專利名稱：人源抗甲肝病毒中和性基因工程Fab抗體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及預防和治療用人源基因工程單克隆抗體的制備及應用，尤其是特異性什對甲肝病毒VP1蛋白的中和性基因工程單克隆抗體。
自1975年B淋巴細胞雜交瘤細胞融合技術問世以來，單克隆抗體作為一類用于基礎研究，實驗室診斷，臨床治療和預防的新型產(chǎn)物，其運用價值和開發(fā)前景已獲得普遍的肯定。分子生物學和分子免疫學的研究發(fā)展導致了基因工程抗體的產(chǎn)生和發(fā)展。通過抗體分子基因水平的重組可獲得多種多樣的特異性鼠源及人源抗體，使對單克隆抗體的研究有了突破性進展并越來越顯示出其重要意義及實際運用前景。80年代末90年代初興起的噬菌體抗體基因庫技術興起和整個基因工程抗體技術研究領域的發(fā)展，使當今世界人源或基因工程抗體的開發(fā)研究取得很大進展并已由基礎研究階段步入實質性應用研究和開發(fā)階段。目前美國FDA批準上市或待批的生物制品中，各種形式的單克隆抗體和基因工程抗體占到一定比例，目前以批準上市的67種生物制品中，治療和預防用單克隆抗體和基因工程抗體共有9種。正在待批中等抗體有35種(。其中已批準上市并且產(chǎn)生巨大經(jīng)濟和社會效益的四種人源化基因工程抗體中，其中有一種即為抗病毒基因工程抗體，其商品名為“SynagisTM″，為人源化抗呼吸道合病毒(RSV)基因工程抗體，而來源于噬菌體抗體庫篩選的人源抗RSV病毒基因工程抗體已被批準進入Ⅱ期臨床，另一種抗病毒抗體抗乙型肝炎表面抗原抗體也在審批之中。
至今為止，大多數(shù)病毒性疾病無特異性治療藥物，用于臨床治療和預防某些病毒性疾病的生物制品仍然以血制品為主，如多年來臨床上使用的血源性丙種球蛋白，用于甲肝或乙肝病毒引起的病毒性肝炎以及麻疹等，這些血制品中不僅非特異性雜蛋白多，特異性抗體含量很低，而且最大的問題是血源制品潛在的未能檢出的病原污染問題，從長遠利益考慮應當摒棄。因此以人源基因工程產(chǎn)品替代血制品已成為國內(nèi)外研究的一大方向，并正在逐步走向成功。用純鼠源單克隆抗體預防和治療病毒性疾病在國際上尚無任何批準的先例，國內(nèi)有提出申請用于抗腦炎和出血熱的臨床治療，鼠源抗體人用最大的不利之處為異源蛋白，在人體內(nèi)易引起遺傳免疫排斥而使抗體失效并引起免疫性疾病。因此，特異性抗病毒人源中和性抗體是病毒性疾病預防和治療的最有前景的生物制品之一。人源抗病毒基因工程抗體的研究除已成功的抗RSV抗體外，通過噬菌體表面呈現(xiàn)系統(tǒng)，基因工程抗體庫技術和分子生物學手段的聯(lián)合運用，這一領域的研究已取得重大進展目前已研制成功的人源抗病毒抗體有抗以下病毒的抗體呼吸道合胞病毒，愛滋病毒(HIV)，乙肝病毒，丙肝病毒，單純皰疹病毒(HSV)，漢坦病毒，B19病毒，CMV病毒等以及尚未發(fā)表的本所已研制成功的抗甲型肝炎病毒，狂犬病毒抗體等?？辜赘慰贵w制劑研制成功，將為國內(nèi)外首創(chuàng)，有可能獲一類新藥正書。
本發(fā)明的目的是通過基因工程手段和噬菌體表面表達技術結合運用，直接從人抗體基因庫中篩選出中和性抗甲肝病毒的基因工程單克隆抗體，獲得其抗體基因，為將來可能的臨床抗病毒預防和治療提供可行性的特異性抗體藥物。
本發(fā)明陳述的人源抗甲肝病毒中和性基因工程Fab抗體包括(1)為一種人源的在原核細胞中獲得穩(wěn)定有效表達的重組IgG Fab抗體，由重鏈Fd和輕鏈Lambda鏈組成，命名為HAFab16。
(2)其抗體蛋白功能由存在于抗體基因輕鏈和重鏈可變區(qū)的決定族互補區(qū)域(Complementarity-Dertemining Regions,CDRs)CDR1、CDR2和CDR3中特異性核苷酸序列決定的，其相應的氨基酸序列構成了抗體的特異性抗原結合區(qū)域。
(3)特異性的輕鏈和重鏈基因來源于對人源抗甲肝病毒抗體基因庫的特異性富積篩選表達，輕鏈和重鏈相應的三個CDR區(qū)序列為本抗體特有的全新序列，其重鏈CDR1區(qū)氨基酸序列為DYGLS；CDR2區(qū)為YINRNGYRTGYADSVKG；CDR3區(qū)為RYNYGVQYYFDY。其輕鏈CDR1區(qū)氨基酸序列為SGTSSNIGNNYVS；CDR2區(qū)為DNNKRPS；CDR3區(qū)為CGTWDSSLSGVV。
(4)特異性識別甲肝病毒VP1蛋白，并具有抗甲肝病毒感染的中和活性(5)利用上述獲得的中和性Fab抗體基因，可以在原核細胞、酵母細胞、真核細胞及任何重組病毒系統(tǒng)中表達此抗體基因或以此為基礎的改建后的含有此抗體基因任何其他基因，獲得具有中和甲肝病毒感染的抗體產(chǎn)物，可在臨床上用于預防和治療由甲肝病毒引起的甲型肝炎。
傳統(tǒng)的利用雜交瘤細胞技術獲得人源單克隆抗體相當困難，而且建立的細胞系通常不穩(wěn)定，基因易丟失。本發(fā)明陳述的人源抗甲肝病毒中和性基因工程Fab抗體，是在獲得抗體基因的基礎上獲得基因產(chǎn)物的表達，此抗體基因可隨著質粒DNA在細菌內(nèi)的復制而穩(wěn)定復制，并可根據(jù)不同需要任意改建抗體基因，從而獲得一種可行性的臨床治療用抗體制劑。
以下的優(yōu)先實施例對本發(fā)明作詳細說明，擔不意味著限制本發(fā)明的內(nèi)容。在這些實施例中，為說明本發(fā)明，采用噬菌體表達載體為pComb3(Barbas C.Ⅲ et al,Proc.Natl.Acas.Sci USA 1991,89:10164-10168)。所用主要菌株為商品化產(chǎn)品XLI-Blu(美國Strategene公司)。所用噬菌體為VCSM13。甲肝病毒為從我國病人分離的龍甲株。
實施例1-4為人源抗甲肝病毒中和性基因工程Fab抗體HAFab16的篩選制備方法；實施例5為人源抗甲肝病毒中和性基因工程Fab抗體HAFab16的基因特征；實例6-9為人源抗甲肝病毒中和性基因工程Fab抗體HAFab16的蛋白及功能特征。
實例1人源IgG Fab段基因的PCR擴增用淋巴細胞分離液甲肝病人恢復期抗凝血中分離淋巴細胞，用Tril-Zon(美國Gibco,BRL)提取總細胞RNA，用Olig-dT引物將提取的RNA通過逆轉錄酶(美國Gibco,BRL)逆轉錄成cDNA，用一組特異性IgGFabGamma鏈、Kampa鏈及Lamda鏈引物(表1)，對人源輕鏈和重鏈Fab基因進行PCR擴增。PCR條件為94℃ 1分鐘，54℃1分鐘、72℃ 2分鐘，35個循環(huán)(PE480)，上述PCR產(chǎn)物分別經(jīng)瓊脂糖凝膠回收，經(jīng)過DNA純化柱Spin-X(美國Gibco,BRL)純化后，獲得650-700bp左右的Kamba、Lamda和Fd鏈PCR產(chǎn)物。
實例2噬菌體抗體基因庫的建立將不同引物合成的Kamba和Lamda鏈PCR產(chǎn)物混合，將不同引物合成的Fd鏈混合，分別用SacⅠ/XbaⅠ和XhoⅠ/SpeⅠ克隆入噬菌體載體pComb3，將克隆入輕，重鏈基因的pComb3載體DNA連接產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀后，用10ul蒸溜水懸起，電轉導入事先制備好的200ul電轉菌XLI-Blu，(電轉條件為Bio-Red電轉儀，0.2cm電轉杯，2.5K伏)，電轉后加10mlSOC培養(yǎng)液，37℃ 1小時，加入10ml帶有氨芐青霉素和四環(huán)素的SB培養(yǎng)液(3),37℃ 1小時，加入80-100ml前述SB,37℃ 2小時后加入輔助噬菌體M13GCM 1 X10 12,1小時后加入卡那霉素(70ug/ml),37℃搖床培養(yǎng)過夜。用4％PEG8000和3％NaCl沉淀噬菌體上清，經(jīng)9000 rpm,20分鐘，4℃離心后，用2m1 0.02M PBS PH7.4重懸沉淀，建立噬菌體抗體庫，分裝保存于-20℃冰柜中。
實例3用于抗體庫富集篩選的甲肝病毒抗原的制備甲肝病毒在Frhk4細胞上培養(yǎng)21天后收獲，基本按文獻(Hughes,J.V.,L.W.Stanton,J.E.Tomassini,et alNeutralizing monoclonal antibodies to hepatitis A virus:partial localizationof a neutralizing antigenic site.J.Virol,52:465-473.1984)方法通過蔗糖墊層超速離心純化甲肝病毒抗原，純化后的甲肝抗原可直接用于包被ELISA板。
實例4富集篩選采用純化的甲肝病毒包被ELISA板，對上述建立的人抗甲肝病毒抗體庫進行了4輪富集篩選。我們對每輪篩選后隨機挑取的克隆進行了限制性內(nèi)切酶酶切鑒定分析。用XbaⅠ/XhoⅠ酶切后，帶噬菌體基因Ⅲ和人抗體Fab段輕重鏈基因插入的克隆應切出約2.2Kb的條帶以及3.0Kb的載體帶。隨篩選輪數(shù)的增加，帶有雙鏈基因插入的克隆也逐漸增加，到最后一輪約有90％克隆顯示有重鏈和輕鏈基因的插入。
實例5人IgGFab抗體HAFab16的可變區(qū)基因的核酸序列分析用QiagenMiniprep Kit(美國Qiagen)制備質粒DNA進行核酸序列分析。測序為自動測序。至少3個克隆被用于確定同一相同的序列。所獲序列均用DNA Strider(美國微軟公司)序列分析軟件進行分析處理，并比較Internet網(wǎng)絡上基因庫中的IgG序列。證實人源抗甲肝病毒中和性基因工程Fab抗體HAFab16基因由人IgGγ鏈Fd和λ鏈組成，其基因特征由VH和VL結構域中的6個CDR區(qū)的特異性核甘酸序列和氨基酸構成，即VH-CDR1,VH-CDR2,VH-CDR3和VL-CDR1,VL-CDR2和VL-CDR3。序列資料如附
圖1，是抗體HAFab16的可變區(qū)基因的核酸序列和氨基酸序列。
實例6將帶有HAFa16抗體輕重鏈基因插入的陽性克隆擴增后按常規(guī)方法提取質粒DNA，用SpeⅠ和NpeⅠ切除載體中的gⅢ，變FdgⅢ融合蛋白為獨立表達的蛋白，連接后轉化XLl一Blu菌，從過夜生長的氨芐碟子中挑取單個菌落，接種SB或TB細菌培養(yǎng)液，當細菌長至OD=0.2-0.3，加入1mM IPTG，在30℃誘導表達10-12小時。收獲細菌，離心后加入原培養(yǎng)液10倍濃縮量的PBS(0.02M PH7.4)懸起，反復凍融3次，高速離心后其上清即為表達的Fab抗體。
實例7從甲肝病人恢復期血中分離淋巴細胞，用PCR技術擴增了人源IgG Fab抗體基因，建立了噬菌體抗體基因庫，用噬菌體表面呈現(xiàn)技術篩選到了12株抗甲肝病毒Fab抗體基因，如圖2，是人源抗甲肝病毒基因工程Fab抗體與純化甲肝病毒抗原ELISA結合和與HRP標記的鼠抗甲肝病毒Mabs的競爭結合。圖2同時表明，篩選出的12株抗甲肝病毒Fab抗體包括HAFab16均能良好地競爭HRP標記的中和性鼠抗甲肝單克隆抗體Mab37，而這株Mab已被確定與國際上公認的鼠抗甲肝VP1蛋白的中和抗體K3-4C8和K2-4F2完全競爭。
實例8從獲得的上述Fab抗體中選出兩株Fab抗體Fab9和Fab16進行進一步研究，如圖3顯示大腸桿菌表達的Fab抗體粗制品與未標記的國際標準株單抗K3-4C8和K2-4F2競爭ELISA。Fab16能和上述兩株抗VP1蛋白單抗結合。說明其可能針對甲肝病毒VP1蛋白。圖4顯示抗體Fab9和Fab16與甲肝病人血清的良好競爭。表明這兩株抗體針對甲肝病毒主要抗體決定簇。
實例9細胞中和試驗為了解所獲得的人抗甲肝病毒Fab抗體是否具有體外中和活性，對上述8株陽性克隆表達后的細菌裂解上清進行了體外中和實驗，結果表明所有HAFab16抗體據(jù)有體外中和甲肝病毒的活性(即ELISA檢測甲肝病毒為陰性)，而陰性對照則不能中和甲肝病毒(即檢測甲肝病毒為陽性)，如下面表1，是重組抗HAVFab抗體對甲肝病毒的中和活性。表1樣本 中和試驗所用病毒量TCID50病毒檢測結果/管數(shù)重組抗體Fab9(1∶2稀釋) 30 0/4重組抗體Fab16(1∶2稀釋)30 0/4陽性血清對照(1∶100稀釋) 30 0/4陰性菌裂解上清對照(1∶2稀釋) 30 4/4+病毒對照 30 4/4正常細胞對照0 0/權利要求
1.人源抗甲肝病毒中和性基因工程抗體，其特征在于(1)為一種在原核細胞中獲得穩(wěn)定有效表達的基因重組的人源抗甲肝病毒糖蛋白VP1中和性基因工程單克隆抗體Fab抗體，由Fd和Lambda鏈組成。(2)其抗體蛋白功能由存在于抗體基因輕鏈和重鏈可變區(qū)的決定族互補區(qū)域(Complementarity-Dertemining Regions,CDRs)CDR1、CDR2和CDR3中特異性核苷酸序列決定的，其相應的氨基酸序列構成了抗體的特異性抗原結合區(qū)域，如摘要附圖。(3)特異性的輕鏈和重鏈基因來源于對人源抗甲肝病毒抗體基因庫的特異性富積篩選表達，其相應的三個CDR區(qū)序列為本抗體特有的全新序列其重鏈CDR1區(qū)氨基酸序列為DYGLS；CDR2區(qū)為YINRNGYRTGYADSVKG；CDR3區(qū)為RYNYGVQYYFDY。其輕鏈CDR1區(qū)氨基酸序列為SGTSSNIGNNYVS；CDR2區(qū)為DNNKRPS；CDR3區(qū)為CGTWDSSLSGVV。(4)特異性識別甲肝病毒VP1蛋白，并具有抗甲肝病毒感染的中和活性
2.人源抗甲肝病毒中和性基因工程Fab抗體的用途，其特征在于利用上述獲得的中和性Fab抗體基因，可以在原核細胞、酵母細胞、真核細胞及任何重組病毒系統(tǒng)中表達此抗體基因或以此為基礎的改建后的含有此抗體基因任何其他基因，獲得具有中和甲肝病毒感染的抗體產(chǎn)物，可在臨床上用于預防和治療由甲肝病毒的甲型肝炎。
3.根據(jù)權利要求1人源抗甲肝病毒中和性基因工程Fab抗體，其特征在于編碼所述特異性Fab抗體蛋白的基因為人源抗甲肝病毒中和性抗體基因，可被用于任何表達系統(tǒng)表達抗甲肝病毒中和抗體。
4.根據(jù)權利要求1人源甲肝病毒中和性基因工程Fab抗體，其特征在于編碼所述特異性Fab抗體蛋白的基因為人源中和性抗甲肝病毒抗體基因，其核苷酸序列或由此產(chǎn)生的氨基酸序列可被用于相關基因的改造，而表達抗甲肝病毒VP1蛋白的中和性抗體或多肽產(chǎn)物。
5.根據(jù)權利要求1人源抗?jié)h坦病毒糖蛋白中和性基因工程單克隆抗體Fab抗體，其特征在于所述抗體具有識別甲肝病毒VP1蛋白上中和抗原，從而阻斷甲肝病毒毒感染的功能，其基因表達產(chǎn)物可望在臨床上用于預防和治療由甲肝病毒引起的甲型病毒性肝炎。
全文摘要
人源抗甲肝病毒中和性基因工程Fab抗體，包括Fab段抗體基因、基因產(chǎn)物及其應用。其特征在于此重組抗體是由存在于抗體輕鏈和重鏈基因可變區(qū)中的高變區(qū)(CDRs)特異性基因序列決定的并在原核細胞中獲得有效表達的特異性結合甲肝病毒的功能性中和抗體。其今后的可能用途在于利用上述獲得的中和性Fab抗體或IgG全抗體基因，可以在原核細胞、孝母細胞、昆蟲細胞和真核細胞及任何表達系統(tǒng)中生產(chǎn)此抗體，可在臨床上預防或治療甲型肝炎。
文檔編號A61K39/42GK1316437SQ0013228
公開日2001年10月10日 申請日期2000年11月22日 優(yōu)先權日2000年5月12日
發(fā)明者梁米芳, 曹經(jīng)瑗 申請人:中國預防醫(yī)學科學院病毒學研究所