甲肝病毒單克隆抗體及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種甲肝病毒單克隆抗體，由保藏編號為CGMCC?No.7858的雜交瘤細胞株分泌產(chǎn)生。該單克隆抗體能夠高效、特異性地中和甲肝病毒抗原，對于甲肝病毒感染的診斷、預防及治療具有重要意義。
【專利說明】甲肝病毒單克隆抗體及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及病毒免疫學檢測領域，具體地說，涉及甲肝病毒單克隆抗體及其應用?！颈尘凹夹g】
[0002]甲型病毒性肝炎簡稱甲型肝炎，是由甲型肝炎病毒(甲肝病毒，HAV)引起的一種急性傳染病。甲型肝炎病毒屬于微小核糖核酸病毒科，肝病毒屬。病毒顆粒呈球形，直徑約為27nm,無囊膜，衣殼由32個殼粒組成，呈20面體立體對稱，每個殼粒具有四個多肽分別為病毒蛋白VP1、VP2、VP3和VP4，基因組為單股正鏈RNA，其長度相當于7500個核苷酸左右。在RNA的3'末端有多聚腺苷序列，在5'末端以共價形式與病毒基因組蛋白連接。根據(jù)病毒核苷酸序列分析，可將人甲肝病毒分為四個基因型，但其抗原性相似，所以甲型肝炎病毒只有一個血清型。
[0003]甲型肝炎病毒主要通過糞-口途徑傳播，傳染源多為病人。病毒潛伏期為15~45天，病毒常在患者轉(zhuǎn)氨酸升高前的5~6天就存在于患者的血液和糞便中。發(fā)病2~3周后，隨著血清中特異性抗體的產(chǎn)生，血液和糞便的傳染性也逐漸消失。長期攜帶病毒者極罕見。HAV隨患者糞便排出體外，通過污染水源、食物、海產(chǎn)品(如毛蚶等)、食具等的傳播可造成散發(fā)性流行或大流行。也可通過輸血或注射方式傳播，但由于HAV在患者血液中持續(xù)時間遠較乙型肝炎病毒短，故此種傳播方式較為少見。
[0004]人類感染甲肝病毒后，首先在消化道中增殖，在短暫的病毒血癥中，病毒又可繼續(xù)在血液白細胞中增殖，然后進入肝臟，在肝細胞內(nèi)復制繁殖。甲肝病毒僅有一個血清型和一個抗原抗體系統(tǒng)，因此其檢測抗體可在世界各國使用。甲肝的發(fā)病機制不清楚，但是與肝臟免疫作用特別是細胞免疫作用相關。HAV可從肝細胞經(jīng)膽汁進入腸道排出體外。因此，可從糞便中檢出HAV顆粒加以確診，在潛伏期或黃疸期的傳染性最強。
[0005]臨床表現(xiàn):甲肝分為急性黃疸型，急性無黃疸型，亞臨床型和急性淤膽型，其中急性淤膽型是急性黃疸型的特殊性，是由于肝細胞分泌膽汁功能受損。由于無論從臨床表現(xiàn)還是從肝功能檢查，都無法將急性甲型肝炎病毒感染與其他類型的肝炎病毒感染相區(qū)分，因此病原學檢查對于診斷急性甲型肝炎病毒感染十分重要。
[0006]甲型肝炎的病原學檢查包括:(I)抗HAV IgM = HAV感染后早期產(chǎn)生IgM型抗體，是新近感染的證據(jù)，也是早期診斷甲型肝炎最簡便而可靠的血清學標志。在發(fā)病后數(shù)天即可陽性，一般持續(xù)8~12周，少數(shù)可延續(xù)6個月。臨床上多采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測。(2)抗HAV IgG:出現(xiàn)稍晚，于2~3個月達到高峰，是過去感染的標志，可持續(xù)多年或終身。其他檢測方法有:免疫電鏡觀察和鑒定HAV顆粒，體外細胞培養(yǎng)分離病毒，檢測HAVRNA等，一般僅在實驗研究中使用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的 是提供一種甲肝病毒單克隆抗體及其應用。
[0008]為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明利用甲肝病毒(TZ84株)全病毒顆粒作為抗原利用雜交瘤技術制備單克隆抗體，然后通過Southern Biotech單克隆抗體分型試劑盒對所獲得的單抗進行亞型鑒定，通過免疫印跡法分析單抗特異性，采用間接ELISA法進行中和試驗，獲得了能夠分泌中和甲肝病毒并能夠特異性結(jié)合甲肝病毒的細胞系，及由該細胞系分泌產(chǎn)生的單克隆抗體。
[0009]在本發(fā)明的一方面，提供一種對甲肝病毒具有高中和效價的雜交瘤細胞株，即甲型肝炎病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株HAV mAb-4。該雜交瘤細胞株現(xiàn)已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101，保藏編號CGMCC N0.7858，保藏日期2013年7月10日。
[0010]在本發(fā)明的另一個方面，提供由上述雜交瘤細胞株分泌產(chǎn)生的單克隆抗體。
[0011]進一步地，本發(fā)明還提供根據(jù)所述單克隆抗體的抗原結(jié)合區(qū)域(例如重鏈和輕鏈可變區(qū))發(fā)展出的各種衍生抗體，可以用于被動免疫治療或者預防甲肝病毒感染，如人源化的抗體。
[0012]由于本發(fā)明的單克隆抗體對于甲肝病毒具有高水平的中和效果，因此本發(fā)明還提供所述單克隆抗體或其活性片段或保守性變異體，或其任意組合在制備用于檢測甲肝病毒抗原的試劑、藥劑或試劑盒中的應用。
[0013]本發(fā)明另一個方面提供用于檢測甲肝病毒抗原，或抗甲肝病毒IgG或IgM的試劑盒、試劑、藥劑，其包括本發(fā)明所述的單克隆抗體或其活性片段或保守性變異體，或其任意組合。所述試劑、藥劑或試劑盒可用于檢測甲肝病毒抗原。從而進一步用于診斷甲肝病毒感染。
[0014]本發(fā)明再一個方面提供一種用于治療或預防甲肝病毒感染的藥物，所述藥物包含所述單克隆抗體或其活性片段或其保守性變異體。優(yōu)選地，所述藥物進一步包含藥學上可接受的載體和/或賦形劑。
[0015]本發(fā)明的又一個方面提供一種用于治療和/或預防甲肝病毒感染的方法，其中包括將本發(fā)明所述的單克隆抗體或其活性片段或保守性變異體施用于患者。
[0016]本發(fā)明還提供了用于檢測甲肝病毒抗原的方法，其中使用了本發(fā)明所述的單克隆抗體或其活性片段或其保守性突變體，或標記的本發(fā)明的單克隆抗體或其活性片段或其保守性突變體。優(yōu)選地，采用雙抗夾心法進行檢測甲肝病毒抗原。
[0017]對于本發(fā)明所述的標記，其是指生物標記或化學標記。例如酶標記或熒光標記(例如熒光素標記)。優(yōu)選地，所述酶標記為辣根過氧化物酶、丙酮酸激酶或葡萄糖氧化酶標記
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[0018]對于本發(fā)明的用于預防或治療目的的單克隆抗體，其優(yōu)選是被人源化的。
[0019]本發(fā)明還提供所述單克隆抗體在制備用于預防或治療甲肝病毒感染的人源化抗體中的應用。
[0020]本發(fā)明還提供了甲肝病毒相關抗原、抗體的檢測方法，其包括:1、用于樣本中針對甲肝病毒的IgG抗體的檢測方法:將純化病毒液吸附于固相載體上，再加入置于緩沖系統(tǒng)中的待檢標本，再加入攜帶可標記檢測物的識別所檢測標本來源物種的IgG抗體的第二抗體，再通過檢測所攜帶的標記物的存在推測標本中抗甲肝病毒抗體的存在或者多少。優(yōu)選的所述可檢測標記物為辣根過氧化物酶或熒光素標記。2、用于樣本中針對甲肝病毒的IgM抗體的檢測方法:將純化病毒液吸附于固相載體上，再加入置于緩沖系統(tǒng)中的待檢標本，再加入攜帶可檢測標記物的識別所檢測標本來源物種的IgM抗體的第二抗體，再通過檢測所攜帶的標記物的存在推測標本中抗甲肝病毒抗體的存在或者多少。優(yōu)選的所述可檢測標記物為辣根過氧化物酶或熒光標記物。3、用于樣本中針對甲肝病毒的IgM抗體的檢測方法:將抗待檢物種的IgM的抗體(抗抗體，抗IgM的抗體)吸附于固相載體上，再加入置于緩沖系統(tǒng)中的待檢標本，再加入攜帶可檢測標記物的識別所檢測標本的酶標記抗原，再通過檢測所攜帶的標記物的存在推測標本中抗甲肝病毒IgM抗體的存在或者多少。優(yōu)選的所述可檢測標記物為辣根過氧化物酶或熒光素標記物。
[0021]本發(fā)明提供一株保藏號為CGMCC N0.7858，能夠分泌產(chǎn)生甲肝病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞株，由其分泌產(chǎn)生的單克隆抗體能夠高效、特異性地中和甲肝病毒抗原，對于甲肝病毒感染的診斷、預防及治療具有重要意義。
【具體實施方式】
[0022]以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0023]實施例1雜交瘤細胞系的獲得
[0024]包括如下步驟:
[0025]1、免疫原的制備
[0026]免疫原為甲肝病毒抗原--TZ84株，由北京科興生物制品有限公司提供。將病毒接種2BS細胞，培養(yǎng)、收獲后經(jīng)PEG沉淀與三氯甲烷抽提進行純化，然后進行超濾濃縮及滅活以制備純化病毒液。
[0027]2、動物免疫
[0028]采用甲肝病毒純化液進行BALB/c小鼠初次免疫和加強免疫,所用BALB/c小鼠為雌性，月齡為6-8周，體重為18-22g。免疫程序:首次免疫取甲肝病毒純化液與弗氏完全佐劑佐劑混合乳化，免疫BALB/c小鼠，150 μ g/只，皮下多點注射；間隔10天后進行第二次免疫，取甲肝病毒純化液與弗氏不完全佐劑混合乳化，然后加強免疫上述小鼠，劑量同第一次；7天后采血，采用間接ELISA法測定抗體的抗甲肝病毒活性。對檢測抗體效價最高的小鼠不加佐劑，用甲肝病毒純化液進行腹腔加強免疫。
[0029]3、細胞融合
[0030]取免疫鼠脾臟細胞與SP2/0骨髓瘤按比例融合，鋪96孔細胞培養(yǎng)板，采用HAT選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)雜交瘤細胞，第7天采用間接ELISA法檢測細胞上清以篩選陽性細胞。間接法采用甲肝病毒純化液包被，篩選呈陽性的細胞孔。間接ELISA法如下:將甲肝病毒純化液包被酶標板，加入陽性血清對照、陰性血清對照，同時設置空白對照孔，37°C反應后洗滌酶標板，加入羊抗小鼠IgG-HRP ;反應后洗滌酶標板，加入TMB顯色液37°C顯色10-20分鐘，用2M H2SO4終止反應，儀器上讀取OD45tl的吸光度。根據(jù)吸光度值篩選陽性細胞孔。
[0031]4、克隆:采用有限稀釋法對陽性細胞孔進行克隆。
[0032]5、檢測:對克隆板內(nèi)的細胞上清進行檢測，采用甲肝抗原純化液包被酶標板進行檢測。
[0033]6、二次克隆化，同步驟4的操作。
[0034] 7、二次克隆化后的檢測，同步驟5的檢測方法，采用間接ELISA法將第二次克隆的細胞上清進行針對甲肝病毒抗原的陽性檢測，選擇單細胞陽性孔進行擴大培養(yǎng)，獲得大量雜交瘤細胞。
[0035]實施例2單克隆抗體的篩選及制備
[0036]1、單克隆抗體腹水制備
[0037]雜交瘤細胞擴大培養(yǎng)采用腹腔注射小鼠制備腹水。其中腹水制備流程如下:培養(yǎng)雜交瘤細胞，于后腹腔注射石蠟致敏的BALB/c小鼠，7~14天左右收集腹水，1200轉(zhuǎn)/分鐘離心，除去沉淀，收集上層單克隆抗體腹水。
[0038]2、單克隆抗體的初步篩選和制備
[0039]采用甲肝病毒純化液1:100稀釋后分別包被酶標板,100 μ I/孔,包被過夜；用
0.01M PBST-20(含0.5v/v%。吐溫-20)的洗液洗板3遍，加入10%小牛血清、0.01M PBST-20(含0.5v/v%。吐溫-20)溶液，200 μ I/孔，37°C封閉，棄去板中溶液。加入系列稀釋的上述獲得的上層單克隆抗體腹水，100 μ I/孔，其中小鼠陰性血清為陰性對照；37°C孵育I小時，用上述洗液洗板，加入1:10000稀釋于10%小牛血清、0.01MPBST-20(含0.5v/v%。吐溫-20)溶液的羊抗小鼠IgG-HRP，100 μ I/孔，37°C孵育I小時，洗板，加入100 μ I的TMB顯色液，采用2Μ H2SO4終止反應，450nm處讀數(shù)，共篩選處6株對于甲肝病毒抗原反應的單克隆抗體雜交瘤細胞，分別編號為1#、2#、3#、4#、5#、6#。
[0040]對上述篩選的雜交瘤細胞株建系，液氮保存。將初篩的6株雜交瘤細胞株注射小鼠腹腔，獲得單克隆抗體。
[0041]本實施例中采用甲肝病毒包被的間接ELISA法初篩方法，節(jié)省工作量與時間。
[0042]實施例3單克隆抗體亞型鑒定
[0043]按照抗體亞型鑒定試劑盒(購自Southern Biotech公司)說明書操作,對實施例2中篩選出的單抗進行亞型鑒定。實驗結(jié)果如表1所示。
[0044]表16株甲肝單抗抗體亞型鑒定結(jié)果
[0045]
【權(quán)利要求】
1.甲型肝炎病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株HAVmAb-4，其保藏編號為CGMCC N0.7858。
2.由權(quán)利要求1所述雜交瘤細胞株產(chǎn)生的單克隆抗體。
3.用于檢測甲肝病毒抗原，或抗甲肝病毒IgG或IgM的試劑盒、試劑，其包括權(quán)利要求2所述的單克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒、試劑，其特征在于，所述單克隆抗體經(jīng)生物標記或化學標記。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒、試劑，其特征在于，所述標記為酶標記或熒光標記。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒、試劑，其特征在于，所述標記為辣根過氧化物酶、丙酮酸激酶或葡萄糖氧化酶標記，或熒光素標記。
7.權(quán)利要求2所述單克隆抗體在制備用于檢測甲肝病毒抗原，或抗甲肝病毒IgG或IgM的試劑盒、試劑中的應用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應用，其特征在于，所述單克隆抗體經(jīng)生物標記或化學標記。
9.權(quán)利要求2所述單克隆抗體在制備用于預防或治療甲肝病毒感染的人源化抗體中的中的應用。
10.由權(quán)利要求2所述單克隆抗體制備的用于預防或治療甲肝病毒感染的人源化抗體。
【文檔編號】C12R1/91GK103923882SQ201410106261
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年3月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月9日
【發(fā)明者】胡雅靈, 戈小琴, 蔡芳, 高強, 宋俐霏, 尹衛(wèi)東 申請人:北京科興生物制品有限公司