一種as-pcr引物設計方法、基因多態(tài)性檢測方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種AS-PCR引物設計方法、基因多態(tài)性檢測方法及試劑盒，所述方法及試劑盒用于對可能包含等位基因變異區(qū)域的靶序列進行檢測以確定等位基因變體是否存在。所述AS-PCR引物設計方法包括以下步驟：（i）針對包含待測等位基因變異區(qū)域的靶序列設計AS-PCR引物；（ii）對步驟（i）所設計的AS-PCR引物進行修飾，使所述AS-PCR引物的3’端最后一個堿基帶有能夠屏蔽所述AS-PCR引物直接延伸的基團。相較于傳統(tǒng)AS-PCR單一的檢測位點能力，本發(fā)明的基因多態(tài)性引物設計方法和檢測方法及試劑盒可以模糊識別突變位點，并且可以將探針和引物合二為一，節(jié)約了引物合成成本、設計時間，設計也方便易懂，容易掌握。
【專利說明】—種AS-PCR引物設計方法、基因多態(tài)性檢測方法及試劑盒
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于核酸診斷試劑領域，具體涉及一種等位基因特異性聚合酶鏈式反應(AS-PCR)引物設計方法。本發(fā)明還涉及一種AS-PCR基因多態(tài)性檢測方法及試劑盒，所述方法及試劑盒用于對可能(即懷疑)包含等位基因變異區(qū)域的靶序列進行檢測以確定等位基因變體是否存在。
【背景技術】
[0002]等位基因特異性寡核苷酸分析法(allele-specific oligonucleotide, AS0)是基于雜交的突變檢測技術，常用以檢測已知突變。設計一段例如15~20bp的寡核苷酸片段，其中包含了發(fā)生已知突變的部位，以此為探針，當與固定在膜上的樣品DNA雜交時，由于一個堿基的差異會導致Tm值下降5~7.5°C，因此通過嚴格控制雜交條件，可以鑒定出樣品DNA中是否存在突變。[0003]將ASO與PCR相結合的等位基因特異性聚合酶鏈式反應(AS-PCR)是目前一種常用于分析基因多態(tài)性，特別是單核苷酸多態(tài)性(SNP)的方法。多態(tài)性(polymorphism)是指在一個生物群體中，同時和經常存在兩種或多種不連續(xù)的變異型或基因型(genotype)或等位基因(allele),亦稱遺傳多態(tài)性(genetic polymorphism)或基因多態(tài)性。從本質上來講，多態(tài)性產生于基因水平上的變異，一般發(fā)生在基因序列中不編碼蛋白的區(qū)域和沒有重要調節(jié)功能的區(qū)域。單核苷酸多態(tài)性(SNP)，即散在的單個堿基的不同，包括單個堿基的缺失、插入和置換，其中以單個堿基置換的情形居多。SNP是目前倍受關注的一類多態(tài)性，由于其經常在遺傳疾病、疾病易感性、藥物不良反應性等研究中具有遺傳標記的作用，因此，其檢測為疾病診斷和早期診斷，藥物學研究等提供了巨大的潛在可能。
[0004]在AS-PCR中，PCR的引物之一或者兩個引物被設計成在序列變異的位點處退火，使其能夠區(qū)分同一基因的不同等位基因，這些等位基因類型包括堿基的替換、插入和缺失。AS-PCR利用了 DNA聚合酶的保真度:相比于3’端最后一個堿基正確匹配引物而言，3’端最后一個堿基錯配的引物在延伸效率上大大降低(通常為1/100至1/100,000)。3’端最后一個堿基錯配的引物由此導致延伸困難，PCR擴增減少，因此很容易通過檢測區(qū)分突變。
[0005]傳統(tǒng)AS-PCR的引物3’端最后一個堿基特別關鍵，必須為基因多態(tài)性位點。以檢測SNP為例，其原理如圖1所示。圖1A中，針對包含SNP位點的靶序列設計等位基因特異性引物(下稱AS引物)1-1、1-2，即，在常規(guī)PCR引物設計基礎上，使待測SNP位點恰好位于AS引物1-1、1-2的3’末端，即引物1-1與1-2僅3’末端的堿基不同(分別對應野生型和可能的突變型)，其余堿基序列一致，其中5’端X代表堿基上的羥基或磷酸基，3’端Y代表堿基上的羥基。圖1B中，2-1和2-2分別為等位基因所在的野生型和突變型DNA雙鏈，其中
2-lb和2-2b分別為與AS引物配對的模板鏈。如圖1C所示，按照3’端最后一個堿基嚴格互補配對的原理，實現(xiàn)等位基因的特異性擴增。也就是說，若圖1A中的AS引物與圖1B中的模板完全互補配對，則形成圖1C中3-1、3-2所示雙鏈結構，PCR反應順利進行，若形成圖1C中3-3、3-4所示情況，3’末端堿基錯配，則PCR反應不可進行。通過分析PCR擴增結果，判定SNP情況，若引物1-2擴增而引物1-1無明顯擴增，則表明存在所述突變。
[0006]傳統(tǒng)AS-PCR對DNA聚合酶的要求比較高。PCR(非AS-PCR)反應體系中常用的DNA聚合酶有A型和B型兩種，A型DNA聚合酶具有5’端到3’端的DNA聚合酶活性，如Taq DNA聚合酶等型DNA聚合酶不但具有5’端到3’端的DNA聚合酶活性，還具有3’端到5’端的DNA外切酶活性，可以即時識別并切除3’端的錯配堿基(因錯配導致翹起)，從而剩下未錯配的堿基得以繼續(xù)擴增，例如pfu DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶，等等。由于傳統(tǒng)AS-PCR正需要利用多態(tài)性位點的錯配引物，故而擴增反應中僅能使用A型DNA聚合酶，不能使用會將錯配堿基切除的B型DNA聚合酶。
[0007]圖2A和2B示意性地示出了 A型和B型DNA聚合酶在傳統(tǒng)PCR體系中的作用情況。其中，圖2A是A型DNA聚合酶在傳統(tǒng)PCR體系中的作用情況，當引物(3’端為羥基)與模板完全匹配時，在A型DNA聚合酶作用下引物得以擴增(左)，而當引物3’端與模板錯配時，退火溫度下錯配部分翹起，不能與模板結合，A型DNA聚合酶不起作用，引物不能擴增(右)，利用此特性，傳統(tǒng)AS-PCR得以實現(xiàn)等位基因多態(tài)性的檢測；圖2B是B型DNA聚合酶在傳統(tǒng)PCR體系中的作用情況，當引物與模板完全匹配時，在B型DNA聚合酶作用下引物得以擴增(左)，而當引物3’端與模板錯配時，錯配部分翹起，B型DNA聚合酶先發(fā)揮3’端到5’端的DNA外切酶作用，將錯配部分切除，剩下未錯配的引物在DNA聚合酶作用下得以繼續(xù)擴增(右)，這樣顯然無法用于傳統(tǒng)AS-PCR中鑒別等位基因多態(tài)性。
[0008]傳統(tǒng)AS-PCR技術存在以下缺點:
[0009]第一、由于AS引物要針對待測突變型進行設計，故而傳統(tǒng)AS-PCR技術僅能對已知的多態(tài)性位點進行檢測，不能檢測未知的突變類型。
[0010]第二、傳統(tǒng)AS-PCR技術在檢測擴增結果方面，一種是采用電泳分析方法，這種方式操作復雜費時，成本高，且技術較難普及；另一種是采用實時熒光定量PCR，這也需要額外合成標記有熒光基團和熒光猝滅基團的熒光探針。
[0011]因此，業(yè)界存在改良傳統(tǒng)AS-PCR技術的需要。

【發(fā)明內容】

[0012]本發(fā)明正是針對上述傳統(tǒng)AS-PCR的缺點作出。
[0013]本發(fā)明的目的和優(yōu)點一部分將在下面的描述中列出，另一部分對于本領域普通技術人員來說容易基于下面的描述而想到。
[0014]本發(fā)明的一個目的是提供一種AS-PCR引物的設計方法，所述方法包括以下步驟:(i )針對包含待測等位基因變異區(qū)域的靶序列設計AS-PCR引物；(ii )對步驟(i )所設計的AS-PCR引物進行修飾，使所述AS-PCR引物的3’端最后一個堿基帶有能夠屏蔽所述AS-PCR引物直接延伸的基團。利用本發(fā)明上述方法設計的引物可用于確定待測等位基因是否與已知基因類型不同的AS-PCR反應，例如用于區(qū)分野生型和突變型，而且與傳統(tǒng)AS-PCR引物設計不同，考慮待測等位基因的具體突變類型不再是必須的。
[0015]本發(fā)明另一個目的是提供一種AS-PCR基因多態(tài)性檢測方法，所述方法用于對可能包含等位基因變異區(qū)域的靶序列進行檢測以確定等位基因變體是否存在，其特征在于所述方法包括以下步驟:(i)針對所述可能包含等位基因變異區(qū)域的靶序列設計AS-PCR引物；(i i )對步驟(i )所設計的AS-PCR弓丨物進行修飾，使所述AS-PCR引物的3 ’端最后一個堿基帶有能夠屏蔽所述AS-PCR引物直接延伸的基團；(iii)使用步驟(ii)所修飾的AS-PCR引物對所述靶序列進行PCR擴增，所述PCR擴增使用B型DNA聚合酶；(iV)分析步驟(iii )的擴增結果確定所述等位基因變體是否存在。
[0016]上述AS-PCR引物設計方法和/或AS-PCR基因多態(tài)性檢測方法中，由于所設計的AS-PCR引物3’端具有能夠屏蔽引物直接延伸的基團，當與模板DNA結合時，若引物與模板完全互補，由于引物的3’進行了去羥基化修飾，無法與dNTP發(fā)生聚合反應，因此引物不延伸。反之，若引物與模板錯配，即不完全互補，則退火時錯配部分翹起不與模板結合，此時B型DNA聚合酶的3’端到5’端外切酶活性起作用，將引物3’端翹起的不互補配對的部分切除，剩余引物部分的3’端羥基露出(DNA鏈上dNTP之間的磷酸二酯鍵在B型DNA聚合酶作用下水解后，引物3’端產生羥基，水解下的dNTP或DNA鏈的5’端形成磷酸基)，如此，酶切后的引物即可在DNA聚合酶作用下延伸。
[0017]因此，與傳統(tǒng)AS-PCR相反，本發(fā)明的AS-PCR引物只有在錯配時才延伸，而與模板鏈互補時則不延伸，這樣就可以不區(qū)分突變類型而檢測等位基因多態(tài)性是否存在。具體而言，如果某一等位基因存在多種可能的突變，例如單個或多個堿基插入、缺失或替換，而人們僅需要檢測樣品是否存在突變而不必確定具體的突變類型時，則可以僅針對野生型設計AS-PCR引物，若擴增表明樣品存在突變，反之不擴增表明樣品為野生型。較之傳統(tǒng)AS-PCR引物，其在與模板鏈互補時延伸而發(fā)生錯配則不延伸，故要針對每一種突變設計引物，本發(fā)明的方法的優(yōu)點顯而易見。當然，本發(fā)明的引物設計方法也并不排除針對具體突變類型的檢測。[0018]在本發(fā)明的AS-PCR弓丨物設計方法和/或AS-PCR基因多態(tài)性檢測方法中，優(yōu)選地，步驟(i)中所述等位基因變異區(qū)域位于所述AS-PCR引物的3’端的第I~6個堿基中，所述引物的長度為18bp~30bp。這樣使得B型DNA聚合酶酶切識別區(qū)域盡可能靠近引物3’末端，且被酶切后仍具有足夠的鏈長，以免酶切后的引物過短而容易從模板鏈上脫落，降低擴增效率。
[0019]優(yōu)選地，使在擴增反應中所述AS-PCR引物的5’端到所述等位基因變異區(qū)域的Tm值在48°C~52°C。隨著Tm增高，引物與模板錯配幾率增大，隨著Tm降低，引物從模板上脫落幾率增大。
[0020]在本發(fā)明的AS-PCR引物設計方法和/或AS-PCR基因多態(tài)性檢測方法中，步驟
(ii)對所述AS-PCR引物3’端的修飾包括但不限于脫羥基、羥基位置修飾氨基、羥基位置修飾羧基、羥基位置修飾巰基或羥基位置修飾磷酸基，等等。更優(yōu)選地，步驟(ii)對所述AS-PCR引物3’端的羥基位置修飾為標記熒光淬滅基團，并且步驟(ii)進一步包括對所述AS-PCR引物的5’端標記熒光基團。這樣，標記的AS-PCR引物可直接用作實時熒光PCR的探針，實現(xiàn)引物和探針的合二為一。標記所述AS-PCR引物5’端的所述熒光基團包括但不限于:FAM、VIC、HEX、ROX、Taxas Red或CY5，等等，標記所述AS-PCR引物3’端的所述熒光淬滅基團包括但不限于:BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyle、Temra、Eclipse,等等。上述突光基團和熒光猝滅基團及其標記方法是本領域已知的。
[0021]圖3A和3B示意性地示出了 B型DNA聚合酶在本發(fā)明的AS-PCR體系中的作用原理。圖3A中引物3’端連接有屏蔽引物延伸的基團Y’，圖3B中引物5’端連接有熒光基團Xtl, 3’端連接有淬滅基團Y0。當引物與模板完全匹配時，由于3’端羥基被屏蔽，引物無法擴增(左)，而當引物3 ’端堿基與模板錯配時，退火溫度下錯配部分翹起，B型DNA聚合酶先發(fā)揮3’端到5’端的DNA外切酶作用，將錯配部分切除，剩下未錯配的引物在DNA聚合酶作用下得以繼續(xù)擴增(右)。
[0022]在本發(fā)明的AS-PCR基因多態(tài)性檢測方法中，步驟(iii)的所述B型DNA聚合酶包括但不限于Pfu DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶，等等。所述B型DNA聚合酶是本領域已知的，并且可以從公開渠道獲得，例如，Pfu DNA聚合酶可從TAKARA采購；K0D DNA聚合酶可從Τ0Υ0Β0 采購。
[0023]本發(fā)明另一個目的是提供一種AS-PCR基因多態(tài)性檢測試劑盒，其中至少包含以下成分:a.上述AS-PCR基因多態(tài)性檢測方法的步驟(i)- (ii)所設計AS-PCR引物；b.上述AS-PCR基因多態(tài)性檢測方法的步驟(iii )中使用的B型DNA聚合酶。
[0024]相較于傳統(tǒng)AS-PCR單一的檢測位點能力，本發(fā)明的突變識別引物設計方法和檢測方法及試劑盒可以模糊識別突變位點，即用野生型作為突變檢測序列，而不必考慮具體突變類型。這在復雜的人腫瘤基因變異檢測中，如人EGFR (表皮生長因子受體)基因第19外顯子發(fā)生的40種以上的突變，或者人C-KIT (酪氨酸激酶的亞類之一)基因第11外顯子25種以上的突變，僅需設計一條或幾條與突變熱點區(qū)域序列對應的野生型標記引物即可。因此相較于傳統(tǒng)AS-PCR節(jié)約了引物合成成本、設計時間，設計也方便易懂，容易掌握。
[0025]本發(fā)明的另一優(yōu)點是可以將引物與探針合二為一，實現(xiàn)了 AS-PCR的實時檢測，相較于傳統(tǒng)AS-PCR的雜交或電泳檢測方式，減少了操作步驟，且閉管檢測，極大降低后PCR產物污染的可能性；而相較于將探針和引物分開設計的傳統(tǒng)實時熒光AS-PCR，本發(fā)明也大大降低了合成成本。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]為讓本發(fā)明的上述和其他目的、特征、優(yōu)點與實施例能更明顯易懂，對所附圖的說明如下:
[0027]圖1示意性地示出了傳統(tǒng)AS-PCR檢測SNP的原理；
[0028]圖2A-2B示意性地示出了 A型和B型DNA聚合酶在PCR體系中的作用情況，其中，圖2A是A型DNA聚合酶在PCR體系中的作用情況，圖2B是B型DNA聚合酶在PCR體系中的作用情況；
[0029]圖3A和3B示意性地示出了 B型DNA聚合酶在本發(fā)明的AS-PCR體系中的作用原理；
[0030]圖4A和4B為根據(jù)本發(fā)明方法檢測得到的雜合型和純合型樣品的典型擴增結果圖。
【具體實施方式】
[0031]為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚，以下結合附圖及【具體實施方式】，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的【具體實施方式】僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0032]實施例1.人亞甲某四氧葉酸還原酶(MTHFR)某閔多杰件AS-PCR檢測:
[0033]PCR的具體步驟條件可參考《分子克隆實驗指南(第三版)》(第8章“聚合酶鏈式反應體外擴增DNA”，597-701頁，科學出版社，2002年8月)的記載。
[0034]1.1.人MTHFR基因多態(tài)性AS-PCR引物設計:
[0035]人MTHFR-Ol 用于檢測 SNP (GTCTGCGGGAG A/C CGATTTCAT)位點 T 等位基因、人MTHFR-02 用于檢測 SNP (GTCTGCGGGAG A/CCGATTTCAT)位點 C 等位基因、人 MTHFR-03 為下游引物。
[0036]
【權利要求】
1.一種AS-PCR引物的設計方法，所述方法包括以下步驟: (i)針對包含待測等位基因變異區(qū)域的靶序列設計AS-PCR引物； (?)對步驟(i)所設計的AS-PCR弓丨物進行修飾，使所述AS-PCR引物的3’端最后一個堿基帶有能夠屏蔽所述AS-PCR引物直接延伸的基團。
2.—種AS-PCR基因多態(tài)性檢測方法，所述方法用于對可能包含等位基因變異區(qū)域的靶序列進行檢測以確定等位基因變體是否存在，其特征在于所述方法包括以下步驟: (i)針對所述可能包含等位基因變異區(qū)域的靶序列設計AS-PCR引物； (?)對步驟(i)所設計的AS-PCR弓丨物進行修飾，使所述AS-PCR引物的3’端最后一個堿基帶有能夠屏蔽所述AS-PCR引物直接延伸的基團； (iii)使用步驟(ii)所修飾的AS-PCR引物對所述靶序列進行PCR擴增，所述PCR擴增使用B型DNA聚合酶 ； (iv)分析步驟(iii)的擴增結果確定所述等位基因變體是否存在。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其中步驟(i)中所述等位基因變異區(qū)域位于所述AS-PCR引物的3’端的第I~6個堿基中，所述引物的長度為18bp~30bp。
4.根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其中使在擴增反應中所述AS-PCR引物的5’端到所述等位基因變異區(qū)域的Tm值為48°C~52°C。
5.根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其中步驟(ii)對所述AS-PCR引物3’端的修飾包括但不限于脫羥基、羥基位置修飾氨基、羥基位置修飾羧基、羥基位置修飾巰基或羥基位置修飾磷酸基。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其中步驟(ii)對所述AS-PCR引物3’端的羥基位置修飾為標記熒光淬滅基團，并且步驟(ii)進一步包括對所述AS-PCR引物的5’端標記熒光基團。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中標記所述AS-PCR引物5’端的所述熒光基團選自下列物質所構成的組:FAM、VIC、HEX、ROX、Taxas Red或CY5，標記所述AS-PCR引物3’端的所述突光淬滅基團選自下列物質所構成的組:BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyle、Temra或Eclipse。
8.根據(jù)權利要求2至7中任一項所述的方法，其中步驟(iii)的所述B型DNA聚合酶為pfu DNA聚合酶或KOD DNA聚合酶。
9.一種AS-PCR基因多態(tài)性檢測試劑盒，其中至少包含以下成分: a.根據(jù)權利要求2至8中任一項所述的方法步驟(i)_(ii)所設計的AS-PCR引物； b.根據(jù)權利要求2至8中任一項所述的方法步驟(iii)中使用的B型DNA聚合酶。
【文檔編號】C12N15/11GK103911445SQ201410106312
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年3月20日 優(yōu)先權日:2014年3月20日
【發(fā)明者】劉小芳, 黃蔚, 李丙亮 申請人:劉小芳