專利名稱：重組毒素蛋白的高水平表達(dá)的制作方法
重組毒素蛋白的高水平表達(dá)優(yōu)先權(quán)要求本申請根據(jù)35 U. S. C. $119(e)要求2010年4月16日提交的美國臨時申請系列號61/325，235,2010年4月9日提交的PCT/US 10/30573和2010年3月30日提交的美國臨時申請系列號61/319，152的優(yōu)先權(quán)。這些申請的內(nèi)容特此通過引用整體并入本文。序列表本申請包含通過EFS-Web以ASCII格式提交的序列表，該序列表特此通過引用整體并入本文。創(chuàng)建于2011年3月16日的所述ASCII拷貝被命名為38194201. txt，其大小為156，975個字節(jié)。發(fā)明背景 微生物毒素蛋白在醫(yī)學(xué)中用作針對產(chǎn)生毒素的微生物的疫苗接種的免疫原以及用作其他疫苗的載體蛋白質(zhì)和佐劑，并且在科學(xué)研究中用作研究分子途徑的工具。白喉毒素(DT)是由白喉桿菌(Corynebacterium diphtheriae)的產(chǎn)毒菌株合成和分泌的蛋白質(zhì)性毒素。產(chǎn)毒菌株含有攜帯毒素基因的噬菌體溶素原。DT被合成為535個氨基酸的多肽，其經(jīng)歷蛋白水解以形成成熟的毒素。成熟的毒素包含由ニ硫鍵連接的兩個亞基A和B。由完整DT的C末端部分形成的B亞基使DT能夠結(jié)合細(xì)胞膜并通過細(xì)胞膜進(jìn)入到胞質(zhì)中。一旦進(jìn)入細(xì)胞，由完整DT的N末端部分形成的酶的A亞基催化延伸因子2 (EF-2)的ADP核糖基化。其結(jié)果是，EF-2被滅活、蛋白質(zhì)合成停止和細(xì)胞死亡。白喉毒素是高度細(xì)胞毒性的，單個分子可以致死細(xì)胞，且10ng/kg的劑量可以殺死動物和人。CRM197蛋白是DT的無毒的、免疫學(xué)交叉反應(yīng)的形式。已研究了其作為DT增強劑或疫苗抗原的潛在用途。CRM197是通過由產(chǎn)毒的P棒狀桿菌噬菌體的亞硝基胍誘變構(gòu)建的非產(chǎn)毒噬菌體P 197tQX_感染的白喉桿菌產(chǎn)生的。CRM197蛋白具有與DT相同的分子量，但在A亞基中有單堿基變化(鳥嘌呤變?yōu)橄汆堰?的差異。這ー單堿基變化導(dǎo)致氨基酸置換(谷氨酸置換為甘氨酸)，并消除了 DT的毒性性質(zhì)。使用CRM197作為載體蛋白的結(jié)合多糖疫苗已批準(zhǔn)人體使用。疫苗包括MenVe0 (Novartis Vaccines and Diagnostics)(標(biāo)明用于預(yù)防由腦膜炎球菌亞群A、C、Y和W-135引起的侵襲性腦膜炎球菌疾病的疫苗)、Menjugate (Novartis Vaccines)(腦膜炎雙球菌C群結(jié)合疫苗)、和Prevnar (Wyeth Pharmaceuticals, Inc.)(革巴向于肺炎鏈球菌的七種血清型的兒童肺炎疫苗)和HibTITER (Wyeth)(流感嗜血桿菌b型疫苗)。此外，CRM197具有用作白喉桿菌疫苗接種的增強抗原的潛力并正在研究作為用于其它疫苗中的載體蛋白。用于批準(zhǔn)的治療和研究用途的CRM197高水平表達(dá)的方法尚未見報道。CRM197已在例如白喉桿菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌中以數(shù)十mg/L的水平表達(dá)。單劑Prevnar結(jié)合疫苗含有大約20ii g CRM197。因此，用于經(jīng)濟地以約lg/L或以上的水平生產(chǎn)CRM197的方法將極大地促進(jìn)疫苗研究和生產(chǎn)。由霍亂弧菌(Vibrio cholera)產(chǎn)生的霍亂毒素(CTX)是ー種導(dǎo)致以腹瀉和嘔吐為特征的感染的細(xì)菌性病原體，也是ー種ADP-核糖基化毒素。CTX是由六個蛋白質(zhì)亞基組成的低聚復(fù)合物單ー拷貝的霍亂毒素A亞基(CTA)和五個拷貝的霍亂毒素B亞基(CTB)。這五個各重12kDa的B亞基形成了ー個五元環(huán)。A亞基具有Al部分CTAl和A2鏈CTA2，CTAl是將G蛋白進(jìn)行ADP-核糖基化的球狀酶，而CTA2形成緊靠地位于B亞基環(huán)中心孔中的伸展的a螺旋。該環(huán)結(jié)合到宿主細(xì)胞表面上的GMl神經(jīng)節(jié)苷脂受體上，導(dǎo)致整個復(fù)合物的內(nèi)化。一旦內(nèi)化，CTAl鏈通過ニ硫鍵的還原釋放。然后CTAl被激活并且催化腺苷酸環(huán)化酶的ADP核糖基化。由此導(dǎo)致的腺苷酸環(huán)化酶活性的增強提高了環(huán)AMP的合成，這導(dǎo)致大量的流體和電解質(zhì)流出并且導(dǎo)致腹瀉。CTX的B亞基盡管是相對無害的，但仍保留了其結(jié)合到GMl神經(jīng)節(jié)苷脂受體上的能力。因此，CTB可用于促進(jìn)化學(xué)地或遺傳地偶聯(lián)的外來抗原的粘膜攝取。已證實其誘導(dǎo)粘膜免疫和系統(tǒng)免疫，并且是用于可食用疫苗的生產(chǎn)的候選物。由于其結(jié)合偏好，CTB也可用作神經(jīng)元示蹤物。百日咳毒素(PTX) 是由導(dǎo)致百日咳病的人呼吸道細(xì)菌性病原體百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)產(chǎn)生的外毒素和毒力因子。百日咳全毒素是具有AB 5結(jié)構(gòu)的多亞基復(fù)合物。酶活性的A亞基(SI)是修飾哺乳動物細(xì)胞內(nèi)幾種異三聚體G蛋白的a亞基的ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶，而B低聚物(S2、S3、兩個拷貝的S4和S5)結(jié)合細(xì)胞上的糖結(jié)合物受體。該毒素的五個亞基由百日咳類毒素操縱子表達(dá)。已研究了用于保護(hù)性疫苗和用作疫苗佐劑的百日咳毒素的無毒變異體。也需要百日咳毒素蛋白來用于研究，例如用于對G蛋白信號傳導(dǎo)途徑的研究。由破傷風(fēng)梭菌(Clostridium tetani)產(chǎn)生的破傷風(fēng)毒素是具有150kDa分子量的神經(jīng)毒素。它由以下兩部分組成100kDa重鏈或B-鏈和50kDa輕鏈或A-鏈。這些鏈通過ニ硫鍵連接。B鏈結(jié)合到位于神經(jīng)元膜上的ニ唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂(⑶2和⑶Ib)上。A鏈(一種鋅內(nèi)肽酶)攻擊囊泡相關(guān)膜蛋白(VAMP)。A鏈的作用通過降解小突觸泡蛋白阻止了受影響的神經(jīng)元釋放抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA( Y-氨基丁酸)和甘氨酸。其后果是最小刺激引起肌肉的危險的過度活動ー感官刺激對運動反射的抑制失敗。這導(dǎo)致主動肌和拮抗肌肌肉組織的全身性收縮，被稱為強直性痙攣。破傷風(fēng)毒素C片段(Tet C或TTC)是通過破傷風(fēng)毒素的蛋白酶切割(例如用木瓜蛋白酶)或通過片段的重組表達(dá)而產(chǎn)生的50kD的多肽。它對應(yīng)于C-末端的451個氨基酸(氨基酸位置865-1315)。C片段已表明為無毒性的。因為它以高特異性和親和カ與神經(jīng)元結(jié)合，TTC可用作神經(jīng)元藥物遞送的靶向分子或用于研究目的。TTC蛋白也可潛在地用作疫苗載體蛋白并且在疫苗中用來避免破傷風(fēng)梭菌感染。艱難梭菌(Clostridium difficile)毒素B(TcdB)是由艱難梭菌產(chǎn)生的毒力因子，它導(dǎo)致醫(yī)院獲得性腹瀉和假膜性結(jié)腸炎。TcdB和第二大梭菌毒素TcdA參與了假膜性結(jié)腸炎的發(fā)生。TcdB是約270kD的葡糖基化毒素，且可分成酶、易位和受體結(jié)合域。TcdB的前546個氨基酸包含酶區(qū)域，接著是推定的易位和受體結(jié)合域。TcdB具有作為艱難梭菌感染的保護(hù)性疫苗以及用于診斷檢驗及其開發(fā)的潛在用途。銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的外毒素A (ETA或PE)是一種II型ADPRT。就像它的家族成員白喉毒素和霍亂毒素ー樣,它通過細(xì)胞延伸因子2的ADP-核糖基化來抑制蛋白質(zhì)合成。銅綠假單胞菌外毒素A作為單體存在，由613個氨基酸的單ー多肽鏈^6kd)組成。ETA可潛在地用作疫苗偶聯(lián)物。ETA的無毒性突變體已作為用于防御金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、痕疾和傷寒沙門氏菌(Salmonella Typhi)的疫苗接種的疫苗偶聯(lián)物進(jìn)行了研究。以足夠滿足不斷擴大的需求的量來生產(chǎn)這些毒素已成為重大的挑戰(zhàn)。當(dāng)在常規(guī)蛋白質(zhì)過表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)時，由于降解、不正確的折疊或這兩者，取決于毒素的具體特征，例如大小和ニ級結(jié)構(gòu)，毒素蛋白僅以非常低的濃度以活性形式回收。因此，需要以低成本生產(chǎn)大量可溶性和/或活性形式的這些毒素的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及在假單胞菌宿主細(xì)胞中生產(chǎn)重組毒素蛋白的方法，所述方法包括將 編碼毒素蛋白的核苷酸序列接合到表達(dá)載體中；用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化假單胞菌宿主細(xì)胞；和在適合重組毒素蛋白表達(dá)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)已轉(zhuǎn)化的假單胞菌宿主細(xì)胞；其中該重組毒素蛋白是CRM197、白喉毒素、霍亂全毒素、霍亂毒素B、百日咳毒素、破傷風(fēng)毒素C片段、艱難梭菌毒素B或銅綠假單胞菌外毒素A。在實施方式中，重組毒素蛋白是霍亂毒素B、霍亂全毒素、百日咳毒素、破傷風(fēng)毒素C片段、艱難梭菌毒素B或銅綠假單胞菌外毒素A。在其他實施方式中，重組毒素蛋白是霍亂毒素B、霍亂全毒素、百日咳毒素、破傷風(fēng)毒素C片段或艱難梭菌毒素B。在其他實施方式中，重組毒素蛋白是CRM197、白喉毒素、霍亂全毒素、霍亂毒素B、百日咳毒素、破傷風(fēng)毒素C片段或艱難梭菌毒素B。在某些實施方式中，重組蛋白以約0. 2克/升至約12克/升的可溶性和/或活性毒素蛋白的產(chǎn)率生產(chǎn)。在特定實施方式中，可溶性和/或活性毒素蛋白的產(chǎn)率為約0. 2g/L、約 0. 3g/L、約 0. 4g/L、約 0. 5g/L、約 0. 6g/L、約 0. 7g/L、約 0. 8g/L、約 0. 9g/L、約 lg/L、約
I.5g/L、約 2g/L、約 2. 5g/L、約 3g/L、約 3. 5g/L、約 4g/L、約 4. 5g/L、約 5g/L、約 5. 5g/L、約6g/L、約 6. 5g/L、約 7g/L、約 7. 5g/L、約 8g/L、約 8. 5g/L、約 9g/L、約 9. 5g/L、約 10g/L、約
10.5g/L、約 I lg/L、約 12g/L、約 0. 2g/L-約 0. 5g/L、約 0. 2g/L_ 約 lg/L、約 0. 2-約 2g/L、約0. 3g/L-約 0. 6g/L、約 0. 3g/L-約 lg/L、約 0. 3-約 2g/L、約 0. 4-約 0. 7g/L、約 0. 4-約 Ig/L 約 0. 4-約 2g/L、約 0. 4-約 3g/L、約 0. 5g/L_ 約 lg/L、約 0. 5g/L_ 約 2g/L、約 0. 5g/L_ 約3g/L、約 0. 5g/L-約 4g/L、約 0. 5g/L_ 約 5g/L、約 0. 5g/L_ 約 6g/L、約 0. 5g/L_ 約 7g/L、約0. 5g/L-約 8g/L、約 0. 5g/L-約 9g/L、約 0. 5g/L_ 約 10g/L、約 0. 5g/L_ 約 I lg/L、約 0. 5g/L-約 12g/L、約 lg/L-約 2g/L、約 lg/L-約 3g/L、約 lg/L-約 4g/L、約 lg/L-約 5g/L、約 Ig/L-約 6g/L、約 lg/L-約 7g/L、約 lg/L-約 8g/L、約 lg/L-約 9g/L、約 lg/L-約 10g/L、約 Ig/L-約 llg/L、約 lg/L-約 12g/L、約 2g/L-約 3g/L、約 2g/L_ 約 4g/L、約 2g/L_ 約 5g/L、約2g/L-約 6g/L、約 2g/L-約 7g/L、約 2g/L_ 約 8g/L、約 2g/L_ 約 9g/L、約 2g/L_ 約 10g/L、約2g/L-約 I lg/L、約 2g/L-約 12g/L、約 3g/L_ 約 4g/L、約 3g/L_ 約 5g/L、約 3g/L_ 約 6g/L、約 3g/L-約 7g/L、約 3g/L-約 8g/L、約 3g/L_ 約 9g/L、約 3g/L_ 約 10g/L、約 3g/L_ 約 Hg/L、約 3g/L-約 12g/L、約 4g/L-約 5g/L、約 4g/L_ 約 6g/L、約 4g/L_ 約 7g/L、約 4g/L_ 約 8g/L、約 4g/ L-約 9g/L、約 4g/L-約 10g/L、約 4g/L_ 約 I lg/L、約 4g/L_ 約 12g/L、約 5g/L_ 約6g/L、約 5g/L-約 7g/L、約 5g/L-約 8g/L、約 5g/L_ 約 9g/L、約 5g/L_ 約 10g/L、約 5g/L_ 約llg/L、約 5g/L-約 12g/L、約 6g/L-約 7g/L、約 6g/L_ 約 8g/L、約 6g/L_ 約 9g/L、約 6g/L_ 約10g/L、約 6g/L-約 llg/L、約 6g/L-約 12g/L、約 7g/L_ 約 8g/L、約 7g/L_ 約 9g/L、約 7g/L-約 10g/L、約 7g/L-約 I lg/L、約 7g/L-約 12g/L、約 8g/L_ 約 9g/L、約 8g/L_ 約 10g/L、約8g/L-約 I lg/L、約 8g/L-約 12g/L、約 9g/L_ 約 10g/L、約 9g/L_ 約 I lg/L、約 9g/L_ 約 12g/L、約 lOg/L-約 I lg/L、約 lOg/L-約 12g/L 或約 llg/L-約 12g/L。在實施方式中，將編碼毒素蛋白的核苷酸序列與分泌信號編碼序列融合，分泌信號編碼序列表達(dá)時指引毒素蛋白向周質(zhì)轉(zhuǎn)移。在實施方式中，宿主細(xì)胞在至少ー種蛋白酶的表達(dá)上存在缺陷或者宿主細(xì)胞過表達(dá)至少ー種折疊調(diào)節(jié)因子，或它們的組合。在實施方式中，重組毒素蛋白是CRM197，和宿主細(xì)胞在HslU、HslV, PrcU DegPUDegP2和AprA的表達(dá)上存在缺陷。在相關(guān)實施方式中，重組毒素蛋白與分泌前導(dǎo)序列即Azu、IbpS31 A、CupA2、PbpA20V或Pbp融合。在實施方式中，重組毒素蛋白是CRM197，且宿主細(xì)胞在HslU和HslV或Prcl或DegPl或DegP2或AprA的表達(dá)上存在缺陷。在特定實施方式中，重組毒素蛋白是CRM197，且宿主細(xì)胞在沙雷氏菌溶素(Serralysin)、HslU、HslV,PrcU DegPU DegP2或AprA的表達(dá)上存在缺陷，或者宿主細(xì)胞過表達(dá)DsbA、DsbB, DsbC和DsbD0在實施方式中，宿主細(xì)胞過表達(dá)DsbA、DsbB、DsbC和DsbD，且重組毒素蛋白與分泌前導(dǎo)序列Azu融合。在實施方式中，宿主細(xì)胞在沙雷氏菌溶素的表達(dá)上存在缺陷，且重組毒素蛋白與分泌前導(dǎo)序列Pbp或Azu融合。在實施方式中，宿主細(xì)胞在HslU和HslV的表達(dá)上存在缺陷，且重組毒素蛋白與分泌前導(dǎo)序列Pbp或Azu融合。在實施方式中，重組毒素蛋白是CRM197，且宿主細(xì)胞是野生型，其中重組毒素蛋白與分泌前導(dǎo)序列Pbp或Azu融合。在實施方式中，重組毒素蛋白是CRM197并且重組毒素蛋白與分泌前導(dǎo)序列Azu、Pbp、IbpS31A、CupA2 或 PbpA20V 融合。在其他實施方式中，重組毒素蛋白是霍亂毒素B，且宿主細(xì)胞在Lon、La和AprA的表達(dá)上存在缺陷，或者宿主細(xì)胞在HslU、HslV, Prcl、DegPl、DegP2和AprA的表達(dá)上存在缺陷。在相關(guān)實施方式中，宿主細(xì)胞在Lon、La和AprA的表達(dá)上存在缺陷，而且其中重組毒素蛋白與分泌前導(dǎo)序列Pbp A20V融合。在其他實施方式中，重組毒素蛋白是百日咳毒素SI E129A R9K，且宿主細(xì)胞在以下的表達(dá)上存在缺陷Lon、La和AprA ;GrpE、DnaK和DnaJ ；HtpX ； RXFO1590 ；或ppiB(RXF05345)。在相關(guān)實施方式中，重組毒素蛋白與它的天然分泌前導(dǎo)序列融合。在其他實施方式中，重組毒素蛋白是破傷風(fēng)毒素C，且宿主細(xì)胞在HslU、HslV,Prcl、DegPl、DegP2和AprA的表達(dá)上存在缺陷。在相關(guān)實施方式中，重組毒素蛋白與分泌前導(dǎo)序列DsbC、Pbp A20V或CupA2融合。在其他實施方式中，重組毒素蛋白是破傷風(fēng)毒素C，且宿主細(xì)胞在Lon、La和AprA的表達(dá)上存在缺陷。在相關(guān)實施方式中，重組毒素蛋白與分泌前導(dǎo)序列DspA融合。在其他實施方式中，重組毒素蛋白是破傷風(fēng)毒素C，且宿主細(xì)胞在GrpE、DnaK和DnaJ的表達(dá)上存在缺陷。在相關(guān)實施方式中，重組毒素蛋白與分泌前導(dǎo)序列NikA融合。在其他實施方式中，重組毒素蛋白是艱難桿菌毒素B，且宿主細(xì)胞在以下的表達(dá)上存在缺陷HtpX ；DegPl ;HslU、HslV、Prcl和Prc2 ;或Lon和DegP2，或者宿主細(xì)胞既在Lon、Prcl、DegP2和AprA的表達(dá)上存在缺陷又過表達(dá)DegP2 S219A。在實施方式中，在活性測定中測定重組毒素蛋白的活性，其中所生產(chǎn)的可溶性毒素蛋白中約40%至約60%確定為有活性。在相關(guān)實施方式中，活性測定為免疫學(xué)測定、受體結(jié)合測定或酶測定。在本發(fā)明的實施方式中，表達(dá)載體包含可操作地連接到蛋白質(zhì)編碼序列上的Iac衍生啟動子，而且其中培養(yǎng)包括用濃度為約0. 02至約I. OmM的IPTG誘導(dǎo)該啟動子，誘導(dǎo)時細(xì)胞密度是約40至約200吸光度單位(AU)的光密度，培養(yǎng)物的pH值為約6至約7. 5，生長溫度為約20至約35攝氏度。在實施方式中，宿主細(xì)胞是假單胞菌細(xì)胞。在相關(guān)實施方式中，宿主細(xì)胞是熒光假單胞菌(Pseudomonas f Iuorescens)。 在本發(fā)明的實施方式中，為了在假單胞菌宿主細(xì)胞中表達(dá)而對核苷酸序列進(jìn)行了優(yōu)化。在相關(guān)實施方式中，為了在假單胞菌屬宿主細(xì)胞中表達(dá)而對核苷酸序列進(jìn)行了優(yōu)化。在其他相關(guān)實施方式中，為了在熒光假單胞菌宿主細(xì)胞中表達(dá)而對核苷酸序列進(jìn)行了優(yōu)化。在實施方式中，百日咳毒素是野生型或SI E129A R9K。在實施方式中，銅綠假單胞菌外毒素A是野生型、CRM66或rERA。在本發(fā)明的實施方式中，表達(dá)載體進(jìn)ー步包含鄰近分泌信號的編碼序列的標(biāo)簽序列。在實施方式中，表達(dá)載體進(jìn)ー步包含鄰近毒素蛋白的編碼序列的標(biāo)簽序列。本發(fā)明還提供根據(jù)本文所述方法生產(chǎn)的重組毒素蛋白。在實施方式中，重組毒素蛋白是CRM197、白喉毒素、霍亂全毒素、霍亂毒素B、百日咳毒素、破傷風(fēng)毒素C片段、艱難梭菌毒素B或銅綠假單胞菌外毒素A。在實施方式中，外毒素A是野生型、CRM66或rERA。在某些實施方式中，重組毒素蛋白在熒光假單胞菌的菌株中生產(chǎn)，該菌株在本文中確認(rèn)為生產(chǎn)高產(chǎn)率的毒素或生產(chǎn)高質(zhì)量的毒素。在某些實施方式中，重組毒素蛋白在熒光假單胞菌的菌株中生產(chǎn)，該菌株在本文中描述為生產(chǎn)最高產(chǎn)率的毒素蛋白。在其他實施方式中，重組毒素蛋白在本文描述為用于毒素發(fā)酵生產(chǎn)的菌株的菌株中生產(chǎn)。援引并入本說明書中提到的所有公開、專利和專利申請通過引用并入本文，其程度如同特別地和単獨地指示各單個公開、專利或?qū)＠暾埻ㄟ^引用并入本文。


本發(fā)明的新特征在所附的權(quán)利要求書中具體闡述。通過參考以下對在其中利用到本發(fā)明原理的說明性實施方式加以闡述的詳細(xì)描述和附圖，將獲得對本發(fā)明的特征和優(yōu)點的更好的理解。圖I. CRM197的高通量表達(dá)分析。利用毛細(xì)管凝膠電泳(SDS-CGE)分析利用圖IB所示的DNA序列表達(dá)的CRM197蛋白。在由SDS-CGE數(shù)據(jù)生成的凝膠樣圖像中顯示了所測試的40個CRM197表達(dá)菌株的可溶性部分。如表10所述的菌株名稱列于各個泳道上方。熒光假單胞菌表達(dá)的CMR197在SDS-CGE上作為 58kDa的單一條帶(左側(cè)箭頭)遷移。第一個和最后一個泳道內(nèi)的分子量標(biāo)記是16、20、29、48、69和119kDa。圖2.霍亂毒素B的高通量表達(dá)分析。利用毛細(xì)管凝膠電泳(SDS-CGE)分析應(yīng)用SEQ ID NO :23中所示的DNA序列表達(dá)的霍亂毒素B蛋白。在由SDS-CGE數(shù)據(jù)生成的凝膠樣圖像中顯示了所測試的40個霍亂毒素表達(dá)菌株的可溶性部分。如表11所述的菌株名稱列于各個泳道上方。誘導(dǎo)的CTB在SDS-CGE上作為 11. 5kDa的單一條帶(左側(cè)箭頭)遷移。第一個和最后一個泳道內(nèi)的分子量標(biāo)記是16、20、29、48、69和119kDa。圖3.百日咳類毒素操縱子。顯示了具有4210個堿基對的BPET0X_S1_R9K &E129A。圖4.百日咳類毒素的DNA序列。圖中顯示了帶翻譯結(jié)果的百日咳毒素SI R9KE129A DNA序列(SEQ ID NO :24)。該序列來源于Genebank項目M13223。亞基S1-S5和信號序列在序列上方標(biāo)明。SI中的R9K和E129A突變用下劃線標(biāo)注。編碼的蛋白質(zhì)按出現(xiàn)順序分別披露為 SEQ ID NO : 25、26、28、29 和 27。圖5.百日咳類毒素亞基的氨基酸序列。分泌信號用下劃線標(biāo)注。A. SI亞基(R9KE129A) (SEQ ID NO 25)。B. S2 亞基(SEQ ID NO 26)。C. S3 亞基(SEQ ID NO 27)。D. S4亞基(SEQ ID NO 28)。E. S5 亞基(SEQ ID NO 29)。 圖6.百日咳類毒素表達(dá)樣品的Western印跡分析。菌株名稱已列于各個泳道上方。誘導(dǎo)的 Ptx 以 ll_26kDa 范圍內(nèi)的多個條帶(SI :26. IKda, S2 20. 9Kda, S3 21. 8KDa,S4(2x) 12KDa, S5 =IlKDa)進(jìn)行遷移。A.還原的樣品。B.非還原的樣品。兩個圖面泳道I-分子量標(biāo)記(15、20、25、37、50、75、100、150、250kDa);泳道 2-空的;泳道 3-菌株 321 ;泳道4-菌株322 ;泳道5-菌株323 ;泳道6-菌株324 ;泳道7-菌株325 ;泳道8-菌株326 ；泳道9-菌株327 ;泳道10-菌株328。圖7.破傷風(fēng)毒素C片段表達(dá)。利用毛細(xì)管凝膠電泳(SDS-CGE)分析在熒光假單胞菌中表達(dá)的破傷風(fēng)毒素C片段。在由SDS-CGE數(shù)據(jù)生成的凝膠樣圖像中顯示了來自所測試的40個破傷風(fēng)毒素表達(dá)菌株的可溶性部分。如表15所述的菌株名稱列于各個泳道上方。誘導(dǎo)的破傷風(fēng)毒素C片段在SDS-CGE上以 51. 6kDa的單一條帶(左側(cè)箭頭)遷移。第一個和最后一個泳道內(nèi)的分子量標(biāo)記是16、20、29、48、69和119kDa。圖8. TcdB表達(dá)。利用毛細(xì)管凝膠電泳(SDS-CGE)分析在熒光假單胞菌中表達(dá)的TcdB。在由SDS-CGE數(shù)據(jù)生成的凝膠樣圖像中顯示了來自所測試的24個TcdB表達(dá)菌株的可溶性部分。如表18所述的菌株名稱以及空提取物和參考標(biāo)準(zhǔn)(List Biologicals)都列于各個泳道上方。誘導(dǎo)的TcdB在SDS-CGE上以 300kDa的單一條帶(左側(cè)箭頭)遷移。第一個和最后一個泳道內(nèi)的分子量標(biāo)記是16、20、29、48、69和119kDa。圖9.外毒素A氨基酸序列。圖中顯示了銅綠假單胞菌外毒素A的氨基酸序列(SEQID N0:34)。圖中顯示了三種外毒素A蛋白野生型、CRM66和rEPA。在變異體CRM66中，His426(粗體，下劃線標(biāo)注的文字)如序列上方所示被Tyr取代。在rEPA中，Glu553 (粗體，下劃線標(biāo)注的文字)如序列上方所示缺失。圖10.可溶性破傷風(fēng)毒素C和霍亂毒素B在熒光假單胞菌發(fā)酵培養(yǎng)物中的產(chǎn)生。SDS-CGE分析。泳道1-16、20、29、48、69和119kDa分子量標(biāo)記。泳道2和4-分別是表達(dá)霍亂毒素B的PS538-088U5和U6發(fā)酵物的誘導(dǎo)前樣品，泳道3和5分別是表達(dá)霍亂毒素B的PS538-088U5和U6發(fā)酵物的誘導(dǎo)后樣品，通過右側(cè)箭頭指示。圖11.可溶性破傷風(fēng)毒素C片段在熒光假單胞菌發(fā)酵培養(yǎng)物中的產(chǎn)生。A. SDS-CGE分析。泳道1-16、20、29、48、69和119kDa分子量標(biāo)記。泳道2、3和4分別是表達(dá)破傷風(fēng)韋素C片段的PS538-529U1、PS538-546U5和PS538-547U7發(fā)酵物的誘導(dǎo)后樣品，通過右側(cè)箭頭指示。B. Western印跡分析。通過Western印跡法評估來自菌株P(guān)S538-538 (Ul和U2)、PS538-548 (U3 和 U4)、PS538-558 (U5 和 U6)和 PS538-568 (U7 和 U8)的發(fā)酵樣品。發(fā)酵單位和誘導(dǎo)后小時數(shù)(10、18、124)已在各個泳道上方標(biāo)出。分子量(MW)標(biāo)準(zhǔn)顯示在印跡左偵牝破傷風(fēng)毒素C參考標(biāo)準(zhǔn)(Std ;List Biological, Cat# 193)顯示在右側(cè)。先用源自兔的多克隆抗破傷風(fēng)毒素C片段(Abeam, Cat# ab34890),然后用源自山羊的抗兔IgG過氧化物酶(Pierce, Cat# :31460)探測印跡。免疫純金屬強化 DAB (Immunopure Metal EnhancedDAB) (Pierce 34065)用于檢測。圖12.可溶性艱難梭菌B毒素蛋白在熒光假單胞菌發(fā)酵培養(yǎng)物中的產(chǎn)生。泳道1_16、20、29、48、69和119kDa分子量標(biāo)記。標(biāo)記大小也根據(jù)它們在泳道I中的遷移顯不在右側(cè)相對應(yīng)的位置上。泳道2、3和4分別是表達(dá)艱難梭菌B毒素蛋白的PS538-671 U5和PS538-647 U7發(fā)酵物的誘導(dǎo)后樣品，通過右側(cè)箭頭指示。圖13.野生型百日咳類毒素的DNA序列。圖中顯示了帶翻譯結(jié)果的野生型百日咳 毒素的DNA序列(SEQ ID NO 35)。序列來自Genebank項目M13223。亞基S1-S5和信號序列已顯示在序列上方。編碼的蛋白質(zhì)按出現(xiàn)順序分別顯示為SEQ ID N0:41-45。圖14.霍亂全毒素的氨基酸序列和DNA序列。A. CTA氨基酸序列(SEQ ID NO:38)，具有分泌前導(dǎo)序列(下劃線標(biāo)注)(AE003852 ;蛋白質(zhì)ID AAF94614. I)。B. CTB氨基酸序列(SEQ ID NO :39)，具有分泌前導(dǎo)序列(下劃線標(biāo)注)(GeneBank AE003852 ;蛋白質(zhì)ID AAF94613. I)。C. CTX DNA序列(SEQ ID NO :40)，顯示了 A和B亞基，并顯示出翻譯結(jié)果(Genbank AE003852)。編碼的蛋白質(zhì)按出現(xiàn)順序分別顯示為SEQ ID NO :38和39。圖15.在熒光假單胞菌發(fā)酵培養(yǎng)物中的可溶性rEPA生產(chǎn)的SDS-CGE凝膠樣圖像。利用毛細(xì)管凝膠電泳(SDS-CGE)分析在熒光假單胞菌發(fā)酵培養(yǎng)物中表達(dá)的可溶性rEPA。在由SDS-CGE數(shù)據(jù)生成的凝膠樣圖像中顯示了所測試的在誘導(dǎo)后0和24小時由表達(dá)菌株P(guān)S538-1633 (ul 和 u2)、PS538-1640 (u3 和 u5)和 PS538-1670 (u6、u7 和 u8)發(fā)酵產(chǎn)生的可溶性部分。Mw =分子量標(biāo)準(zhǔn)(16、20、29、48和69千道爾頓)。圖16.在熒光假單胞菌發(fā)酵培養(yǎng)物中的可溶性rEPA產(chǎn)生趨勢。通過對處于各自發(fā)酵物(ul、u2、u3、u6、u7 和 u8)中的菌株(PS538-1633、PS538_1640 和 PS538-1670)進(jìn)行SDS-CGE分析而確定的可溶性rEPA表達(dá)水平對誘導(dǎo)后時間作圖。圖17.在熒光假單胞菌發(fā)酵培養(yǎng)物中的可溶性rEPA產(chǎn)生的Western印跡分析。利用Western印跡分析來分析在熒光假單胞菌發(fā)酵培養(yǎng)物中表達(dá)的可溶性rEPA。利用對于銅綠假單胞菌外毒素A特異性的抗體在Western印跡分析中顯示誘導(dǎo)后0和24小時來自表達(dá)菌株 PS538-1633 (ul)、PS538-1640 (u3 和 u5)和 PS538-1670 (u6 和 u8)發(fā)酵物的可溶性部分。Mw =分子量標(biāo)準(zhǔn)。std = rEPA標(biāo)準(zhǔn)品。圖18.在熒光假單胞菌發(fā)酵培養(yǎng)物中的可溶性CRM197產(chǎn)生的SDS-CGE凝膠樣圖像。利用毛細(xì)管凝膠電泳(SDS-CGE)來分析在熒光假單胞菌發(fā)酵培養(yǎng)物中表達(dá)的CRM197。在由SDS-CGE數(shù)據(jù)生成的凝膠樣圖像中顯示了在所測試的誘導(dǎo)后各個不同時間(0、16、21和 23 小時)由表達(dá)菌株 PS538-772 (ul 和 u2)、PS538-776 (u3 和 u5)和 PS538-782 (u6 和u7)的各種發(fā)酵物所產(chǎn)生的可溶性部分。Mw=分子量標(biāo)準(zhǔn)(16、20、29、48、68和119千道爾頓)。
圖19.在熒光假單胞菌發(fā)酵培養(yǎng)物中的可溶性CRM197產(chǎn)生趨勢。如通過對處于各自發(fā)酵物(ul、u2、u3、u6 和 u7)中的不同菌株(PS538-772、PS538-776 和 PS538-782)進(jìn)行SDS-CGE所確定的可溶性CRM197表達(dá)水平對誘導(dǎo)后時間作圖。圖20.在熒光假單胞菌發(fā)酵培養(yǎng)物中的可溶性CRM197產(chǎn)生的Western印跡分析。利用Western印跡分析來分析在熒光假單胞菌發(fā)酵培養(yǎng)物中表達(dá)的CRM197。利用白喉毒素特異性抗體在Western印跡分析中顯示在所測試的誘導(dǎo)后各個不同時間(0、16、21和23小時)由表達(dá)菌株 PS538-772 (ul 和 u2)、PS538-776 (u3 和 u5)和 PS538-782 (u6 和 u7)的各種發(fā)酵物的可溶性部分。Mw =分子量標(biāo)準(zhǔn)(37、50、75、100、150和250千道爾頓)。STD =CRM197 標(biāo)準(zhǔn)。發(fā)明詳述
毒素ADP-核糖基化毒素ADP-核糖基化毒素(ADPRT)促進(jìn)煙酰胺和NAD的N-核糖之間的N-糖基鍵切割并且將ADP-核糖部分轉(zhuǎn)移至靶蛋白。ADPRT根據(jù)他們各自的靶標(biāo)分類為四個家族。I型ADPRT以異聚GTP-結(jié)合蛋白為靶標(biāo)。它們包括霍亂毒素(CTX)、百日咳毒素(PTX)和大腸桿菌不耐熱腸毒素(LT)。II型ADPRT (白喉毒素和假單胞菌外毒素A)修飾延伸因子
2(EF2) o III 型 ADPRT (肉毒梭菌(Clostridium botulinum) C3 胞外酶)使小 GTP-結(jié)合蛋白ADP-核糖基化。IV型ADPRT使肌動蛋白ADP-核糖基化。這些肌動蛋白特異性的ADPRT包括ニ元毒素家族，該家族包括肉毒梭菌C2毒素、產(chǎn)氣莢膜梭菌(C. perfringens) t -毒素、艱難梭菌毒素(一種不同于TcdA和TcdB的毒素，由Popoff等人，1988, “Actin-specificADP-ribosyItransferase produced by a Clostridium difficile strain,，. infectionand Immunity 56(9) :2299-2306描述,其通過引用并入本文)、螺狀梭菌(C. spiroforme)毒素和臘狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)營養(yǎng)期殺蟲蛋白(VIP)。已經(jīng)確定來自各類型的ADPRT的數(shù)個酶組分的結(jié)構(gòu)帶有或不帶有NAD，并且在例如通過引用并入本文的 Tsuge 等人,2008, “Structural basis of actin recognitionand arginine ADP-ribosyIation by Clostridium perfringens-toxin,，，PNAS 105(21)7399-7404中討論。典型的肌動蛋白特異性ADPRT具有兩個相似的結(jié)構(gòu)域?qū)Υ呋钚灾陵P(guān)重要的C結(jié)構(gòu)域；以及對與結(jié)合和易位亞基的相互作用很重要的N結(jié)構(gòu)域。相比之下，來自沙門氏菌的SpvB和III型ADPRT C3僅具有ー個ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域并且缺乏N末端銜接子結(jié)構(gòu)域。在所有的IV型ADPRT中，包括兩個關(guān)鍵的谷氨酸殘基的EXE基序存在于催化中心處。EXE基序的前一谷氨酸被認(rèn)為是ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶的關(guān)鍵殘基，它在肌動蛋白中由Arg-177去質(zhì)子化。后一谷氨酸與N-核糖上的0’2形成氫鍵，這被認(rèn)為穩(wěn)定了羰基碳鐵(oxocarbenium)陽離子。Barth 等人，2004,“Binary Bacterial Toxins Biochemistry, Biology, andApplication of Common Clostridium and Bacillus Proteins,，，Microbiology andMolecular Biology Reviews 68(3) :373-402 ;Mueller_Dieckmann 等人，“Structure ofmouse ADP-ribosylhydroIase 3 (mARH3), ” Acta Cryst F64 :156-162 ;Kulich 等人，1995，“Expression of Recombinant Exoenzyme S of Pseudomonas aeruginosa, ”Infectionand Immunity 63(1) :1-8 ;Sakurai 等人，2009,“Clostridium perfringens Iota-Toxin Structure and Function,，，Toxins 1:208-228;以及 Schirmer 等人，2002, “TheADP-ribosylating Mosquitocidal Toxin from Bacillus sphaericus,，，The Journal ofBiological Chemistry 277(14) :11941-11948 進(jìn)ー步描述了 ADPRT，它們?nèi)客ㄟ^引用并入本文。在本發(fā)明的實施方式中，產(chǎn)生選自包括ADPRT的組的重組毒素蛋白。在實施方式中，ADPRT的組由和/或WT)和假單胞菌外毒素A組成。在實施方式中，ADPRT的組由CTX(CTA和/或CTB)、PTX和假單胞菌外毒素A組成。在其他實施方式中，產(chǎn)生選自包括I型ADPRT的組的重組毒素蛋白。在實施方式中，I型ADPRT的組由CTX(CTA和/或CTB)和PTX組成。在其他實施方式中，產(chǎn)生選自包括II型ADPRT的組的重組毒素蛋白。在實施方式中，II型ADPRT的組由DT(CRM197和/或WT)和假單胞菌外毒素A組成。在其他實施方式中，產(chǎn)生選自包括IV型ADPRT的組的重組毒素蛋白。在實施方式中，IV型ADPRT是TcdB。CRM197 和 DT 交叉反應(yīng)物質(zhì)197(CRM197)是由具有錯義突變的DT基因產(chǎn)生的白喉毒素(DT)變異體。DT是ー種ADP-核糖基化毒素；CRM197缺乏DT的ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶(ADPRT)活性，且因此是無毒的。CMR197的基因具有單堿基置換，從而導(dǎo)致在殘基52處引入谷氨酸而不是甘氨酸。(參見，例如，Bishai 等人，1987,“High-Level Expression of a ProteolyticallySensitive Diphtheria toxin Fragment in Escherichia coli,，，J. Bact. 169 (11)5140-51,Giannini 等人，1984,“The Amino-Acid Sequence of Two Non-Toxic Mutants ofDiphtheria toxin CRM45 and CRM197,，，Nucleic Acids Research 12 (10) :4063-9,以及GenBank登錄號1007216A，全部通過引用并入本文。)CRM197蛋白可通過本領(lǐng)域已知的方法或通過在白喉桿菌或其他微生物中表達(dá)而低水平制備。天然存在的或野生型白喉毒素可從產(chǎn)毒素菌株獲得，該產(chǎn)毒素菌株可從包括美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)在內(nèi)的多種公共資源獲得。用于在白喉桿菌中生產(chǎn)CRM197蛋白的質(zhì)粒系統(tǒng)在例如美國專利號5，614，382，“Plasmid for Production of CRM Protein and Diphtheria toxin” 中有描述,其通過引用整體并入本文。核苷酸序列可利用重組DNA技術(shù)(例如，Sambrook等人，Molecular Cloning,a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, I989 描述)制備，且也基于棒狀桿菌噬菌體P所攜帯的白喉毒素野生型結(jié)構(gòu)基因的已知DT核苷酸序列，通過定點誘變來制備。(參見，例如，Greenfield 等人，1993, “Nucleotide Sequence of thestructural Gene for Diphtheria toxin Carried by Corynebacteriophage 18,，，ProcNat Acad Sci 80 :6953_7，通過引用并入本文。)如本文別處所述，核苷酸序列可以進(jìn)行優(yōu)化。在本發(fā)明的實施方式中，利用實施例I中所述的任何宿主菌株結(jié)合實施例I中所述的任何表達(dá)載體(質(zhì)粒)來生產(chǎn)CRM197或DT。在實施方式中，為了在假單胞菌宿主細(xì)胞中表達(dá)而優(yōu)化核酸序列。在實施方式中，所用的表達(dá)載體包含表達(dá)與重組CRM197或DT蛋白融合的表8和表3中所述的任何分泌前導(dǎo)序列的構(gòu)建體。在實施方式中，使用天然分泌前導(dǎo)序列。在某些實施方式中，CRM197或DT蛋白表達(dá)有標(biāo)簽，例如，純化標(biāo)簽。在實施方式中，本發(fā)明的方法用于以約0. 5g/L至至少約12g/L的產(chǎn)率生產(chǎn)CRM197或DT?；魜y毒素由霍亂弧菌產(chǎn)生的霍亂毒素(CTX)也是ー種ADP-核糖基化毒素?；魜y毒素(CTX)是由六個蛋白質(zhì)亞基組成的低聚復(fù)合物単一拷貝的霍亂毒素A亞基(CTA)和五個拷貝的霍亂毒素B亞基(CTB)。五個各重12kDa的B亞基形成五元環(huán)。A亞基具有Al部分CTAl和A2鏈CTA2，CTAl是使G蛋白ADP-核糖基化的球狀酶，而CTA2形成了一個緊貼地位于B亞基環(huán)中心孔中的伸展的a螺旋。該環(huán)結(jié)合到位于宿主細(xì)胞表面上的GMl神經(jīng)節(jié)苷脂受體上，從而導(dǎo)致整個復(fù)合物的內(nèi)化。一旦內(nèi)化，CTAl鏈由于ニ硫鍵的還原而釋放。隨后CTAl被激活并且催化腺苷酸環(huán)化酶的ADP核糖基化。由此導(dǎo)致的腺苷酸環(huán)化酶活性的增強提高了環(huán)AMP的合成，這導(dǎo)致大量的流體和電解質(zhì)流出并且導(dǎo)致腹瀉。CTX的B亞基盡管是相對無害的，但保留了其結(jié)合到GMl神經(jīng)節(jié)苷脂受體上的能力。因此，CTB可用于促進(jìn)化學(xué)地或遺傳地偶聯(lián)的外來抗原的粘膜攝取。已證實其誘導(dǎo)粘 膜免疫和系統(tǒng)免疫，并且是用于可食用疫苗生產(chǎn)的候選物。由于其結(jié)合偏好，CTB也可用作神經(jīng)元示蹤物。CTB的應(yīng)用及其結(jié)構(gòu)特征在例如Nozoye等人,2009, “Production of Ascarissuum Asl4 Protein ana Its Fusion Protein with Cholera Toxin B Subunit in RiceSeeds,，，Parasitology 995-1000 ；Harakuni 等人，2005, “Heteropentameric CholeraToxin B Subunit Chimeric Molecules Genetically Fused to a Vaccine AntigenInduce Systemic and Mucosa丄 immune Responses a Potential New Strategy to TargetRecombinant Vaccine Antigens to Mucosa丄 Immune Systems, ’’Infection and Immunity73(9) :5654-5665 ；Price 等人，2005, “Intranasal Administration of RecombinantNeisseria gonorrhoeae Transferrin Binding Proteins A and B Conjugated tothe Cholera Toxin B Subunit Induces Systemic and Vaginal Antibodies inMice,，，Infection and Immunity 73(7) :3945-3953;和 Sun 等人，1999, “IntranasalAdministration of a Schistosoma mansoni Glutathione S-Transferase-CholeraToxoid Conjugate Vaccine Evokes Antiparasitic and Antipathological Immunity inMice, ” J. Immunol. 163 :1045-1052中已有描述，它們?nèi)客ㄟ^引用并入本文。在本發(fā)明的實施方式中，利用本文實施例I中所述的任何宿主菌株結(jié)合實施例3中所述的任何表達(dá)載體來生產(chǎn)CTB或CTX。在實施方式中，為了在假單胞菌宿主細(xì)胞中表達(dá)而優(yōu)化了核酸序列。在實施方式中，所用的表達(dá)載體包含表達(dá)與重組CTB或CTX蛋白融合的表8和表3中所述的任何分泌前導(dǎo)序列的構(gòu)建體。在實施方式中，使用天然分泌前導(dǎo)序列。在某些實施方式中，CTB或CTX蛋白表達(dá)有標(biāo)簽，例如，純化標(biāo)簽。在實施方式中，本發(fā)明的方法用于以約0. 2g/L至至少約5g/L的產(chǎn)率生產(chǎn)CTB或CTX。百日咳毒素百日咳毒素是由導(dǎo)致百日咳病的人呼吸道細(xì)菌性病原體百日咳博德特菌產(chǎn)生的外毒素和毒力因子。百日咳全毒素是具有AB 5結(jié)構(gòu)的多亞基復(fù)合物。酶活性的A亞基(SI)是修飾哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的幾種異源三聚體G蛋白(主要是Gi蛋白)的a亞基的ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶，和B低聚物(S2、S3、兩個拷貝的S4和S5)結(jié)合細(xì)胞上的糖結(jié)合物受體。SI在進(jìn)入細(xì)胞后被蛋白水解加工。通過引用并入本文的Carbonetti等人,2005, “ProteolyticCleavage of Pertussis Toxin SI Subunit is Not Essential for Its Activity inMammalian Cells, ^BMC Microbiology 5 :7報告，SI的加工對它在哺乳動物細(xì)胞中的細(xì)胞毒性活性并非必不可少的。已研究百日咳毒素的無毒性變異體以供在疫苗中使用。利用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的百日咳毒素蛋白預(yù)期用于疫苗中以對抗百日咳。百日咳毒素也作為疫苗佐劑進(jìn)行了測試，例如，如 Roberts 等人，1995, “A Mutant Pertussis Toxin Molecule That LacksADP-Ribosyltransferase Activity, PT-9K/129G, Is an Effective Mucosal Adjuvantfor Intranasally Delivered Proteins，，Infection and Immunity 63(6) :2100-2108 所述，其通過引用并入本文。此外，百日咳毒素也可用于研究目的，例如用于G蛋白信號傳 導(dǎo)途徑的研究(例如，McCoy 等人，2010, “PARI and PAR2 couple to overlapping anddistinct sets of G proteins and 丄inked signaling pathways to differentiallyregulate cell physiology, ^Molecular Pharmacology Fast Forward MOL 62018,通過引用并入本文)，以及用作佐劑來強化對諸如實驗性自身免疫性腦脊髄炎(EAE)、實驗性自身免疫性睪丸炎、實驗性自身免疫性葡萄膜炎等自身免疫性疾病的誘導(dǎo)。(Su等人，2001，“Pertussis Toxin Inhibits Induction of Tissue-Specific Autoimmine Disease byDisrupting G Protein-Coupled Signals,，，J Immunol 167 :250-256,通過引用并入本文)。如圖3所示，該毒素的五個亞基由百日咳類毒素操縱子表達(dá)。包括某些變異體在內(nèi)的百日咳毒素蛋白的表達(dá)和結(jié)構(gòu)在以上引用的報告中以及由Burnette等人，1992，“Properties of Pertussis Toxin B Oligomer Assemoled In Vitro from RecombinantPolypeptides Produced by Escherichia coli,，，Infection and Immunity 60(6)2252-2256 ;美國專利號 5，085，862, “Genetic detoxification of pertussis toxin ； ”和Kaslow等人，1987,“Structure_Activity Analysis of the Activation of PertussisToxin, ”Biochemistry 26(1) :123-7描述；它們?nèi)客ㄟ^引用整體并入本文。如本文所用的百日咳毒素或PTX指百日咳毒素突變體SI R9K E129A或野生型蛋白質(zhì)。野生型百日咳毒素和百日咳毒素突變體SI R9K E129A在例如以下文獻(xiàn)中描述Roberts等人，1995(以上引用);美國專利號7，427，404和美國專利號7，666，436，名稱均為“Pertussis Toxin Mutants, Bordetella Strains Capable of Producing SuchMutants and Their Use in the Development of Antipertussis Vaccines ；，，美國專利號5，935，580,“Recombinant Mutants for Inducing Specific Immune Responses ;，，美國專利號 7，169，399, “Non-Toxic Double Mutant Forms of Pertussis Toxin as Adjuvants;，，美國專利號5，785，971和美國專利號5，427，788，名稱均為“Pertussis Toxin and Use inVaccines ；，，和美國專利號 5，773，600, “DNA Encoding Pertussis Toxin Muteins”,它們?nèi)客ㄟ^引用整體并入本文。在本發(fā)明的實施方式中，利用本文實施例1、5和7中所述的任何宿主菌株生產(chǎn)百日咳毒素突變體SI E129A或野生型百日咳毒素。在實施方式中，所用的表達(dá)載體包含表達(dá)與重組PTX蛋白融合的表8和表3中所述的任何分泌前導(dǎo)序列的構(gòu)建體。在實施方式中，使用天然分泌前導(dǎo)序列。在實施方式中，如本文別處所述，為了在選定的假單胞菌宿主中表達(dá)而優(yōu)化任何或所有亞基編碼序列。在某些實施方式中，亞基由兩個或多個構(gòu)建體表達(dá)，例如，通過根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法亞克隆單個序列。在某些實施方式中，PTX蛋白表達(dá)有標(biāo)簽，例如純化標(biāo)簽。在實施方式中，本發(fā)明的方法用于以約0. 2g/L至至少約5g/L的產(chǎn)率生產(chǎn)PTX或PTX的各單個亞基。破傷風(fēng)毒素C片段由破傷風(fēng)梭菌產(chǎn)生的破傷風(fēng)毒素是具有150kDa的分子量的神經(jīng)毒素。它由兩部分組成100kDa重鏈或B-鏈和50kDa的輕鏈或A-鏈。這些鏈由ニ硫鍵連接。B鏈結(jié)合到位于神經(jīng)元膜上的ニ唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂(⑶2和⑶Ib)上。A鏈(一種鋅內(nèi)肽酶)攻擊囊泡相關(guān)膜蛋白(VAMP)。A鏈的作用通過降解小突觸泡蛋白來阻止受影響的神經(jīng)元釋放出抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA( Y-氨基丁酸)和甘氨酸。其后果是最小的刺激引起危險的肌肉過度活動ー感官刺激對運動反射的抑制失敗。這導(dǎo)致主動肌和拮抗肌肌肉組織的全身性收縮，被稱為強直性痙 攣。破傷風(fēng)毒素C片段(Tet C或TTC)是通過破傷風(fēng)毒素的蛋白酶裂解(例如，用木瓜蛋白酶)或通過該片段的重組表達(dá)而產(chǎn)生的50kD多肽。它對應(yīng)于C-末端的451個氨基酸(氨基酸位置865-1315)。C片段的重組表達(dá)已在例如美國專利號5，443，966，“Expressionof Tetanus Toxin Fragment C, ” W0/2005/000346, “Carrier Proteins for Vaccines,”和 6，010，871, “Modification of Peptide and Protein” 中公開，它們?nèi)客ㄟ^引用整體并入本文。已證明C片段是無毒性的并且能夠在小鼠和豚鼠中刺激保護(hù)性免疫應(yīng)答。美國專利號5，443，966描述了破傷風(fēng)毒素的序列以及C片段在大腸桿菌中的生產(chǎn)。重組TTC在酵母中的表達(dá)已在例如美國專利號 5，571，694,“Expression of Tetanus Toxin Fragment Cin Yeast”中描述，其通過引用整體并入本文。因為TTC以高特異性和親和カ結(jié)合神經(jīng)元，TTC可用作神經(jīng)元藥物遞送的靶向分子或用于研究目的。此類用途在例如Townsend等人,2007, “Tetanus toxin C fragmentconjugated nanoparticles for targeted drug delivery to neurons, ^Biomaterials28(34) :5176-5184中描述，其通過引用并入本文。TTC蛋白也可潛在地用作疫苗載體蛋白，如例如W0/2005/000346中所述，并且已研究在疫苗中使用以避免破傷風(fēng)梭菌感染。在本發(fā)明的實施方式中，利用本文實施例I中所述的任何宿主菌株結(jié)合實施例8中所述的任何表達(dá)載體生產(chǎn)TTC。在實施方式中，為了在假單胞菌宿主細(xì)胞中表達(dá)而優(yōu)化核酸序列。在實施方式中，所用的表達(dá)載體具有表達(dá)與重組TTC蛋白融合的表8和表3中所述的任何分泌前導(dǎo)序列的構(gòu)建體。在某些實施方式中，TTC蛋白表達(dá)有標(biāo)簽，例如，純化標(biāo)簽。在實施方式中，使用天然分泌前導(dǎo)序列。在實施方式中，本發(fā)明的方法用于以約0.5g/L至至少約12g/L的產(chǎn)率生產(chǎn)TTC。艱難梭菌毒素B艱難梭菌毒素B(TcdB)是由導(dǎo)致醫(yī)院獲得性腹瀉和假膜性結(jié)腸炎的艱難梭菌產(chǎn)生的毒力因子。TcdB和第二大梭菌毒素TcdA參與了假膜性結(jié)腸炎的發(fā)生。TcdB是約270kD的糖基化毒素，可分成酶結(jié)構(gòu)域、易位結(jié)構(gòu)域和受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。TcdB的前546個氨基酸含有酶區(qū)域，之后是推定的易位和受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。已報道酶活性需要氨基末端的546個殘基，因為該片段的氨基或羧基末端缺失降低了活性。在該酶區(qū)域內(nèi)，已證明色氨酸102對UDP-葡萄糖結(jié)合至關(guān)重要。LCT內(nèi)的保守的DXD基序?qū)CT葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性至關(guān)重要。涉及TcdB和TcsL酶結(jié)構(gòu)域的嵌合體分析的研究提示殘基364至516賦予了底物特異性。TcdB的結(jié)構(gòu)及其表達(dá)以及作為針對艱難梭菌感染的保護(hù)性疫苗的潛在用途在例如以下文獻(xiàn)中討論美國專利號7，226，597, “Mutants of Clostridium DifficileToxin B and Methods of Use ； ” Jank 等人，2008, “Structure and mode of action ofclostridial glucosylating toxins the ABCD model,’’Trends in Microbiology 16(5)222-229 ;Sullivan等人，1982,“Purification and Characterization of Toxins A and Bof Clostridium difficile,^Infection and Immunity 35(3) : 1032-1040 ;和 Yang 等人，2008,“Expression of recombinant Clostridium difficile toxin A and B in Bacillusmegaterium, ” BMC Microbiology 8 :192,它們?nèi)客ㄟ^引用整體并入本文。 在本發(fā)明的實施方式中，利用本文實施例1、5和7中所述的任何宿主菌株來生產(chǎn)TcdB。在實施方式中，為了在假單胞菌宿主細(xì)胞中表達(dá)而優(yōu)化核酸序列。在實施方式中，所用的表達(dá)載體包含表達(dá)與重組TcdB蛋白融合的表8和表3中所述的任何分泌前導(dǎo)序列的構(gòu)建體。在實施方式中，使用天然分泌前導(dǎo)序列。在某些實施方式中，TcdB蛋白表達(dá)有標(biāo)簽，例如，純化標(biāo)簽。在實施方式中，本發(fā)明的方法用于以約0. 5g/L至至少約10g/L的產(chǎn)率生產(chǎn)TcdB。銅綠假單胞菌外毒素A銅綠假單胞菌的外毒素A (ETA或PE)是II型ADPRT。它是能夠?qū)⒋呋Y(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)位至哺乳動物細(xì)胞中并且通過細(xì)胞延伸因子2的ADP-核糖基化抑制蛋白質(zhì)合成的分泌的細(xì)菌毒素家族的成員。該蛋白質(zhì)作為單體存在，由613個氨基酸^6Kd)的單ー多肽鏈組成。以3. O-A分辨率確定的外毒素A的X射線晶體結(jié)構(gòu)顯示出主要由反平行的P結(jié)構(gòu)組成并且包含該分子的大約一半的氨基末端結(jié)構(gòu)域；由a螺旋組成的中間結(jié)構(gòu)域；以及包含該分子的大約三分之一的羧基末端結(jié)構(gòu)域。羧基末端結(jié)構(gòu)域是毒素的ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶。其他兩個結(jié)構(gòu)域推測參與細(xì)胞受體結(jié)合和膜轉(zhuǎn)位。該毒素通過位于細(xì)胞表面上的特定受體結(jié)合到細(xì)胞上，然后毒素-受體復(fù)合物內(nèi)化到細(xì)胞中。最后，ETA被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞溶質(zhì)，在其中它酶促抑制蛋白質(zhì)合成。由于弱堿比如NH4+(它提高酸性囊泡中的pH)防止細(xì)胞中毒，據(jù)認(rèn)為轉(zhuǎn)移過程從酸性區(qū)室發(fā)生。一旦暴露在酸性條件下，PE的疏水結(jié)構(gòu)域進(jìn)入膜內(nèi)，從而導(dǎo)致通道的形成，酶結(jié)構(gòu)域以伸展形式通過該通道進(jìn)入細(xì)胞溶質(zhì)中。PE的活性和毒性減弱的突變體在例如以下文獻(xiàn)中描述美國專利號 4，892，827, “Recombinant Pseudomonas Exotoxins !Construction of an ActiveImmunotoxin with Low Side Effects，，和 Lukac 等人，1988, “Toxoid of Pseudomonasaeruginosa Exotoxin A Generated by Deletion of an Active-Site Residue’’Infectionand Immunity 56(12) :3095_3098，二者通過引用整體并入本文。外毒素A突變體rEPA作為疫苗偶聯(lián)物的應(yīng)用在例如以下文獻(xiàn)中描述Fattom等人，1993, “Laboratory and Clinical Evaluation of しonjugate Vaccines Composedof Staphylococcus aureus Type 5 and Type 8 Capsular Polysaccharides Bound toPseudomonas aeruginosa Recombinant Exoprotein A，，Infection and Immunity 61(3)1023-1032 ;Qian 等人，2007, “Conjugating recombinant proteins to Pseudomonasaeruginosa ExoProtein A a strategy for enhancing immunogenicity of malariavaccine candidates” Vaccine 25(20) :3923-3933 ;以及 Lin 等人，2001. “The Efficacyof a Salmonella Typhi Vi Conjugate Vaccine in Two-To-Five-Year-Old Children”NEngl J Med 344(17) :1263_1269，均通過引用并入本文。本文中使用的銅綠假單胞菌外毒素A指銅綠假單胞菌外毒素A突變體CRM66、缺失rEPA或野生型蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的實施方式中，利用本文實施例1、5和7中所述的任何宿主菌株并且利用具有表達(dá)與重組外毒素A蛋白融合的表8和表3中所述的任何分泌前導(dǎo)序列的構(gòu)建體的表達(dá)載體來生產(chǎn)外毒素A。在實施方式中，為了在假單胞菌宿主細(xì)胞中表達(dá)而優(yōu)化核酸序列。在實施方式中，使用天然分泌前導(dǎo)序列。在某些實施方式中，ETA蛋白表達(dá)有標(biāo)簽，例如，純化標(biāo)簽。在實施方式中，本發(fā)明的方法用于以約0. 5g/L至至少約12g/L的產(chǎn)率生產(chǎn)外毒素A。用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的示例性毒素蛋白在表I中列出?？梢岳斫?，這個列表不是 限制性的。在本發(fā)明的實施方式中，為了在選擇的假單胞菌宿主細(xì)胞中表達(dá)，可以優(yōu)化在此用于利用本發(fā)明方法生產(chǎn)本文所述的毒素的任何核酸序列。如本文別處所述，任何給定序列的優(yōu)化存在多種選擇。所述的任何選項預(yù)期用于優(yōu)化利用本發(fā)明方法生產(chǎn)的毒素的序列。本文提供的優(yōu)化序列是在本發(fā)明方法中有用的優(yōu)化序列的非限制性實例。表I 示例性毒素蛋白
I示例性序列___資源/參考__
CRM197白喉桿菌 NCTC 13129
白喉毒素(WT)GenBank NC 00293 5.2白喉桿菌
GenBank CAA00374.1
霍亂全毒素GenBank NC_002505.1;霍亂弧菌
NP231099.1 和 NP23110.1
霍亂毒素BGenBank ACH70471霍亂弧菌Ol生物變種
(El Tor 株)El tor百曰咳毒素 GenBank M13223.1,具有百曰咳博德特菌— 一 SI突變 —
破傷風(fēng)喜素C片段 GenBank 1A8D A破傷風(fēng)梭菌
艱難梭菌毒素B VPI GenBank CAA63562艱難梭菌
(TcdB)— _ ___ _ _
銅綠假單胞菌外毒 GenBank NP—249839銅綠假單胞菌PAOl
素 A_ — _ 一 密碼子優(yōu)化
在異源表達(dá)系統(tǒng)中，優(yōu)化步驟可以提高宿主產(chǎn)生外源蛋白的能力。蛋白質(zhì)表達(dá)是由一系列包括那些影響轉(zhuǎn)錄、mRNA加工及翻譯的穩(wěn)定性和起始的因素的許多因素控制的。多核苷酸優(yōu)化步驟可以包括提高宿主產(chǎn)生外源蛋白能力的步驟，以及輔助研究人員有效地設(shè)計表達(dá)構(gòu)建體的步驟。優(yōu)化策略可以包括,例如,翻譯起始區(qū)的修飾、mRNA結(jié)構(gòu)元件的改變和不同密碼子偏倚性的使用。優(yōu)化核酸序列以提高在細(xì)菌宿主中異源蛋白的表達(dá)的方法在本領(lǐng)域中是已知的，并在文獻(xiàn)中描述。例如，用于假單胞菌宿主菌株中表達(dá)的密碼子優(yōu)化描述在美國專利申請公開號2007/0292918，“Codon Optimization Method”中，其全部內(nèi)容通過引用并入本文。因此，優(yōu)化可以處理異源基因的多種序列特征中的任意ー種。作為具體的實例，稀有密碼子引起的翻譯中止可導(dǎo)致異源蛋白表達(dá)的降低。稀有密碼子引起的翻譯中止包括在目標(biāo)多核苷酸中存在很少在宿主生物體中使用的密碼子可能對蛋白質(zhì)的翻譯有負(fù)面影響，因為它們在可用的tRNA池中的缺少。提高宿主生物體中最佳翻譯的方法包括可導(dǎo)致稀有宿主密碼子從合成的多核苷酸序列中去除的密碼子優(yōu)化。
替代的翻譯起始也可以導(dǎo)致異源蛋白表達(dá)的降低。替代的翻譯起始可包含偶然地包含能夠作為核糖體結(jié)合位點(RBS)發(fā)揮功能的基序的合成多核苷酸序列。這些位點可引起從基因內(nèi)部位點起始截短蛋白的翻譯。降低產(chǎn)生截短蛋白(其可能難以在純化過程中去除)的可能性的ー種方法包括從優(yōu)化的多核苷酸序列中消除推定的內(nèi)部RBS序列。重復(fù)引起的聚合酶滑脫可以導(dǎo)致異源蛋白表達(dá)的下降。重復(fù)引起的聚合酶滑脫涉及表明會引起可產(chǎn)生移碼突變的DNA聚合酶的滑脫或ロ吃(stuttering)的核苷酸序列重復(fù)。這樣的重復(fù)序列也能引起RNA聚合酶的滑脫。在具有高G+C含量偏倚性的生物體中，可以有更高程度的由G或C核苷酸重復(fù)構(gòu)成的重復(fù)序列。因此，降低引起RNA聚合酶滑脫的可能性的ー種方法包括改變G或C核苷酸的延伸重復(fù)序列。干擾ニ級結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致異源蛋白表達(dá)的下降。ニ級結(jié)構(gòu)可以隔離RBS序列或起始密碼子，且與蛋白質(zhì)表達(dá)的下降相關(guān)。莖-環(huán)結(jié)構(gòu)也可以參與轉(zhuǎn)錄中止和減弱。優(yōu)化的多核苷酸序列在核苷酸序列的RBS和基因編碼區(qū)中可以含有最少的ニ級結(jié)構(gòu)以允許轉(zhuǎn)錄和翻譯的改善。另ー種可能影響異源蛋白表達(dá)的特征是限制性位點的存在?？梢酝ㄟ^除去可能干擾隨后轉(zhuǎn)錄單位亞克隆到宿主表達(dá)載體中的限制性位點優(yōu)化多核苷酸序列。例如，可以通過識別由宿主異源表達(dá)所需的氨基酸序列開始優(yōu)化過程?？梢詮脑摪被嵝蛄性O(shè)計候選多核苷酸或DNA序列。在設(shè)計合成DNA序列時，密碼子選擇的頻率可以與宿主表達(dá)有機體的密碼子選擇進(jìn)行比較和稀有宿主密碼子可以從合成序列中除去。此夕卜，合成的候選DNA序列可以被修飾以除去不想要的限制性酶切位點，以及添加或移除任何所需的信號序列、接頭或非翻譯區(qū)?？梢苑治龊铣蒁NA序列中可能會干擾的翻譯過程的ニ級結(jié)構(gòu)的存在，如G/C重復(fù)序列和莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。在候選DNA序列合成之前，可以檢驗優(yōu)化的序列設(shè)計以確認(rèn)該序列正確編碼所需的氨基酸序列。最后，可以使用DNA合成技術(shù)合成候選DNA序列，如本領(lǐng)域中已知的那些合成技術(shù)。在本發(fā)明的另ー個實施方式中，可以使用宿主生物體如熒光假單胞菌中的通用密碼子選擇來優(yōu)化異源多核苷酸序列的表達(dá)?？梢栽u估在宿主表達(dá)系統(tǒng)中被視為對于特定氨基酸優(yōu)選的稀有密碼子的百分比和分布。5%和10%的選擇率值可作為確定稀有密碼子的臨界值。例如，表I中列出的密碼子在熒光假單胞菌MB214基因組中的計算出現(xiàn)率小于5%，因而通常避免用于在熒光假單胞菌宿主中表達(dá)的優(yōu)化基因中。表2.在熒光假單胞菌MB214中出現(xiàn)率低于5%的密碼子
權(quán)利要求
1.一種在假單胞菌宿主細(xì)胞中生產(chǎn)重組毒素蛋白的方法，所述方法包括 將編碼毒素蛋白的核苷酸序列連接到表達(dá)載體中； 用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化假單胞菌宿主細(xì)胞；以及 在適合重組毒素蛋白表達(dá)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)已轉(zhuǎn)化的假單胞菌宿主細(xì)胞； 其中所述重組毒素蛋白選自CRM197、白喉毒素、霍亂全毒素、霍亂毒素B、百日咳毒素、破傷風(fēng)毒素C片段、艱難梭菌毒素B和銅綠假單胞菌外毒素A，或者 其中所述重組毒素蛋白選自霍亂毒素B、霍亂全毒素、百日咳毒素、破傷風(fēng)毒素C片段、艱難梭菌毒素B和銅綠假單胞菌外毒素A，或者 其中所述重組毒素蛋白選自霍亂毒素B、霍亂全毒素、百日咳毒素、破傷風(fēng)毒素C片段和艱難梭菌毒素B。
2.權(quán)利要求I的方法，其中所述重組蛋白以0.2克/升至約12克/升的可溶性和/或活性毒素蛋白的產(chǎn)率生產(chǎn)。
3.權(quán)利要求2的方法，其中可溶性和/或活性毒素蛋白的產(chǎn)率為約0.2克/升至約12克 / 升，為約 0. 2g/L、約 0. 3g/L、約 0. 4g/L、約 0. 5g/L、約 0. 6g/L、約 0. 7g/L、約 0. 8g/L、約 0. 9g/L、約 lg/L、約 I. 5g/L、約 2g/L、約 2. 5g/L、約 3g/L、約 3. 5g/L、約 4g/L、約 4. 5g/L、約 5g/L、約 5. 5g/L、約 6g/L、約 6. 5g/L、約 7g/L、約 7. 5g/L、約 8g/L、約 8. 5g/L、約 9g/L、約9.5g/L、約 10g/L、約 10. 5g/L、約 I lg/L、約 12g/L、約 0. 2g/L 至約 0. 5g/L、約 0. 2g/L 至約lg/L、約 0. 2 至約 2g/L、約 0. 3g/L 至約 0. 6g/L、約 0. 3g/L 至約 lg/L、約 0. 3 至約 2g/L、約0. 4至約0. 7g/L、約0. 4至約lg/L約0. 4至約2g/L、約0. 4至約3g/L、約0. 5g/L至約Ig/L、約 0. 5g/L 至約 2g/L、約 0. 5g/L 至約 3g/L、約 0. 5g/L 至約 4g/L、約 0. 5g/L 至約 5g/L、約0.5g/L 至約 6g/L、約 0. 5g/L 至約 7g/L、約 0. 5g/L 至約 8g/L、約 0. 5g/L 至約 9g/L、約 0. 5g/L 至約 10g/L、約 0. 5g/L 至約 I lg/L、約 0. 5g/L 至約 12g/L、約 lg/L 至約 2g/L、約 lg/L 至約3g/L、約 lg/L 至約 4g/L、約 lg/L 至約 5g/L、約 lg/L 至約 6g/L、約 lg/L 至約 7g/L、約 lg/L至約 8g/L、約 lg/L 至約 9g/L、約 lg/L 至約 10g/L、約 lg/L 至約 I lg/L、約 lg/L 至約 12g/L、約2g/L至約3g/L、約2g/L至約4g/L、約2g/L至約5g/L、約2g/L至約6g/L、約2g/L至約7g/L、約 2g/L 至約 8g/L、約 2g/L 至約 9g/L、約 2g/L 至約 10g/L、約 2g/L 至約 llg/L、約 2g/L 至約 12g/L、約 3g/L 至約 4g/L、約 3g/L 至約 5g/L、約 3g/L 至約 6g/L、約 3g/L 至約 7g/L、約3g/L至約8g/L、約3g/L至約9g/L、約3g/L至約10g/L、約3g/L至約I lg/L、約3g/L至約12g/L、約4g/L至約5g/L、約4g/L至約6g/L、約4g/L至約7g/L、約4g/L至約8g/L、約4g/L 至約 9g/L、約 4g/L 至約 10g/L、約 4g/L 至約 llg/L、約 4g/L 至約 12g/L、約 5g/L 至約6g/L、約 5g/L 至約 7g/L、約 5g/L 至約 8g/L、約 5g/L 至約 9g/L、約 5g/L 至約 10g/L、約 5g/L至約I lg/L、約5g/L至約12g/L、約6g/L至約7g/L、約6g/L至約8g/L、約6g/L至約9g/L、約 6g/L 至約 10g/L、約 6g/L 至約 llg/L、約 6g/L 至約 12g/L、約 7g/L 至約 8g/L、約 7g/L至約9g/L、約7g/L至約10g/L、約7g/L至約I lg/L、約7g/L至約12g/L、約8g/L至約9g/L、約 8g/L 至約 10g/L、約 8g/L 至約 I lg/L、約 8g/L 至約 12g/L、約 9g/L 至約 10g/L、約 9g/L 至約 llg/L、約 9g/L 至約 12g/L、約 10g/L 至約 llg/L、約 10g/L 至約 12g/L 或約 llg/L 至約 12g/L。
4.權(quán)利要求1-3中任ー項的方法，其中所述編碼毒素蛋白的核苷酸序列與分泌信號編碼序列融合，當(dāng)所述分泌信號編碼序列表達(dá)時，指引所述毒素蛋白向周質(zhì)轉(zhuǎn)移。
5.權(quán)利要求1-4中任ー項的方法，其中所述宿主細(xì)胞在至少ー種蛋白酶的表達(dá)上有缺陷，或者其中所述宿主細(xì)胞過表達(dá)至少ー種折疊調(diào)節(jié)因子，或者兩者的組合。
6.權(quán)利要求1-5中任ー項的方法，其中所述重組毒素蛋白為CRM197，并且所述宿主細(xì)胞在 HslU、HslV、Prcl、DegPl、DegP2 和 AprA 的表達(dá)上有缺陷。
7.權(quán)利要求1-6中任ー項的方法，其中所述重組毒素蛋白與分泌前導(dǎo)序列融合，所述分泌前導(dǎo)序列為 Azu、IbpS31A、CupA2、PbpA20V 或 Pbp。
8.權(quán)利要求1-6中任ー項的方法，其中所述重組毒素蛋白為CRM197，而且所述宿主細(xì)胞在沙雷氏菌溶素、HslU、HslV,Prcl、DegPl、DegP2、AprA或它們的任何組合的表達(dá)上有缺陷，或者其中所述宿主細(xì)胞過表達(dá)DsbA、DsbB、DsbC和DsbD，并且進(jìn)一步地其中所述重組毒素蛋白與Azu、Pbp或天然分泌前導(dǎo)序列融合。
9.權(quán)利要求1-8中任ー項的方法，其中所述宿主細(xì)胞過表達(dá)DsbA、DsbB、DsbC和DsbD，并且其中所述重組毒素蛋白與分泌前導(dǎo)序列Azu融合。
10.權(quán)利要求1-8中任ー項的方法,其中所述宿主細(xì)胞在沙雷氏菌溶素的表達(dá)上有缺陷，并且其中所述重組毒素蛋白與分泌前導(dǎo)序列Pbp或Azu融合。
11.權(quán)利要求1-8中任ー項的方法，其中所述宿主細(xì)胞在HslU和HslV的表達(dá)上有缺陷，并且其中所述重組毒素蛋白與分泌前導(dǎo)序列Pbp或Azu融合。
12.權(quán)利要求1-4中任ー項的方法，其中所述重組毒素蛋白為CRM197，所述宿主細(xì)胞為野生型，并且其中所述重組毒素蛋白與分泌前導(dǎo)序列Pbp或Azu融合。
13.權(quán)利要求1-8中任ー項的方法，其中所述重組毒素蛋白為CRM197，并且其中所述重組毒素蛋白與分泌前導(dǎo)序列Azu、Pbp、IbpS31A、CupA2或PbpA20V融合。
14.權(quán)利要求1-5中任ー項的方法，其中所述重組毒素蛋白為霍亂毒素B，并且所述宿主細(xì)胞在Lon、La和AprA的表達(dá)上有缺陷，或者；在HslU、HslV, PrcU DegPU DegP2和AprA的表達(dá)上有缺陷，并且過表達(dá)DegP2S219A。
15.權(quán)利要求1-5中任ー項或14的方法，其中所述宿主細(xì)胞在Lon、La和AprA的表達(dá)上有缺陷，并且其中所述重組毒素蛋白與分泌前導(dǎo)序列Pbp A20V融合,或者；在HslU、HslV, PrcU DegPU DegP2和AprA的表達(dá)上有缺陷，過表達(dá)DegP2 S219A，并且其中所述重組毒素蛋白與分泌前導(dǎo)序列DsbA融合。
16.權(quán)利要求1-5中任ー項的方法，其中所述重組毒素蛋白為百日咳毒素SIE129AR9K，并且所述宿主細(xì)胞在Lon、La和AprA的表達(dá)上有缺陷；過表達(dá)GrpE、DnaK和DnaJ ；在HtpX的表達(dá)上有缺陷；在RXF01590的表達(dá)上有缺陷；或者在ppiB (RXF05345)的表達(dá)上有缺陷。
17.權(quán)利要求1-5中任ー項或16的方法，其中所述重組毒素蛋白與它的天然分泌前導(dǎo)序列融合。
18.權(quán)利要求1-5中任ー項的方法，其中所述重組毒素蛋白為破傷風(fēng)毒素C，并且所述宿主細(xì)胞在Lon、La和AprA的表達(dá)上有缺陷，或者所述宿主細(xì)胞在HslU、HslV、Prcl、DegPl、DegP2和AprA的表達(dá)上有缺陷，或者所述宿主細(xì)胞過表達(dá)dsbAB⑶，或者所述宿主細(xì)胞過表達(dá) GrpE、DnaK 和 DnaJ。
19.權(quán)利要求1-5中任ー項或18的方法，其中所述重組毒素蛋白與分泌前導(dǎo)序列TolB, DsbA, DsbC, Pbp A20V、NikA 或 CupA2 融合。
20.權(quán)利要求1-5中任ー項的方法，其中所述重組毒素蛋白為破傷風(fēng)毒素C，并且所述宿主細(xì)胞在Lon、La和AprA的表達(dá)上有缺陷。
21.權(quán)利要求1-5中任ー項、18或20的方法，其中所述重組毒素蛋白與分泌前導(dǎo)序列DsbA融合。
22.權(quán)利要求1-5中任ー項的方法，其中所述重組毒素蛋白為破傷風(fēng)毒素C，并且所述宿主細(xì)胞在GrpE、DnaK和DnaJ的表達(dá)上有缺陷。
23.權(quán)利要求1-5中任ー項、18、20或22的方法，其中所述重組毒素蛋白與分泌前導(dǎo)序列NikA融合。
24.權(quán)利要求1-5中任ー項的方法，其中所述重組毒素蛋白為艱難梭菌毒素B，并且所述宿主細(xì)胞在HtpX的表達(dá)上有缺陷；在DegPl的表達(dá)上有缺陷；在HslU、HslV, Prcl和Prc2的表達(dá)上有缺陷；在Lon、Ia和DegP2的表達(dá)上有缺陷，或者；所述宿主細(xì)胞在Lon、Prcl、DegP2、AprA的表達(dá)上有缺陷并且過表達(dá)DegP2 S219A。
25.上述權(quán)利要求中任ー項的方法，進(jìn)ー步包括在活性測定中測定所述重組毒素蛋白的活性，其中所生產(chǎn)的可溶性毒素蛋白中約40%至約100%經(jīng)確定具有活性。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述活性測定為免疫學(xué)測定、受體結(jié)合測定或酶測定。
27.上述權(quán)利要求中任ー項的方法，其中所述表達(dá)載體包含可操作地連接到蛋白質(zhì)編碼序列上的Iac衍生啟動子，而且其中所述培養(yǎng)包括用濃度為約0. 02至約I. OmM的IPTG誘導(dǎo)該啟動子，誘導(dǎo)時的細(xì)胞密度為約40-約200吸光度単位(AU)的光密度，培養(yǎng)物的pH為約6至約7. 5，而且生長溫度為約20°C至35°C。
28.上述權(quán)利要求中任ー項的方法，其中所述宿主細(xì)胞是假單胞菌細(xì)胞。
29.上述權(quán)利要求中任ー項的方法，其中所述宿主細(xì)胞是熒光假單胞菌。
30.上述權(quán)利要求中任ー項的方法，其中所述核苷酸序列已為了在假單胞菌宿主細(xì)胞中表達(dá)而進(jìn)行了優(yōu)化。
31.權(quán)利要求28的方法，其中所述核苷酸序列已為了在假單胞菌屬宿主細(xì)胞中表達(dá)而進(jìn)行了優(yōu)化。
32.權(quán)利要求29的方法，其中所述核苷酸序列已為了在熒光假單胞菌宿主細(xì)胞中表達(dá)而進(jìn)行了優(yōu)化。
33.權(quán)利要求1-4或25-32中任ー項的方法，其中所述重組毒素蛋白為百日咳毒素，并且其中所述百日咳毒素為野生型或SI E129A R9K。
34.權(quán)利要求1-4或25-32中任ー項的方法，其中所述重組毒素蛋白為銅綠假單胞菌外毒素A，而且其中所述銅綠假單胞菌外毒素A為野生型、CRM66或rEPA。
35.權(quán)利要求4-34中任ー項的方法，其中所述表達(dá)載體進(jìn)一歩包含鄰近所述分泌信號的編碼序列的標(biāo)簽序列。
36.上述權(quán)利要求中任ー項的方法，其中所述表達(dá)載體進(jìn)一歩包含鄰近所述毒素蛋白的編碼序列的標(biāo)簽序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及在細(xì)菌宿主中生產(chǎn)重組毒素蛋白的領(lǐng)域。本發(fā)明尤其涉及從細(xì)菌宿主中獲得高水平重組CRM 197、白喉毒素、百日咳毒素、破傷風(fēng)類毒素C片段、霍亂毒素B、霍亂全毒素和假單胞菌外毒素A的生產(chǎn)方法。
文檔編號C07K19/00GK102869778SQ201180018149
公開日2013年1月9日 申請日期2011年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月30日
發(fā)明者D·M·雷奧爾阿克, L·丘, H·金, H·W·塔爾伯特 申請人:菲尼克斯公司