敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白及其應(yīng)用的制作方法【專利摘要】本發(fā)明關(guān)于一種敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白及其應(yīng)用，包含至少一個敗血性巴氏桿菌毒素蛋白的抗原決定位；當(dāng)該抗原決定位為復(fù)數(shù)個時，各抗原決定位的間可由連接子連接。該重組蛋白進一步可包含至少一個單元的補體裂解片段C3d的氨基酸序列，且該抗原決定位與該補體裂解片段C3d的氨基酸序列可以連接子連接。本發(fā)明并關(guān)于一種編碼如上述敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白的核苷酸序列，以及一種含有上述敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白的豬萎縮性鼻炎免疫組合物?！緦＠f明】敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白及其應(yīng)用【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明關(guān)于敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白在動物保健領(lǐng)域上的應(yīng)用，特別是關(guān)于含有敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白的豬萎縮性鼻炎免疫組合物在動物保健領(lǐng)域上的應(yīng)用?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]豬萎縮性鼻炎（AtrophicRhinitis,AR)為豬只呼吸系統(tǒng)的三大主要傳染病之一。豬萎縮性鼻炎會造成受感染的豬只的顏面骨畸形及慢性化膿性鼻炎，而引起鼻甲介骨的萎縮。在嚴(yán)重感染時，鼻腔、額骨、上額骨亦會發(fā)生病變。下鼻甲骨的下游窩狀部位最常受感染。上鼻甲、下鼻甲骨、鼻中膈或篩骨等部位均會被感染。[0003]豬萎縮性鼻炎（AR)是由支氣管敗血性博德氏桿菌（Bordetellabronchiseptica)以及敗血性巴氏桿菌（Pasteurellamultocida)A型菌（PmA)及D型菌(PmD)所引起，尤其是敗血性巴氏桿菌D型菌（PmD)所產(chǎn)生的毒素（Pasteurellamultocidatoxin，PMT)。取PMT毒素分別以肌肉、腹腔及鼻腔接種等方式接種于四周齡小豬，均可以引致鼻甲介骨萎縮的病變產(chǎn)生，此外也會波及全身性骨骼發(fā)育而使生長遲緩，甚至高劑量接種時，會導(dǎo)致肝臟受損而造成豬只黃疸及死亡。[0004]豬萎縮性鼻炎（AR)遍及世界各養(yǎng)豬地區(qū)，患豬生長緩慢，飼料利用效率降低。單獨感染時雖然死亡率不高，但污染率卻很大，而且容易誘發(fā)其他合并癥或病原的感染，造成高死亡率,增加生產(chǎn)成本。在豬萎縮性鼻炎（AR)嚴(yán)重感染的養(yǎng)豬場，其經(jīng)濟損失約為15-38%，且在重度感染的養(yǎng)豬場有較明顯的生長障礙情形，平均日增重約較正常豬只少5-8%。因此開發(fā)有效的豬萎縮性鼻炎疫苗，以預(yù)防豬只罹患豬萎縮性鼻炎（AR)可以說是刻不容緩且極為重要的事。【
發(fā)明內(nèi)容】[0005]本發(fā)明于第一部分提供一種敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白（recombinantPMT，rPMT)，該重組蛋白包含至少一個敗血性巴氏桿菌毒素蛋白（PMT)的抗原決定位(印itopes)，以誘導(dǎo)動物產(chǎn)生抗敗血性巴氏桿菌毒素蛋白（PMT)的抗體。該敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白（rPMT)可進一步含有補體裂解片段C3d的全長或部分氨基酸序列，以增加特異性免疫反應(yīng)。且各個該敗血性巴氏桿菌毒素蛋白（PMT)的抗原決定位之間、各個該補體裂解片段C3d的全長或部分氨基酸序列之間、以及敗血性巴氏桿菌毒素蛋白（PMT)的抗原決定位與補體裂解片段C3d的全長或部分氨基酸序列之間可進一步由連接子連接。[0006]本發(fā)明所提供的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白（rPMT)，可以由下式所表示：[0007]片段）n;[0008]其中每一個A代表一個獨立的敗血性巴氏桿菌毒素蛋白的抗原決定位，每一個A系各自獨立選自于由SEQIDN0s:2、3、4、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41及42所組成的群組；[0009]其中每一個C3d片段代表一個獨立的補體裂解片段C3d的氨基酸序列，每一個C3d片段系各自獨立選自于SEQIDN0s:6、7、8及9所組成的群組；[0010]其中m是代表從1至約30的整數(shù)；[0011]其中η是代表從0至約10的整數(shù)。[0012]本發(fā)明于第二部分提供一種編碼一敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白（rPMT)的核苷酸序列。該敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白（rPMT)包含至少一個敗血性巴氏桿菌毒素蛋白(PMT)的抗原決定位，以及重復(fù)0至10個單元的補體裂解片段C3d的部分氨基酸序列。[0013]本發(fā)明于第三部分提供一種豬萎縮性鼻炎免疫組合物。該豬萎縮性鼻炎免疫組合物含有一敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白（rPMT)以及一藥學(xué)上可接受的載劑。該敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白（rPMT)包含至少一個敗血性巴氏桿菌毒素蛋白（PMT)的抗原決定位(epitopes)，以及重復(fù)0至10個單元的補體裂解片段C3d的部分氨基酸序列。該豬萎縮性鼻炎免疫組合物可進一步含有支氣管敗血性博德氏桿菌（B.bronchis印tica)、敗血性巴氏桿菌A型菌（PmA)以及敗血性巴氏桿菌D型菌（PmD)。[0014]本發(fā)明于第四部分中提供一種動物對抗豬萎縮性鼻炎的方法，包含使用有效量的上述免疫組合物以施予動物，以增強該動物對抗豬萎縮性鼻炎的免疫力，進而提升、改善其臨床癥狀、存活率、及增重趨勢。[0015]本發(fā)明于第五部分中提供一種抗敗血性巴氏桿菌D型菌毒素（PMT)的抗體，系藉由本發(fā)明所提供的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白（rPMT)所制備或衍生而得；該抗體包括但不限于：單株抗體、多株抗體，以及經(jīng)基因重組的抗體。[0016]本發(fā)明于第六部分中提供一種豬萎縮性鼻炎的檢測套組，該檢測套組系用以偵測檢驗樣本是否含有敗血性巴氏桿菌D型菌毒素（PMT)或偵測檢驗樣本內(nèi)是否含有抗敗血性巴氏桿菌D型菌毒素（PMT)的抗體。[0017]本發(fā)明所提供的豬萎縮性鼻炎免疫組合物，與其他習(xí)用技術(shù)相互比較時，更具有下列的優(yōu)點：[0018]本發(fā)明所提供的豬萎縮性鼻炎免疫組合物含有一敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)。該敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白（rPMT)包含至少一個敗血性巴氏桿菌毒素蛋白(PMT)的抗原決定位（印Hopes)以及補體裂解片段C3d的部分氨基酸序列。該敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白（rPMT)遠(yuǎn)比敗血性巴氏桿菌毒素蛋白（PMT)的全長氨基酸序列短，在生物表現(xiàn)系統(tǒng)中較容易表達(dá)，且重組蛋白的產(chǎn)率較高，可降低制造疫苗的成本。[0019]此外，本發(fā)明所提供的豬萎縮性鼻炎免疫組合物所含的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白（rPMT)具有補體裂解片段C3d的部分氨基酸序列，因此可以增加特異性免疫反應(yīng)，經(jīng)試驗結(jié)果顯示，本發(fā)明所提供的豬萎縮性鼻炎免疫組合物可提高動物對抗豬萎縮性鼻炎的免疫性及效率。[0020]本發(fā)明系以下面的實施例予以示范闡明，但本發(fā)明不受下述實施例所限制?！緦＠綀D】【附圖說明】[0021]圖1為以酵素連結(jié)免疫分析（ELISA)測定抗敗血性巴氏桿菌毒素（PMT)抗體力價的結(jié)果；第1組為負(fù)對照組；第2組為含有實施例二所得的支氣管敗血性博德氏桿菌、敗血性巴氏桿菌A型菌及敗血性巴氏桿菌D型的免疫組合物（B.b+PmA+PmD組）；第3組為實施例一所得的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白（rPMT組）；第4組為含有敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白的豬萎縮性鼻炎免疫組合物（B.b+PmA+PmD+rPMT組）；第5組為市售豬萎縮性鼻炎疫苗（Bayovac組）。符號**代表兩組之間具有顯著差異（p〈0.01)[0022]圖2為中和抗體試驗分析結(jié)果；圖2A為以含胎牛血清（FBS)的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)Vero細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)（負(fù)對照組）；圖2B為以含4倍最小毒性劑量（MTD)的敗血性巴氏桿菌毒素（PMT)處理Vero細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)（正對照組），可見到細(xì)胞呈現(xiàn)典型的結(jié)節(jié)樣；圖2C為以免疫含有敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白的豬萎縮性鼻炎免疫組合物(B.b+PmA+PmD+rPMT組）的小鼠血清稀釋40倍后與4倍最小毒性劑量（MTD)的敗血性巴氏桿菌毒素（PMT)中和后，加入Vero細(xì)胞共培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)。[0023]圖3為以酵素連結(jié)免疫分析（ELISA)測定抗敗血性巴氏桿菌毒素（PMT)抗體力價的結(jié)果；第1組為負(fù)對照組；第2組為含有實施例二所得的支氣管敗血性博德氏桿菌、敗血性巴氏桿菌A型菌及敗血性巴氏桿菌D型的免疫組合物（B.b+PmA+PmD組）；第3組為含有敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白的豬萎縮性鼻炎免疫組合物（B.b+PmA+PmD+rPMT組）。符號**代表兩組之間具有顯著差異（P〈〇.01)。【具體實施方式】[0024]本發(fā)明提供一種敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白（rPMT)，包含至少一個敗血性巴氏桿菌毒素蛋白（PMT)的抗原決定位，以誘導(dǎo)動物產(chǎn)生抗敗血性巴氏桿菌毒素蛋白（PMT)的抗體。[0025]于一實施例中，該敗血性巴氏桿菌毒素蛋白（PMT)的抗原決定位系分別具有如SEQIDN0s:20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41及42所示的氨基酸序列，該敗血性巴氏桿菌毒素蛋白（PMT)的抗原決定位可為1至約30個，且各抗原決定位氨基酸序列自蛋白質(zhì)N端到C端的排列順序并不限于依照序列辨識號(SEQIDN0)的順序排列。[0026]于一較佳實施例中，分別以三段較長的抗原決定位氨基酸序列涵蓋部分上述敗血性巴氏桿菌毒素蛋白（PMT)的抗原決定位，該三段較長的抗原決定位氨基酸序列系分別如SEQIDN0s:2、3、4所示。于一實施例中，本發(fā)明的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白（rPMT)含有如SEQIDN0:2所示的氨基酸序列所涵蓋的抗原決定位。于另一實施例中，該敗血性巴氏桿菌毒素蛋白（PMT)含有如SEQIDN0:3所示的氨基酸序列所涵蓋的抗原決定位。于另一實施例中，該敗血性巴氏桿菌毒素蛋白（PMT)含有如SEQIDN0:4所示的氨基酸序列所涵蓋的抗原決定位。于再一實施例中，該敗血性巴氏桿菌毒素蛋白（PMT)含有如SEQIDN0s:2及/或3及/或4所示的氨基酸序列所涵蓋的抗原決定位。于一較佳實施例中，本發(fā)明的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白（rPMT)含有二個以上該較長的抗原決定位氨基酸序列。此外，各抗原決定位氨基酸序列自蛋白質(zhì)N端到C端的排列順序并不限于依照序列辨識號（SEQIDN0)的順序排列。[0027]于一較佳實施例中，當(dāng)該敗血性巴氏桿菌毒素蛋白（PMT)的抗原決定位及/或該較長的抗原決定位氨基酸序列為復(fù)數(shù)個02)時，各敗血性巴氏桿菌毒素蛋白（PMT)的抗原決定位及/或該較長的抗原決定位氨基酸序列之間可進一步由連接子（linker)連接，該連接子至少含有一個以上的甘氨酸（Glycine，Gly)，該連接子包含但不限于：Gly-Gly、Gly-Ser、SEQIDN0s:5、12、13、14、15、16、17、18、19。于一實施例中，該連接子具有如SEQIDN0:5所示的氨基酸序列。然而，該復(fù)數(shù)個敗血性巴氏桿菌毒素蛋白（PMT)的抗原決定位及/或該復(fù)數(shù)個較長的抗原決定位氨基酸序列之間，不必然要由連接子所連接。[0028]于一實施例中，本發(fā)明所提供的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白（rPMT)進一步含有補體裂解片段C3d的全長或部分氨基酸序列，以增加特異性免疫反應(yīng)。于一實施例中，該補體裂解片段C3d的全長氨基酸序列為小鼠補體裂解片段C3d的全長序列（mC3d)，具有如SEQIDN0:8所示的氨基酸序列。于一較佳實施例中，該補體裂解片段C3d的部分氨基酸序列為小鼠補體裂解片段C3d第211個氨基酸至第238個氨基酸片段序列（mC3d-p28)，具有如SEQIDN0:6所示的氨基酸序列。于另一實施例中，該補體裂解片段C3d的全長氨基酸序列為豬補體裂解片段C3d的全長序列（pC3d)，具有如SEQIDN0:9所示的氨基酸序列。于另一較佳實施例中，該補體裂解片段C3d的部分氨基酸序列為豬補體裂解片段C3d第201個氨基酸至第231個氨基酸片段序列（pC3d-p31)，具有如SEQIDN0:7所示的氨基酸序列。本發(fā)明所提供的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白（rPMT)具有1至10個單元重復(fù)的上述補體裂解片段C3d的全長或部分氨基酸序列，該補體裂解片段C3d的全長或部分氨基酸序列較佳為1至重復(fù)10個單元，更佳為重復(fù)4至8個單元。[0029]當(dāng)該補體裂解片段C3d的全長或部分氨基酸序列為數(shù)個時，各補體裂解片段C3d的全長或部分氨基酸序列之間可由連接子連接，該連接子至少含有一個以上的甘氨酸(Gly)，該連接子包含但不限于：Gly-Gly、Gly-Ser、SEQIDNOs:5、12、13、14、15、16、17、18、19。于一實施例中，該連接子的氨基酸序列為Gly-Ser。然而，該復(fù)數(shù)個補體裂解片段C3d的全長或部分氨基酸序列之間，不必然要由連接子所連接。[0030]本發(fā)明的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白（rPMT)，可以由下式所表示：[0031](A)m_(C3d片段）n;式（I)[0032]其中每一個A代表一個獨立的敗血性巴氏桿菌毒素蛋白的抗原決定位，每一個A系各自獨立選自于由SEQIDN0s:2、3、4、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41及42所組成的群組；[0033]其中每一個C3d片段代表一個獨立的補體裂解片段C3d的氨基酸序列，每一個C3d片段系各自獨立選自于SEQIDNOs:6、7、8及9所組成的群組；[0034]其中m是代表從1至約30的整數(shù)；[0035]其中η是代表從0至約10的整數(shù)。[0036]于一實施例中，每一個Α之間進一步以一個連接子連接，該每一個連接子系各自獨立選自于Gly-Gly、Gly-Ser、SEQIDN0s:5、12、13、14、15、16、17、18、19。[0037]于一實施例中，每一個C3d片段之間以一個連接子連接，該每一個連接子系各自獨立選自于Gly-Gly、Gly-Ser、SEQIDN0s:5、12、13、14、15、16、17、18、19。[0038]于部分實施態(tài)樣中，本發(fā)明所提供的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白（rPMT)與上述式（I)所表示的氨基酸序列具有至少大約80%序列同源性，較佳者，具有大約85%序列同源性，更佳者，具有大約90%序列同源性，甚至是大約91%、大約92%、大約93%、大約94%、大約95%、大約96%、大約97%、大約98%、大約99%序列同源性。[0039]于一較佳實施例中，本發(fā)明所提供的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白（rPMT)具有三個分別如SEQIDN0:2、3、4所示的氨基酸序列所涵蓋的抗原決定位，以及重復(fù)6個單元的小鼠補體裂解片段C3d第204個氨基酸至第231個氨基酸片段序列（mC3d-p28)，且各抗原決定位（epitopes)的C端以連接子（序列如SEQIDNO:5所示）連接，該敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白（rPMT)具有如SEQIDNO:10所示的氨基酸序列。[0040]于另一較佳實施例中，該敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白（rPMT)具有三個分別如SEQIDN0:2、3、4所示的氨基酸序列所涵蓋的抗原決定位，以及重復(fù)6個單元的豬補體裂解片段C3d第201個氨基酸至第231個氨基酸片段序列（pC3d-p31)，且各抗原決定位(印Hopes)的C端以連接子（序列如SEQIDN0:5所示）連接，該敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白（rPMT)具有如SEQIDN0:11所示的氨基酸序列。[0041]本發(fā)明并提供一種編碼本發(fā)明的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白（rPMT)的核苷酸序列。該敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白（rPMT)包含至少一個敗血性巴氏桿菌毒素蛋白(PMT)的抗原決定位，以及重復(fù)0至10個單元的補體裂解片段C3d的部分氨基酸序列。該編碼本發(fā)明的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白（rPMT)的核苷酸序列，系由本發(fā)明的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白（rPMT)的氨基酸序列衍生而來。將本發(fā)明的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白（rPMT)氨基酸序列上的各個氨基酸置換為遺傳密碼表（geneticcodetable)所列的編碼該氨基酸的核苷酸序列（包含各種簡并密碼子（degeneratecodons,或稱同義密碼子，synonymouscodons))，即可得到本發(fā)明所提供的該核苷酸序列。例如，本發(fā)明的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白（rPMT)氨基酸序列上的絲胺酸（serine)可由TCT、TCC、TCA、TCG、AGT、AGC等核苷酸序列所編碼。本發(fā)明的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白（rPMT)氨基酸序列上的各個氨基酸，可由以下各核苷酸序列所編碼：[0042]【權(quán)利要求】1.一種敗血性巴氏桿菌（Pasteurellamultocida)毒素重組蛋白，包含至少一個敗血性巴氏桿菌毒素蛋白的抗原決定位（epitopes)。2.如權(quán)利要求1所述的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白，其特征在于，該至少一個敗血性巴氏桿菌毒素蛋白的抗原決定位系選自于由SEQIDN0s:2、3、4、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41及42所組成的群組中至少一個。3.如權(quán)利要求1所述的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白，其特征在于，當(dāng)該至少一個敗血性巴氏桿菌毒素蛋白的抗原決定位為復(fù)數(shù)個時，各該敗血性巴氏桿菌毒素蛋白的抗原決定位之間由連接子連接。4.如權(quán)利要求3所述的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白，其特征在于，該連接子系各自獨立選自于由Gly-Gly、Gly-Ser及SEQID勵8:5、12、13、14、15、16、17、18、19所組成的群組。5.如權(quán)利要求1所述的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白，其特征在于，該敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白進一步包含至少一個單元的補體裂解片段C3d的部分氨基酸序列或全長氨基酸序列。6.如權(quán)利要求5所述的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白，其特征在于，該至少一個敗血性巴氏桿菌毒素蛋白的抗原決定位與該補體裂解片段C3d的部分氨基酸序列或全長氨基酸序列系以連接子連接。7.如權(quán)利要求6所述的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白，其特征在于，該連接子系各自獨立選自于由Gly-Gly、Gly-Ser及SEQID勵8:5、12、13、14、15、16、17、18、19所組成的群組。8.如權(quán)利要求5所述的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白，其特征在于，當(dāng)該至少一個單元的補體裂解片段C3d的氨基酸序列為復(fù)數(shù)個時，各該補體裂解片段C3d的氨基酸序列之間由連接子連接。9.如權(quán)利要求8所述的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白，其特征在于，該連接子系各自獨立選自于由Gly-Gly、Gly-Ser及SEQIDNOs:5、12、13、14、15、16、17、18、19所組成的群組。10.如權(quán)利要求5所述的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白，其特征在于，該補體裂解片段C3d系選自于由SEQIDN0s:6、7、8及9所組成的群組。11.如權(quán)利要求5所述的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白，其特征在于，該敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白包含如SEQIDNO:10或11所示的氨基酸序列。12.-種敗血性巴氏桿菌（Pasteurellamultocida)毒素重組蛋白，其系以下式表示：(A)m-(C3d片段）n;式⑴其中每一個Α代表一個獨立的敗血性巴氏桿菌毒素蛋白的抗原決定位；其中每一個C3d片段代表一個獨立的補體裂解片段C3d的氨基酸序列；其中m是代表從1至約30的整數(shù)；其中η是代表從0至約10的整數(shù)。13.如權(quán)利要求12所述的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白，其特征在于，每一個Α系各自獨立選自于由SEQIDN0s:2、3、4、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41及42所組成的群組。14.如權(quán)利要求12所述的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白，其特征在于，每一個C3d片段系各自獨立選自于由SEQIDN0s:6、7、8及9所組成的群組。15.如權(quán)利要求12所述的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白，其特征在于，每一個A之間以一個連接子連接，每一個連接子系各自獨立選自于由Gly-Gly、Gly-Ser及SEQIDN0s:5、12、13、14、15、16、17、18、19所組成的群組。16.如權(quán)利要求12所述的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白，其特征在于，每一個C3d片段之間以一個連接子連接，每一個連接子系各自獨立選自于由Gly-Gly、Gly-Ser及SEQIDNOs:5、12、13、14、15、16、17、18、19所組成的群組。17.如權(quán)利要求12所述的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白，其特征在于，A與C3d片段的間以一連接子連接，該連接子系選自于由Gly-Gly、Gly-Ser及SEQIDN0s:5、12、13、14、15、16、17、18、19所組成的群組。18.如權(quán)利要求12所述的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白，其特征在于，該敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白包含與式（I)具有至少80%序列同源性的氨基酸序列。19.一種編碼如權(quán)利要求1或12所述的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白的核苷酸序列。20.-種豬萎縮性鼻炎免疫組合物，包含如權(quán)利要求1或12所述的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白以及一藥學(xué)上可接受的載劑。21.如權(quán)利要求20所述的豬萎縮性鼻炎免疫組合物，其特征在于，該豬萎縮性鼻炎免疫組合物進一步包含一支氣管敗血性博德氏桿菌（Bordetellabronchiseptica)、一敗血性巴氏桿菌A型菌（PasteurellamultocidaTypeA)以及一敗血性巴氏桿菌D型菌(PasteurellamultocidaTypeD)〇22.如權(quán)利要求20所述的豬萎縮性鼻炎免疫組合物，其特征在于，該豬萎縮性鼻炎免疫組合物進一步包含其他病原抗原，該病原抗原系選自由下列群組所組成者：豬環(huán)狀病毒第二型（PCV2)抗原、豬流感病毒（SIV)抗原、豬繁殖與呼吸癥候群病毒（PRRSV)抗原、豬霉楽菌（Mycoplasma)、豬小病毒（Parvovirus,PPV)、豬丹毒（Erysipelas)、豬胸膜肺炎放線桿菌（actinobacilluspleuropneumonia,APP)，以及偽狂犬?。ˋujeszky'sdisease)。23.-種動物對抗豬萎縮性鼻炎的方法，包含使用如權(quán)利要求20所述的免疫組合物以施予一動物，以增強該動物對抗豬萎縮性鼻炎的免疫力。24.-種抗敗血性巴氏桿菌D型菌毒素的抗體，系藉由如權(quán)利要求1或12所述的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白所制備而得。25.如權(quán)利要求24所述的抗體，該抗體包含至少下列其中一種：一單株抗體、一多株抗體，以及一經(jīng)基因重組的抗體。26.-種豬萎縮性鼻炎的檢測試劑盒，包含一偵測單元，該偵測單元系選自于下列群組所組成中至少一者：一如權(quán)利要求1或12所述的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白以及一藉由如權(quán)利要求1或12所述的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白所制備的抗體。27.如權(quán)利要求26所述的檢測套組，其中該敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白系置于一盤上。28.如權(quán)利要求26所述的檢測套組，其中該抗體包含至少下列其中一種：一單株抗體、一多株抗體，以及一經(jīng)基因重組的抗體?！疚臋n編號】C12N15/31GK104059134SQ201410106983【公開日】2014年9月24日申請日期:2014年3月21日優(yōu)先權(quán)日:2013年3月22日【發(fā)明者】楊瀅臻,郭村勇申請人:施懷哲維克生物科技股份有限公司