在危險(xiǎn)性，如CP基因的異源包殼現(xiàn)象，轉(zhuǎn)病毒基因的馬鈴薯植株體內(nèi)易發(fā)生與病毒RNA重組可能會(huì)產(chǎn)生新的病毒，病毒基因RNA產(chǎn)生突變等等從而引起生物安全性問題。目前很少有人用非病毒基因(如植物基因)轉(zhuǎn)化馬鈴薯。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，人們已經(jīng)分離克隆出了一些植物抗病基因，尤其是與馬鈴薯親緣關(guān)系很近的茄科作物，如已經(jīng)從番茄染色體上分離并克隆出來已經(jīng)鑒定具有抗病毒能力的Tm-l、Tm-2以及Tm-f等基因。因?yàn)橥椿騺碓从谧魑锉旧砘蚺c之親源關(guān)系近的種，這樣可以排除環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)和食用安全風(fēng)險(xiǎn)。同源轉(zhuǎn)基因的馬鈴薯更容易被公眾接受，將極可能會(huì)成為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)業(yè)的一個(gè)突破口。在未來的馬鈴薯抗病毒基因工程研究中，轉(zhuǎn)入非病毒來源基因、設(shè)計(jì)RNA介導(dǎo)的抗病毒路線，并采取復(fù)合基因策略，以獲得具有廣譜病毒抗性并且對(duì)環(huán)境及食用的安全的高抗病毒馬鈴薯植株，必將是當(dāng)前和將來的發(fā)展趨勢。
發(fā)明內(nèi)容有鑒于此，本發(fā)明的目的是提供一種利用基因工程技術(shù)獲得高抗病毒馬鈴薯植株的方法，根據(jù)已知番茄抗病基因Tm-22抗病機(jī)理及其對(duì)病毒(如TMV、ToMV等)的高抗特性，利用番茄與馬鈴薯親緣關(guān)系較近特點(diǎn)，采用基因工程技術(shù)將Tm-22基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯，并通過篩選、鑒定已表達(dá)Tm-f基因的高抗病毒馬鈴薯植株，提高馬鈴薯植株對(duì)常見病毒的抗性，同時(shí)避免環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)及食用安全風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明的利用基因工程技術(shù)獲得高抗病毒馬鈴薯植株的方法，包括如下步驟(1)制取番茄抗病基因Tm-22;根據(jù)番茄抗病基因Tm-22的序列設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物并在上游引物5'端加上限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，然后提取番茄RNA并分別以兩對(duì)特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得到Tm-22基因前段和后段的擴(kuò)增產(chǎn)物；將所得Tm-22基因前段和后段的擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入兩個(gè)pMD18-T載體，再進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)純化后連接，得全長Tm-22基因DNA序列；(2)超表達(dá)載體的構(gòu)建提取全長Tm-22片段并克隆到含CaMV35S啟動(dòng)子和終止子的pDH51載體中，得pDH51-Tm-22質(zhì)粒，酶切pDH51-Tm-22質(zhì)粒并將所得片段克隆到pBIN19載體，得超表達(dá)雙元載體pBIN19-Tm-22;(3)農(nóng)桿菌的侵染轉(zhuǎn)化將經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)獲得的馬鈴薯外植體置于含有pBIN19-Tm-22雙元載體的LBA4404農(nóng)桿菌的菌液中浸染并經(jīng)共培養(yǎng)、誘導(dǎo)生芽及選擇性生根培養(yǎng)，得轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株；(4)轉(zhuǎn)基因植株的檢測采用PCR、RT-PCR檢測方法從所得轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株中篩選陽性植株，所得陽性植株經(jīng)活體抗病性接種鑒定獲得抗病性高抗病毒馬鈴薯植株。進(jìn)一步，步驟(3)所述馬鈴薯外植體由以下步驟獲得a.將馬鈴薯脫毒試管苗單節(jié)段接種于培養(yǎng)基上，然后于溫度20士2t:、16h/d光周期和1000-20001x光照強(qiáng)度的條件下培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中包括的組分及相應(yīng)組分在培養(yǎng)基中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為蔗糖3%、瓊脂0.6-0.8%，調(diào)節(jié)pH為5.8;b.待脫毒試管苗長至6-7個(gè)葉片后將生長健壯的馬鈴薯脫毒試管苗剪成1葉1節(jié)的莖段，將所述莖段接種至誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基中并于20士2t:的全黑暗條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)以獲得試管薯；c.所述試管薯切片，得馬鈴薯外植體；進(jìn)一步，步驟b所述誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基中包括的組分及相應(yīng)組分在誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為蔗糖8_10%，調(diào)節(jié)pH為5.8;進(jìn)一步，所述誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基還包括瓊脂和6-BA，瓊脂在誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%，6-BA在誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基中的質(zhì)量濃度為2mg/L;進(jìn)一步，步驟(3)所述含有pBIN19-Tm-22雙元載體的LBA4404農(nóng)桿菌的菌液按如下步驟制得①將含有pBIN19-Tm-22雙元載體的LBA4404農(nóng)桿菌接種于YEB固體培養(yǎng)基中并于28士2t:條件下黑暗培養(yǎng)2-3d，得培養(yǎng)物；②按照0.01:1的體積比將所得培養(yǎng)物加入到Y(jié)EB液體培養(yǎng)基中并培養(yǎng)至ODe。。為1.8-2.0后于4000-6000rpm條件下室溫離心并用新鮮YEB液體培養(yǎng)基重懸菌體，得菌懸液；③所得菌懸液于4000-6000rpm室溫離心后用MS鹽溶液重懸菌體，得含有pBIN19-Tm-22雙元載體的LBA4404農(nóng)桿菌的菌液。所述YEB固體培養(yǎng)基包括的組分及相應(yīng)組分在YEB固體培養(yǎng)基中的濃度分別為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5X的瓊脂、50mg/L的Kan、500mg/L的Sm和50mg/L的Rif，調(diào)節(jié)pH為7.0;所述YEB液體培養(yǎng)基包括的組分及相應(yīng)組分在YEB液體培養(yǎng)基中的濃度分別為50mg/L的Kan、500mg/L的Sm和50mg/L的Rif，調(diào)節(jié)pH值為7.0;所述MS鹽溶液的pH為5.8;進(jìn)一步，所述含有pBIN19-Tm-22雙元載體的LBA4404農(nóng)桿菌菌液浸染時(shí)間為8-10min，所述共培養(yǎng)是將經(jīng)過LBA4404農(nóng)桿菌菌液浸染的馬鈴薯外植體于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中在20士2t:下黑暗共培養(yǎng)2-3d，所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中包括的組分及相應(yīng)組分在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度分別為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的蔗糖、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%的瓊脂、lmg/L的IAA、2mg/L的ZT、0.2mg/L的GA和0.5mg/L的BA，調(diào)節(jié)pH值為5.8;進(jìn)一步，所述誘導(dǎo)生芽操作為將經(jīng)過共培養(yǎng)的馬鈴薯外植體轉(zhuǎn)到抗性選擇培養(yǎng)基中，并在20-25t:光照16h、18-2(TC黑暗8h和1000-20001x光強(qiáng)的條件下培養(yǎng)直至抗性芽產(chǎn)生并形成新的植株，所述抗性選擇培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，抗性選擇培養(yǎng)基中包括的組分及相應(yīng)組分在選擇抗性培養(yǎng)基中的濃度分別為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的蔗糖、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%的瓊脂、lmg/L的IAA、2mg/L的ZT、0.2mg/L的GA、0.5mg/L的6-BA、500mg/L的CarB和65-80mg/L的Kan，調(diào)節(jié)pH值為5.8;所述選擇性生根培養(yǎng)操作為將經(jīng)誘導(dǎo)生芽后形成的新的植株切段，再將所得莖段置于選擇生根培養(yǎng)基中于20-25。C光照16h、18-2(TC黑暗8h和1000-20001x光強(qiáng)的條件下培養(yǎng)并進(jìn)行生根篩選，所述選擇生根培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，選擇生根培養(yǎng)基中包括的組分及相應(yīng)組分在選擇生根培養(yǎng)基中的濃度分別為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的蔗糖、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%的瓊脂、200mg/L的CarB和50mg/L的Kan，調(diào)節(jié)pH值為5.8;進(jìn)一步，步驟(4)所述PCR和RT-PCR檢測方法包括如下步驟I根據(jù)超表達(dá)雙元載體pBIN19-Tm-22的NPTII報(bào)告基因序列設(shè)計(jì)特異性引物(F1、R1)，其序列如下Fl:5'-CTATGACTGGGCACAACAGACAAT-3'Rl:5'-CAATATCACGGGTAGCCAACG-3，；II將Tm-22與非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯基因組進(jìn)行對(duì)比，查找Tm-22中含有的與非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯基因組同源性較低的片段區(qū)域，據(jù)此設(shè)計(jì)引物，其序列如下To-F:5'-CGCGCGTGTTATAGAGATTATGGAC-3'To-R:5'-ATAACCATTTGCCTCGCCCG-3'IIIPCR檢測分別提取所得轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株與非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株的基因組DNA，然后以提取的DNA為模板，用所述特異性引物(F1、R1)(To-F、To-R)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目標(biāo)帶后，分別連接pMD18-T載體并測序，篩選陽性植株；IVRT-PCR檢測分別提取步驟III所得陽性植株與野生型馬鈴薯植株的基因組RNA，用所述特異性引物(To-F、To-R)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得到目標(biāo)帶后，連接pMD18-T載體并測序，篩選陽性植株；進(jìn)一步，步驟(1)所述特異性引物為兩對(duì)，分別為(TF2、TR2)和(T22F、T22R)，T22F引物的5'端加上限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)(下劃線部位為限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn))，其各自的序列如下TF2:5'-GCATGTTAAGGGCAAGAGAA-3'TR2:5'-GCGACAACTTGAAATTCTTCC-3'T22F:5，-GGATCCTTGGCCGTGGACTCCATCT-3'T22R:5'-GTCGACCACTACTACACTCACGTTGC—3'。本發(fā)明中各英文名稱的中文解釋如下6-BA為6-芐氨基嘌呤、Kan為卡那霉素、LSm為鏈霉素、Rif為利福平、IAA為吲哚乙酸、ZT為玉米素、CarB為羧芐青霉素、CaMV35S為花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明的利用基因工程技術(shù)獲得高抗病毒馬鈴薯植株的方法具有如下優(yōu)點(diǎn)1、根據(jù)已知番茄抗病基因Tm-22抗病機(jī)理及其功能，以及Tm_22轉(zhuǎn)化茄科植物煙草并對(duì)侵害茄科植物的病毒(如TMV、ToMV等)具高抗特性的報(bào)道，利用番茄與馬鈴薯親緣關(guān)系較近特點(diǎn)，采用基因工程技術(shù)將Tm-f基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯，并篩選、鑒定已表達(dá)Tm-f基因的高抗病毒馬鈴薯植株，分析其對(duì)危害馬鈴薯常見病毒的抗性，得到具有較強(qiáng)病毒抗性的馬鈴薯植株，同時(shí)抗病毒譜廣。2、本發(fā)明利用與馬鈴薯親緣關(guān)系很近的番茄染色體上的Tm-22基因轉(zhuǎn)化馬鈴薯，排除了因病毒基因RNA重組或突變等給環(huán)境及食用帶來的風(fēng)險(xiǎn)，為馬鈴薯抗病的研究作出積極探索，有助于為外源抗病基因在馬鈴薯植株上成功表達(dá)提供參考。3、本發(fā)明方法提高了獲得試管薯的轉(zhuǎn)化效率。圖1及圖2為Tm-22基因的克隆流程圖；圖3和圖4為番茄總RNA經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后所得Tm_22基因前后兩段序列擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖5為超表達(dá)雙元載體的構(gòu)建流程圖6為pBIN19-Tm-22質(zhì)粒PCR檢測結(jié)果圖；圖7為酶切pBIN19-Tm-22載體所得產(chǎn)物PCR檢測結(jié)果圖；圖8農(nóng)桿工程菌浸染馬鈴薯外植體操作流程圖；圖9與圖10為鄂馬鈴薯3號(hào)轉(zhuǎn)基因植株與野生型馬鈴薯植株基因組DNA的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖，圖9中l(wèi)為野生型馬鈴薯株系對(duì)照，2為鄂馬鈴薯3號(hào)轉(zhuǎn)基因株系；圖10中1-4為鄂馬鈴薯3號(hào)轉(zhuǎn)基因株系，5-6為野生型馬鈴薯株系對(duì)照)；圖11為經(jīng)PCR檢測所得鄂馬鈴薯3號(hào)轉(zhuǎn)基因陽性植株與野生型馬鈴薯植株的基因組RNA的RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖，其中，1-6為鄂馬鈴薯3號(hào)轉(zhuǎn)基因陽性株系，7-12為野生型馬鈴薯株系對(duì)照。具體實(shí)施例方式以下將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。應(yīng)當(dāng)理解，優(yōu)選實(shí)施例僅為了說明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。優(yōu)選實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。供試材料番茄KBV品系幼葉、鄂馬鈴薯3號(hào)脫毒苗(重慶市脫毒種薯育種中心提供)。質(zhì)粒pGEM-TEasyVector(Promega)，pDH51(攜帶CaMV35S啟動(dòng)子和終止子)，pBIN19等由本實(shí)驗(yàn)室保存。菌株大腸桿菌JM109由本實(shí)驗(yàn)室保存試劑TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver.3.0試劑盒、5-Fu11RACECoreSet試劑盒、限制性內(nèi)切酶、Taq酶等購自大連TaKaRa公司；超薄/普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(離心柱型)為TIANGEN公司產(chǎn)品；X-gal和IPTG購自北京賽百勝公司；其余試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純試劑。1、Tm-22基因的克隆，克隆流程如圖1和圖2;1.1引物設(shè)計(jì)根據(jù)已報(bào)道的番茄抗病毒的抗性基因Tm_22(AF536201)的序列設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物，分別為(TF2、TR2)和(T22F、T22R)，在T22F引物的5'端加上BamHI酶切位點(diǎn)(下劃線部位)，三對(duì)特異性引物的序列如下①TF2:5'-GCATGTTAAGGGCAAGAGAA-3'②TR2:5'-GCGACAACTTGAAATTCTTCC-3，③T22F:5'-GGATCCTTGGCCGTGGACTCCATCT-3'④T22R:5，-GTCGACCACTACTACACTCACGTTGC—3'1.2RT-PCR①以KBV品系番茄幼葉總RNA為模板，根據(jù)TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver.3.0操作說明進(jìn)行第一鏈cDNA的合成；②以cDNA第一鏈為模板，分別以特異性引物(T22F、TR2)和(TF2、T22R)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得大小為1321bp和1502bp的擴(kuò)增片段，分別如圖3和圖4。反應(yīng)體系如表1:表1<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>針對(duì)(T22F、TR2)和(TF2、T22R)的PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)均為94"預(yù)變性4min;94°C變性30s，56。C退火30s，72。C延伸2min，共35個(gè)循環(huán)；72終延伸3min，結(jié)束PCR擴(kuò)增。③PCR產(chǎn)物的回收和純化采用超薄/普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(離心柱型)(TIANGEN公司產(chǎn)品)按說明書操作。④重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及鑒定，操作如下，將步驟③所得純化產(chǎn)物與pGEM⑧-TEasyVector連接，用大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，藍(lán)白斑篩選陽性克隆，然后用M13引物(英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司產(chǎn)品)進(jìn)行單菌落PCR檢測，陽性重組子由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測序鑒定。1.3全長Tm-22基因片段的拼接測序驗(yàn)證正確的擴(kuò)增片段分別為1321bp和1502bp，其中1321bp的cDNA序列通過RACE使其5'端加上Pstl酶切位點(diǎn)，然后將兩個(gè)擴(kuò)增片段連入pGEM⑧-TEasyVector載體，記為pMD18-Tm-f，用大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，藍(lán)白斑篩選陽性克隆。2、超表達(dá)雙元載體的構(gòu)建2.1具體操作BamHI酶切pMD18-Tm-22質(zhì)粒和含CaMV35S啟動(dòng)子及終止子的空載體pDH51，將所得全長Tm-22片段導(dǎo)入pDH51中得到過渡質(zhì)粒載體pDH51-Tm-22，然后再用EcoRI酶切質(zhì)粒載體pDH51-Tm-22(所得片段包含CaMV35S啟動(dòng)子，Tm_22片段和CaMV35S終止子)并克隆到表達(dá)載體pBIN19，獲得超表達(dá)雙元載體pBIN19-Tm-2^其流程如圖5。2.2結(jié)果的驗(yàn)證EcoRI酶切pBIN19-Tm-22載體結(jié)果出現(xiàn)llOOObp左右和3400bp左右的2條電泳帶，如圖7;用M13通用引物以pBIN19-Tm-22質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果出現(xiàn)3400bp左右的電泳帶，如圖6，證明結(jié)果與理論相符合。3、農(nóng)桿菌的侵染轉(zhuǎn)化本步驟中轉(zhuǎn)接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基的馬鈴薯莖段不經(jīng)過光照培養(yǎng)直接進(jìn)行黑暗處理，使短時(shí)間內(nèi)能夠誘導(dǎo)出試管薯，因塊莖傷口面積最大，所以感染能力強(qiáng)，而且塊莖易操作，可以不經(jīng)過愈傷過程直接誘導(dǎo)成苗，在適宜的培養(yǎng)基上使試管薯獲得較高頻率的轉(zhuǎn)化再生芽。操作流程如圖8，操作步驟如下3.1馬鈴薯外植體制備①馬鈴薯脫毒苗的繼代增殖培養(yǎng)基采用MS培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中包括的組分及相應(yīng)組分在培養(yǎng)基中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為蔗糖3%和瓊脂0.6%，培養(yǎng)基滅菌前調(diào)整pH為5.8，滅菌后將培養(yǎng)基按20-25ml分裝于組培玻璃瓶中；分別將所述兩個(gè)品種的馬鈴薯脫毒試管苗單節(jié)段接種于培養(yǎng)基上，置于溫度20±2°C、16h/d光照條件和10001x光照強(qiáng)度的光溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，基礎(chǔ)苗每四周繼代一次，本步驟中，MS培養(yǎng)基中瓊脂的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O.6-0.8%、光照強(qiáng)度可以為1000-20001x均可。②試管薯的誘導(dǎo)待脫毒試管苗長至約6-7個(gè)葉片時(shí)，將生長健壯、來源一致的馬鈴薯脫毒試管苗剪成1葉1節(jié)的莖段，無菌條件下將每個(gè)品種的莖段分別接種至裝有25ml誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，每培養(yǎng)皿10-15個(gè)莖段，將接種后的培養(yǎng)皿置于20士2t:全黑暗條件下直接誘導(dǎo)結(jié)薯，得試管薯，所述誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基中包括的組分及相應(yīng)組分在誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基中的濃度分別為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的蔗糖、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%的瓊脂，調(diào)節(jié)pH為5.8;本步驟所述的誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基中，蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在8-10%均可，同時(shí)還可添加6-BA，6-BA在誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基中的濃度2mg/L即可，表2為誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基單獨(dú)添加6-BA和KT后試管薯誘導(dǎo)率差異；表2分別對(duì)培養(yǎng)基中添加激素6-BA和KT后試管薯誘導(dǎo)率的差異<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>③待所述兩個(gè)品種生長兩周后誘導(dǎo)出的試管薯切成0.5cm左右的薄片，即為所需的馬鈴薯外植體。3.2農(nóng)桿菌介導(dǎo)的試管薯的轉(zhuǎn)化3.2.1含有pBIN19-Tm-22雙元載體的LBA4404農(nóng)桿菌菌液的制備①將含有pBIN19-Tm-22雙元載體的LBA4404農(nóng)桿菌接種于YEB固體培養(yǎng)基中并于28士2t:條件下黑暗培養(yǎng)2d，得培養(yǎng)物，本步驟所述黑暗培養(yǎng)在2-3d之間均可；②挑取單菌落在20mlYEB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)2d后，按照0.01:l的體積比將所得培養(yǎng)物加入到Y(jié)EB液體培養(yǎng)基中過夜擴(kuò)大培養(yǎng)至0D6。。為1.8-2.0，然后6000rpm條件下室溫離心并再次用新鮮YEB液體培養(yǎng)基重懸菌體，得菌懸液，本步驟中，離心轉(zhuǎn)速為4000-6000rpm均可；③所得菌懸液于4000rpm室溫離心后用MS鹽溶液重懸菌體，得含有pBIN19-Tm-22雙元載體的LBA4404農(nóng)桿菌菌液，本步驟中，離心轉(zhuǎn)速為4000-6000rpm均可；所述YEB固體培養(yǎng)基包括的組分及相應(yīng)組分在YEB固體培養(yǎng)基中的濃度分別為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5X的瓊脂、50mg/L的Kan、500mg/L的Sm和50mg/L的Rif，調(diào)節(jié)pH為7.0;所述YEB液體培養(yǎng)基包括的組分及相應(yīng)組分在YEB液體培養(yǎng)基中的濃度分別為50mg/L的Kan、500mg/L的Sm和50mg/L的Rif，調(diào)節(jié)pH值為7.0;所述MS鹽溶液的pH為5.8。因農(nóng)桿菌的濃度首先影響其菌體在植物細(xì)胞上的附著，在一定范圍內(nèi)菌液濃度越大附著率越高，轉(zhuǎn)化率越大，但超過了一定范圍之后會(huì)因?yàn)榫亩竞ψ饔没蛏L過快等，使外植體受到農(nóng)桿菌過度傷害而導(dǎo)致外植體切口褐化腐爛嚴(yán)重，且不利于共培養(yǎng)后去除農(nóng)桿菌；較低的菌液濃度致使T-DNA不能有效地整合進(jìn)植物細(xì)胞基因組，大大降低轉(zhuǎn)化效果；本發(fā)明所得的農(nóng)桿菌菌液濃度適宜，能夠有效保證含有Tm-22基因質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率。3.2.2馬鈴薯外植體的浸染將所得兩個(gè)個(gè)品種的馬鈴薯外植體浸于含有pBIN19-Tm-22雙元載體的LBA4404農(nóng)桿菌菌液中10min;對(duì)于浸染時(shí)間，如果過短，農(nóng)桿菌不能充分吸附細(xì)胞上，影響轉(zhuǎn)化；時(shí)間太長，外植體的傷口會(huì)褐化且農(nóng)桿菌污染嚴(yán)重并在后續(xù)實(shí)驗(yàn)難以控制，本步驟中，浸泡時(shí)間在8-10min之間均可充分保障浸染效果。3.2.3共培養(yǎng)將浸染后的馬鈴薯外植體置于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中并于20士2t:下黑暗共培養(yǎng)2d，所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中包括的組分及相應(yīng)組分在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度分別為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的蔗糖、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8X的瓊脂、lmg/L的IAA、2mg/L的ZT、0.2mg/L的GA和0.5mg/L的BA，調(diào)節(jié)pH值為5.8;共培養(yǎng)是影響轉(zhuǎn)化的重要因素，時(shí)間過長會(huì)使外植體會(huì)因農(nóng)桿菌污染而死亡，時(shí)間過短會(huì)導(dǎo)致農(nóng)桿菌感染和DNA轉(zhuǎn)化不充分，從而降低轉(zhuǎn)化率，同時(shí)也會(huì)增加假轉(zhuǎn)化體的出現(xiàn)，本發(fā)明中共培養(yǎng)的適宜時(shí)間為2-3d。3.2.4誘導(dǎo)生芽分別將共培養(yǎng)后的馬鈴薯外植體轉(zhuǎn)到抗性選擇培養(yǎng)基中，并在25士2。C光照16h、18士2t:黑暗8h和10001x光強(qiáng)的條件下培養(yǎng)至抗性芽產(chǎn)生并形成新的植株，所述抗性選擇培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，抗性選擇培養(yǎng)基中包括的組分及相應(yīng)組分在選擇抗性培養(yǎng)基中的濃度分別為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的蔗糖、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8X的瓊脂、lmg/L的IAA、2mg/L的ZT、0.2mg/L的GA、0.5mg/L的6-BA、500mg/L的CarB和75mg/L的Kan，調(diào)節(jié)pH值為5.8;本步驟中，20-25t:光照16h、18-2(rC黑暗8h和1000-20001x光強(qiáng)均為本發(fā)明所得馬鈴薯外植體的適宜培養(yǎng)條件，假陽性植株一般會(huì)出現(xiàn)不生長或者生長緩慢現(xiàn)象，僅陽性植株正常生長。激素是影響再生頻率的主要因素之一，不同的激素水平及激素的組合對(duì)誘導(dǎo)不同外植體愈傷和出芽的影響不同，由于馬鈴薯苗對(duì)卡那霉素(Kan)很敏感，Kan的濃度低選擇壓不足，易產(chǎn)生非轉(zhuǎn)基因植株，反之則不利于芽分化，本實(shí)施例的抗性選擇培養(yǎng)基中Kan的濃度為75mg/L，本發(fā)明中Kan在抗性選擇培養(yǎng)基中的允許濃度為65-80mg/L之間。3.2.5選擇性生根培養(yǎng)將經(jīng)誘導(dǎo)生芽后形成的新植株切段，再將所得莖段置于選擇生根培養(yǎng)基中于25士2t:光照16h、18士2t:黑暗8h和20001x光強(qiáng)的條件下培養(yǎng)并進(jìn)行生根篩選，得轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株，所述選擇生根培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，選擇生根培養(yǎng)基中包括的組分及相應(yīng)組分在選擇生根培養(yǎng)基中的濃度分別為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的蔗糖、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%的瓊脂、200mg/L的CarB和50mg/L的Kan，調(diào)節(jié)pH值為5.8，采用本發(fā)明所述選擇生根培養(yǎng)基進(jìn)行選擇性生根培養(yǎng)后，其生根率能夠達(dá)到60%以上。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的外源基因轉(zhuǎn)化馬鈴薯中，除以上因素外，轉(zhuǎn)化效率也較易受馬鈴薯品種的影響，本實(shí)施實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明本發(fā)明方法優(yōu)先適用于鄂馬鈴薯3號(hào)品種的轉(zhuǎn)化，其次還可適用于其它品種的脫毒馬鈴薯(如川薯27號(hào))的基因轉(zhuǎn)化。4、所得轉(zhuǎn)基因植株的檢測4.l設(shè)計(jì)引物A根據(jù)本實(shí)施例所得超表達(dá)雙元載體pBIN19-Tm-22上NPTII基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物(F1、R1)，其序列如下Fl:5'-CTATGACTGGGCACAACAGACAAT-3'Rl:5'-CAATATCACGGGTAGCCAACG-3'B進(jìn)行基因序列對(duì)比，依據(jù)Tm-f中含有的與非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯基因組同源性較低的區(qū)域，設(shè)計(jì)引物To-F:5'-CGCGCGTGTTATAGAGATTATGGAC-3'To-R:5'-ATAACCATTTGCCTCGCCCG-3'4.2PCR檢測取步驟3.2.5所得轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株并擴(kuò)繁移栽，分別取不同株系及野生型馬鈴薯植株的基因組DNA，然后以提取的DNA為模板，用上述設(shè)計(jì)的特異性引物(Fl、Rl)和(To-F、To-R)進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測，篩選得到陽性植株，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系如表1，擴(kuò)增的循環(huán)參數(shù)為針對(duì)(F1、R1)的PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)為94t:預(yù)變性5min;94。C變性30s，63t:退火30s，72。C延伸40s，共35個(gè)循環(huán);72終延伸10min，結(jié)束PCR擴(kuò)增。針對(duì)(To-F、To-R)的PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)為94"C預(yù)變性5min;94"C變性30s，54°C退火30s，72。C延伸40s，共35個(gè)循環(huán)；72終延伸10min，結(jié)束PCR擴(kuò)增。圖9與圖10為鄂馬鈴薯3號(hào)轉(zhuǎn)基因植株與野生型馬鈴薯植株基因組DNA的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖，所得目標(biāo)條帶連接pMD18-T載體，經(jīng)過測序證明轉(zhuǎn)化結(jié)果正確。(圖9中1為野生型馬鈴薯株系對(duì)照，2為鄂馬鈴薯3號(hào)轉(zhuǎn)基因株系；圖10中1-4為鄂馬鈴薯3號(hào)轉(zhuǎn)基因株系，5-6為野生型馬鈴薯株系對(duì)照)4.3RT-PCR檢測Tm-22在馬鈴薯植株中的表達(dá)情況分別提取步驟4.2中篩選得到的鄂馬鈴薯3號(hào)轉(zhuǎn)基因陽性植株與野生型馬鈴薯植株的基因組RNA，用特異性引物(To-F、To-R)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增檢測，進(jìn)一步篩選陽性植株。針對(duì)特異性引物(To-F、To-R)的擴(kuò)增體系及參數(shù)與步驟4.2相同，圖11為經(jīng)PCR檢測所得鄂馬鈴薯3號(hào)轉(zhuǎn)基因陽性植株與野生型馬鈴薯植株的基因組RNA的RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖，得到目標(biāo)帶后，分別用連接液連接pMD18-T載體并測序，證明結(jié)果正確。(圖11中，1-6為鄂馬鈴薯3號(hào)轉(zhuǎn)基因陽性株系，7-12為野生型馬鈴薯株系對(duì)照)4.4病毒侵染4.4.1植物材料、毒源植物材料所得鄂馬鈴薯3號(hào)轉(zhuǎn)基因植株，野生型馬鈴薯毒源番茄花葉病毒(ToMV)和煙草花葉病毒(TMV)由浙江大學(xué)提供；馬鈴薯X病毒(PVX)和馬鈴薯Y病毒(PVY)由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)馬鈴薯實(shí)驗(yàn)室暨湖北省馬鈴薯工程技術(shù)研究中心提供。4.4.2操作步驟①接種病毒的制備番茄花葉病毒(ToMV)煙草花葉病毒(TMV)毒源先接種在心葉煙上，20天后收集發(fā)病心葉煙葉片，按照lg病葉加入20ml的磷酸緩沖液(0.01mol/L，pH7.0)后在研缽中勻漿，然后用雙層紗布過濾，收集濾液備用，馬鈴薯X病毒(PVX)和馬鈴薯Y病毒(PVY)通過試管續(xù)代培養(yǎng)；②接種方法來回輕輕摩擦葉片，然后用蒸餾水沖洗葉面；4.4.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)過病毒侵染觀察，排除外界環(huán)境因素影響，得到的轉(zhuǎn)基因株系病毒抗性結(jié)果如下表。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>最后說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。序列表〈110>重慶大學(xué)〈120〉利用基因工程技術(shù)獲得高抗病毒馬鈴薯植株的方法〈160>8〈210>1〈211>20〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈223>TF2〈400〉1gcatgttemgggc朋g3g朋〈210>2〈211>21〈212>DNA<213>人工序列〈220〉〈223>TR2〈400>2gcgacaacttgaaattcttcc〈210>3〈211〉25〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉T22F〈400>3ggatccttggccgtggactccatct〈210>4〈211>26〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉T22R〈400>4gtcgaccactactacactcacgttgc<210>5〈211>24〈212>DNA〈213〉人工序列〈220><223>F1〈400〉5ctetgactgggc3c朋c3gac朋t〈210>6〈211>21<212>廳〈213〉人工序列〈220〉〈223>R1〈400>6caatatcacgggtagccaacg21〈210〉7〈211〉25〈212〉DNA〈213〉人工序列<220>〈223〉To-F〈400〉7cgcgcgtgttatagagattatggac25〈210>8<211>20〈212〉DNA〈213〉人工序列<220>〈223>To_R〈400>8ataaccatttgcctcgcccg20權(quán)利要求一種利用基因工程技術(shù)獲得高抗病毒馬鈴薯植株的方法，其特征在于包括如下步驟(1)制取番茄抗病基因Tm-22；根據(jù)番茄抗病基因Tm-22的序列設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物并在上游引物5’端加上限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，然后提取番茄RNA并分別以兩對(duì)特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得到Tm-22基因前段和后段的擴(kuò)增產(chǎn)物；將所得Tm-22基因前段和后段的擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入兩個(gè)pMD18-T載體，再進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)純化后連接，得全長Tm-22基因DNA序列；(2)超表達(dá)載體的構(gòu)建提取全長Tm-22片段并克隆到含CaMV35S啟動(dòng)子和終止子的pDH51載體中，得pDH51-Tm-22質(zhì)粒，酶切pDH51-Tm-22質(zhì)粒并將所得片段克隆到pBIN19載體，得超表達(dá)雙元載體pBIN19-Tm-22；(3)農(nóng)桿菌的侵染轉(zhuǎn)化將經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)獲得的馬鈴薯外植體置于含有pBIN19-Tm-22雙元載體的LBA4404農(nóng)桿菌的菌液中浸染并經(jīng)共培養(yǎng)、誘導(dǎo)生芽及選擇性生根培養(yǎng)，得轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株；(4)轉(zhuǎn)基因植株的檢測采用PCR、RT-PCR檢測方法從所得轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株中篩選陽性植株，所得陽性植株經(jīng)活體抗病性接種鑒定，獲得高抗病毒馬鈴薯植株。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用基因工程技術(shù)獲得高抗病毒馬鈴薯植株的方法，其特征在于步驟(3)所述馬鈴薯外植體由以下步驟獲得a.將馬鈴薯脫毒試管苗單節(jié)段接種于培養(yǎng)基上，然后于溫度20士2t:、16h/d光周期和1000-20001x光照強(qiáng)度的條件下培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中包括的組分及相應(yīng)組分在培養(yǎng)基中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為蔗糖3%、瓊脂0.6-0.8%，調(diào)節(jié)pH為5.8;b.待脫毒試管苗長至6-7個(gè)葉片后將生長健壯的馬鈴薯脫毒試管苗剪成1葉1節(jié)的莖段，將所述莖段接種至誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基中并于20士2t:的全黑暗條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)以獲得試管薯；c.所述試管薯切片，得馬鈴薯外植體。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用基因工程技術(shù)獲得高抗病毒馬鈴薯植株的方法，其特征在于步驟b所述誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基中包括的組分及相應(yīng)組分在誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為蔗糖8-10%，調(diào)節(jié)pH為5.8。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用基因工程技術(shù)獲得高抗病毒馬鈴薯植株的方法，其特征在于所述誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基還包括瓊脂和6-BA，瓊脂在誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%，6-BA在誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基中的質(zhì)量濃度為2mg/L。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用基因工程技術(shù)獲得高抗病毒馬鈴薯植株的方法，其特征在于步驟(3)所述含有pBIN19-Tm-22雙元載體的LBA4404農(nóng)桿菌的菌液按如下步驟制得①將含有pBIN19-Tm-22雙元載體的LBA4404農(nóng)桿菌接種于YEB固體培養(yǎng)基中并于28士2t:條件下黑暗培養(yǎng)2-3d，得培養(yǎng)物；②按照0.01:1的體積比將所得培養(yǎng)物加入到Y(jié)EB液體培養(yǎng)基中并培養(yǎng)至0D6。。為1.8-2.0后于4000-6000rpm條件下室溫離心并用新鮮YEB液體培養(yǎng)基重懸菌體，得菌懸液；③所得菌懸液于4000-6000rpm室溫離心后用MS鹽溶液重懸菌體，得含有pBIN19-Tm-22雙元載體的LBA4404農(nóng)桿菌的菌液。所述YEB固體培養(yǎng)基包括的組分及相應(yīng)組分在YEB固體培養(yǎng)基中的濃度分別為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5X的瓊脂、50mg/L的Kan、500mg/L的Sm和50mg/L的Rif，調(diào)節(jié)pH為7.0;所述YEB液體培養(yǎng)基包括的組分及相應(yīng)組分在YEB液體培養(yǎng)基中的濃度分別為50mg/L的Kan、500mg/L的Sm和50mg/L的Rif，調(diào)節(jié)pH值為7.0;所述MS鹽溶液的pH為5.8。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的利用基因工程技術(shù)獲得高抗病毒馬鈴薯植株的方法，其特征在于所述含有pBIN19-Tm-f雙元載體的LBA4404農(nóng)桿菌菌液浸染時(shí)間為8-10min，所述共培養(yǎng)是將經(jīng)過LBA4404農(nóng)桿菌菌液浸染的馬鈴薯外植體于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中在20士2t:下黑暗共培養(yǎng)2-3d，所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中包括的組分及相應(yīng)組分在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度分別為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的蔗糖、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8X的瓊脂、lmg/L的IAA、2mg/L的ZT、0.2mg/L的GA和0.5mg/L的BA，調(diào)節(jié)pH值為5.8。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的利用基因工程技術(shù)獲得高抗病毒馬鈴薯植株的方法，其特征在于所述誘導(dǎo)生芽操作為將經(jīng)過共培養(yǎng)的馬鈴薯外植體轉(zhuǎn)到抗性選擇培養(yǎng)基中，并在20-25t:光照16h、18-2(TC黑暗8h和1000-20001x光強(qiáng)的條件下培養(yǎng)直至抗性芽產(chǎn)生并形成新的植株，所述抗性選擇培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，抗性選擇培養(yǎng)基中包括的組分及相應(yīng)組分在選擇抗性培養(yǎng)基中的濃度分別為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的蔗糖、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%的瓊脂、lmg/L的IAA、2mg/L的ZT、0.2mg/L的GA、0.5mg/L的6-BA、500mg/L的CarB和65_80mg/L的Kan，調(diào)節(jié)pH值為5.8;所述選擇性生根培養(yǎng)操作為將經(jīng)誘導(dǎo)生芽后形成的新的植株切段，再將所得莖段置于選擇生根培養(yǎng)基中于20-25。C光照16h、18-2(TC黑暗8h和1000-20001x光強(qiáng)的條件下培養(yǎng)并進(jìn)行生根篩選，所述選擇生根培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，選擇生根培養(yǎng)基中包括的組分及相應(yīng)組分在選擇生根培養(yǎng)基中的濃度分別為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的蔗糖、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%的瓊脂、200mg/L的CarB和50mg/L的Kan，調(diào)節(jié)pH值為5.8。8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一權(quán)利要求所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)Tm-22基因獲得抗病性鈴薯植株的方法，其特征在于步驟(4)所述PCR和RT-PCR檢測方法包括如下步驟I根據(jù)超表達(dá)雙元載體pBIN19-Tm-22的NPTII報(bào)告基因序列設(shè)計(jì)特異性引物F1、R1，其序列如下Fl:5'-CTATGACTGGGCACAACAGACAAT-3'Rl:5'-CAATATCACGGGTAGCCAACG-3，；II將Tm-22與非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯基因組進(jìn)行對(duì)比，查找Tm-22中含有的與非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯基因組同源性較低的片段區(qū)域，據(jù)此設(shè)計(jì)引物，其序列如下To-F:5'-CGCGCGTGTTATAGAGATTATGGAC-3'To-R:5'-ATAACCATTTGCCTCGCCCG-3'IIIPCR檢測分別提取所得轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株與非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株的基因組DNA，然后以提取的DNA為模板，用所述特異性引物(Fl、Rl)和(To-F、To-R)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目標(biāo)帶后，分別連接pMD18-T載體并測序，篩選陽性植株；IVRT-PCR檢測分別提取步驟III所得陽性植株與非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株的基因組RNA，用所述特異性引物To-F、To-R進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得到目標(biāo)帶后，連接pMD18_T載體并測序，篩選陽性植株。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的利用基因工程技術(shù)獲得高抗病毒馬鈴薯植株的方法，其特征在于步驟(1)所述特異性引物為兩對(duì)，分別為(TF2、TR2)和(T22F、T22R)，T22F引物的5'端加上限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，其各自的序列如下TF2:5'-GCATGTTAAGGGCAAGAGAA-3'TR2:5'-GCGACAACTTGAAATTCTTCC-3'T22F:5'-GGATCCTTGGCCGTGGACTCCATCT-3'T22R:5'-GTCGACCACTACTACACTCACGTTGC-3，。全文摘要本發(fā)明公開了一種利用基因工程技術(shù)獲得高抗病毒馬鈴薯植株的方法，包括Tm-22基因的克隆及其超表達(dá)載體的構(gòu)建、農(nóng)桿菌的侵染轉(zhuǎn)化、高抗病毒馬鈴薯植株的檢測；本發(fā)明根據(jù)已知番茄抗病基因Tm-22抗病機(jī)理及其對(duì)病毒(如TMV、ToMV等)的高抗特性，利用番茄與馬鈴薯親緣關(guān)系較近特點(diǎn)，采用基因工程技術(shù)將Tm-22基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯，并通過篩選、鑒定而獲得已表達(dá)Tm-22基因的高抗病毒馬鈴薯植株，提高了馬鈴薯植株對(duì)常見病毒的抗性；本發(fā)明通過植物基因轉(zhuǎn)化馬鈴薯，能夠避免環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)及食用安全風(fēng)險(xiǎn)，有助于把馬鈴薯抗病研究推向一個(gè)新的臺(tái)階，為實(shí)際應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)作出了積極探索。文檔編號(hào)A01H5/00GK101717785SQ20091019195公開日2010年6月2日申請(qǐng)日期2009年12月16日優(yōu)先權(quán)日2009年12月16日發(fā)明者吳祥華,張陳明,胡宗利,鄧?yán)?陳國平,高建閣申請(qǐng)人:重慶大學(xué)